啮齿动物视网膜的电穿孔和RNA干扰体内和体外

摘要

综合表达谱的最新进展，如微阵列分析(1,2)基因表达的系列分析（SAGE，参考。三)，已鉴定出大量可能在哺乳动物视网膜发育和疾病中起作用的基因。现在比以往任何时候都更重要的是开发一种快速方便的功能分析方法，特别是在完整组织中的应用体内或体外.

我们以前曾使用基于Moloney鼠白血病病毒（MLV）的逆转录病毒载体将基因传递到发育中的视网膜(4–6). 这种载体可以使病毒转导的基因在视网膜中表达，而无需转基因动物的时间和费用。然而，使用这种载体存在固有的缺点。首先，MLV载体的使用仅限于将基因转移到有丝分裂视网膜祖细胞中，因为它需要目标细胞的增殖才能整合。第二，制备高滴度病毒库以实现高效基因转移需要花费大量时间。第三，MLV载体对插入DNA有大小限制（通常小于7 kb）。第四，这种载体不容易将两个以上的基因导入同一细胞。其中一些问题可以通过使用其他类型的病毒载体来绕过，例如慢病毒(7)和腺相关病毒(8)尽管规模和效率仍然限制了某些应用程序，而且还必须制作病毒库。

为了克服这些问题，我们应用了一种相对较新的技术，将DNA导入新生小鼠和大鼠视网膜，即体内电穿孔，最近已应用于各种动物物种的几种组织（参考文献。9). 将DNA溶液直接注入新生小鼠/大鼠幼鼠的视网膜下间隙，并使用镊子型电极施加电脉冲。这种方法比其他病毒和转基因基因转移方法更快。该方法的基因转导效率也高于MLV病毒载体。我们还应用了电穿孔技术，通过使用微电穿孔室将基因导入视网膜移植体(体外电穿孔）。

在本文中，我们报告了使用这些基因转移方法进行的几种类型的实验。这些包括(我)启动子分析(ii（ii）)使用双顺反子表达载体进行功能增益分析，以及(三)使用基于DNA的RNA干扰（RNAi）载体进行功能丧失分析。

材料和方法

动物。定时怀孕的Sprague–Dawley大鼠和Swiss–Webster小鼠购自Taconic Farms，CD1小鼠购自Charles River育种实验室。本研究中的所有动物实验均获得哈佛大学动物护理和使用委员会的批准。

DNA构建。为了构建pCAG-GFP和pCAG-DsRed，分别从pEGFP-N1（克隆）和pDsRed2-N1（克隆）中切除编码增强型GFP（EGFP）和DsRed2的cDNA，并克隆到pCAGGS中(10)修改了多个克隆站点。为了构建pCMV-GFP、pEF-GFP和pUB-GFP，pCAG-GFP的启动子区域被pEGFP-N1中的巨细胞病毒（CMV）启动子替换，pCE-EGFP-1中的人延伸因子（EF）1α启动子替换(11)，以及从pFUGW中切除的人类泛素C启动子(12)分别是。

为了构建pRho-2.2K-DsRed、pCABP5–4.7K-DsResRed和pCRALBP-4K-Ds红色，pCAG-Ds红色的启动子区域被牛视紫红质启动子（从-2174到+70）、小鼠钙结合蛋白5（CABP5）启动子（由-4534到+148，国家生物技术信息中心位点ID 29865）、，和小鼠细胞视网膜醛结合蛋白（CRALBP）启动子（从-3932到+71，国家生物技术信息中心位点ID 19771）。牛视紫红质启动子从–2174-lacZ结构体中切除(13)用基因组PCR扩增小鼠CABP5和CRALBP启动子。用以下PCR引物扩增启动子：小鼠CABP5启动子、5′-CCCTTGCTAGCACTGAGACCCTTAATACG-3′和5′-CCTGGAATGCACATGC-3′；小鼠CRALBP启动子，5′-TCCCT T TCTCCTATGAGA AGCGGAGGCCCC-3′和5′-CCA AGCTCTGTCA AGATGCCCCCT-3′。通过将pRho-2.2K-DsRed中DsRed2的编码区替换为从pECFP-N1（Clontech）中提取的增强型氰基荧光蛋白（ECFP），构建了pRho-2-2K-CFP。

为了构建pCAGIG，从pMX-IRES-GFP中切除的内部核糖体进入位点（IRES）-GFP盒(14)连接到pCAGGS载体。编码小鼠Rax的cDNA(15)PCR扩增5′和3′UTR，并克隆到pCAGIG中，制备pCAGIG-mRax。通过将退火寡核苷酸插入pBS/U6构建小鼠Crx、Nrl和GAPDH的RNAi载体(16)用…消化阿帕I（钝了）和生态里。寡核苷酸如下：小鼠Crx（编码区408-428），5′-GGCATCTCAGATTCTTACAG公司AAGCTT公司CTGTAAGAATCTGAGATGCCC公司TTTTT G-3′和5′-AATTCAAAAAGGGCATCTCAGATTCTTACAG公司AAGCTT公司CTGTAAGAATCTGAGATCC公司-3′; 小鼠Nrl（306–326），5′-GGTCCTGTCTCTATGAGAGG公司AAGCTT公司CCTTCCATAGACAGGACCC公司TTTTT G-3′和5′-AATTCAAAAAgggtcctgctctatggaaggAAGCTT公司CCTTCCATAGACAGGACC公司-3′; 小鼠GAPDH（393–413），5′-GGTGTAACCACGAAAATA公司AAGCTT公司TATTCTCGTGGTTCACCCC公司TTTTT G-3′和5′-AATTCAAAAAGGGTGTGAACCAGAAATA公司美国航空航天局ATTTCTCGGTTCACC公司-3′.

体内电穿孔和病毒感染。新生大鼠或小白鼠幼崽在冰上冷冻麻醉，并用30号针头在晶状体附近的眼睑和巩膜上做一个小切口。将含有0.1%固绿作为示踪剂的PBS中的DNA溶液（3～6μg/μl）通过切口注入视网膜下间隙，方法是在解剖显微镜下使用带有32或33号钝头针的Hamilton注射器。对于新生大鼠幼鼠，注射≈1μl DNA，对于小鼠新生幼鼠，注入≈0.5μl DNA。DNA注射后，放置短时间浸泡在PBS中的镊子型电极（520型，直径7 mm，BTX，圣地亚哥），轻轻握住幼崽的头部，并使用脉冲发生器CUY21（尼泊尔千叶，日本）或ECM830（BTX）施加5个50 ms持续时间、950 ms间隔的方波。对大鼠新生幼鼠施加100V脉冲，对小鼠新生幼鼠则施加80V脉冲。通常DNA只转染到右眼。

通过转染pLIA产生复制不全逆转录病毒(17)在Phoenix-E包装细胞中浓缩，并在NIH 3T3细胞上滴定。浓缩病毒（1×10⁷菌落形成单位/ml）注射到新生大鼠的视网膜下间隙中，如DNA注射所述。

体外电穿孔和视网膜移植培养。将解剖的视网膜转移到装有DNA溶液（Hanks平衡盐溶液中的1μg/μl）的微电穿孔室（Nepagene，型号CUY532，3 mm×10 mm×5 mm），并使用脉冲发生器CUY21施加5个50 ms持续时间、间隔950 ms的方波（30 V）。电化视网膜在37°C的Nucleopore聚碳酸酯过滤器（Whatman，0.2μm孔径）上与含有1×B-27无血清补充剂（Invitrogen）的神经基底培养基（Invit罗gen）一起培养。

视网膜切片的制备。电穿孔后2-50天采集电穿孔视网膜，并在荧光显微镜（Leica，MZFL III）下解剖，以选择GFP-或DsRed阳性视网膜。在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定20分钟，在含30%蔗糖的PBS中在4°C下冷冻保护数小时，并包埋在干冰上的OCT化合物（Sakura，Torrance，CA）中。冷冻切片（20或30μm）在低温恒温器上切割。

分离视网膜细胞的免疫染色。视网膜基本上按照描述分解成单个细胞(18)，但使用木瓜蛋白酶（沃辛顿，最终50 ng/μl）代替胰蛋白酶，并用以下抗体染色：抗视紫红质（Rho4D2，取自温哥华不列颠哥伦比亚大学R.Molday，参考文献。19)，抗Crx（取自S.Chen，圣路易斯华盛顿大学医学院，参考。20)，anti-Nrl（摘自密歇根大学安娜堡分校A.Swaroop，参考。21)、抗GAPDH（Ambion 4300）、抗Chx10（由我们的实验室开发，未发表的工作）、抗蛋白激酶Cα（癌基因科学OP74）、抗谷氨酰胺合成酶（Chemicon MAB302）、抗HPC-1（圣克鲁斯生物技术sc-12736）、抗Calbindin（Sigma C9848）、抗Gt2α（圣克鲁兹生物技术sc-390）、，和抗Thy-1（圣克鲁斯生物技术sc-19614）。

结果

体内电穿孔。将DNA构建物注射到新生小鼠或大鼠幼崽的视网膜下间隙（详细方案见图8，该图作为PNAS网站上的支持信息发布）。然后将镊子型电极放置在幼崽的头部，并按照图8所示的方向向眼睛施加五个50毫秒的电脉冲（大鼠为100伏，小鼠为80伏）A类使用方波电穿孔器。DNA被转导到视网膜的巩膜侧，在那里存在未着色的有丝分裂细胞和新的有丝后细胞。几乎所有操作过的幼崽都存活下来，并且在电穿孔后明显健康。当GFP表达载体由CAG（带有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子）驱动时，参考。10)启动子是一种普遍存在的强启动子，在出生后第0天电穿孔到视网膜（P0），平均约80%的大鼠视网膜和约50%的小鼠视网膜表达GFP。在良好的转染中，GFP在视网膜的大面积表达(图1A类).

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图1。

体内在不同发育阶段收获的电穿孔大鼠视网膜。(A类)大鼠视网膜的整体制备体内P0时用pCAG-GFP电穿孔，P21时收获。照片取自巩膜侧。(B类)大鼠视网膜体内在P0用pCAG-GFP电穿孔，在P2收获(d日–（f）)，第5页(克–我)，第8页(j个–我)，第14页(米–o个)，或P50(第页–第页)，并制备冷冻切片。

在P0处转染的GFP表达载体可以清楚地显示整个发育过程中视网膜细胞的形态(图1B类). P2时，在心室区（VZ）的视网膜前体细胞中检测到GFP(图1B天–（f）). 在P5，GFP在两个不同的细胞群中观察到，一个形成未来的外核层（ONL），另一个形成内核层（INL），被视为开始在前VZ区分离(图1B克–我). 在P8，GFP标记ONL中的未成熟杆状光感受器（PRs）和未成熟双极细胞，分化Müller胶质细胞和/或祖细胞，其胞体位于INL中(图1Bj公司–我). 在P14，大多数GFP阳性细胞分化为位于ONL的杆状PR，其余细胞分化为双极细胞和Müller胶质细胞(图1亿–o个). GFP也清楚地标记了棒外段（OS）。在检查的最后一个时间点观察到GFP的表达（P50，图1B点–爱尔兰). 然而，电穿孔后3-4周，GFP表达水平逐渐下降。

在P14分化的大鼠视网膜中导入DNA后，检测GFP阳性细胞在视网膜中的分布(图2). 根据细胞形态和位置判断，约80%的GFP阳性细胞为杆状PRs，约15%为双极细胞，约3%为Müller胶质细胞，<1%为无长突细胞(图2A类). 这些数值与携带碱性磷酸酶报告基因的复制不全MLV逆转录病毒（LIA）感染的视网膜细胞的数值大体相当(图2A类紫色条）。用几种视网膜细胞类型特异性抗体染色分离的视网膜细胞，进一步证实了这一结果。大约75%的GFP阳性细胞表达视紫红质（杆的标记），≈20%表达Chx10（双极性的标记）、≈4%表达谷氨酰胺合成酶（米勒胶质细胞的标记）和<1%表达HPC1（无长突的标记）(图2B类). 极少数GFP阳性（<1%）细胞对Gt2α（锥体标记物）呈阳性，但我们无法检测到表达calbindin（水平标记物）或Thy-1（神经节细胞标记物）的GFP阳性细胞。

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图2。

视网膜细胞的细胞类型组成体内电穿孔。(A类)根据视网膜的形态和位置确定细胞类型组成。电穿孔大鼠视网膜体内患有pCAG-GFP或感染体内在P0处具有复制无能的LIA逆转录病毒的细胞在P14处收获并切片。对表达碱性磷酸酶（AP）的LIA感染视网膜进行组织化学染色以检测AP活性。绿色条表示用pCAG-GFP质粒电穿孔的视网膜细胞。紫色条表示感染LIA逆转录病毒的视网膜细胞。(B类)通过免疫染色确定细胞类型组成。电穿孔大鼠视网膜体内用pCAG-GFP在P0处收获并在P14处分离成单个细胞。分离的细胞用抗视紫红质（杆PR）、抗Chx10（双极）、抗蛋白激酶Cα（杆双极性）、抗谷氨酰胺合成酶（Müller glia）、抗HPC-1（无长突）、抗钙结合蛋白（水平）、抗Gt2α（锥PR）或抗Thy-1（GC）染色，并对阳性细胞数进行评分。对GFP阳性（绿色条）和GFP阴性（黄色条）细胞进行分析。

包括CMV在内的几个普遍存在的推广者(22)，人EF1α(11)和人类泛素C(23)在发育中的大鼠视网膜中也检测了启动子。EF1α和泛素C启动子表现出比CMV或CAG更高的GFP表达。当在P10处切片时，CMV和EF1α启动子似乎标记了细胞体位于INL中的细胞，其突起延伸至ONL和神经节细胞（GC）层（GCL），多于ONL中的突起，这表明相对缺乏活性，可能是由于PRs中这两个启动子的沉默所致(图3B类和C类). 泛素C启动子驱动的GFP表达模式类似于CAG启动子(图3D类)和泛素启动子标记的细胞类型组成，通过分离细胞的免疫染色测定，与CAG启动子的细胞类型构成相当（数据未显示）。这些结果表明，当需要标记PRs时，一些“普遍存在”的启动子不适合用于哺乳动物视网膜发育的研究。

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图3。

发育中大鼠视网膜中普遍存在的启动子的比较。电穿孔大鼠视网膜体内在P0处，由CAG启动子驱动的GFP表达载体(A类)，CMV启动子(B类)，人EF1α启动子(C类)或人类泛素C启动子(D类)并在P10处剖切。

体外电穿孔。将GFP表达载体（pCAG-GFP）注射到P0大鼠眼睛的玻璃体中，并向与玻璃体表面对视网膜表面的方向相反的方向施加电脉冲，以标记GCs图1然而，很少检测到GFP阳性细胞（数据未显示），这表明与VZ中的祖细胞不同，GC不是高度可转染的。为了进一步测试这种可能性，DNA被电穿孔到CD1小鼠视网膜体外从巩膜侧或玻璃体侧，使用微腔（如图8所示C类). 大量视网膜细胞（占总细胞的5-20%）呈GFP阳性(图4Aa公司)当从巩膜侧电穿孔时，其分布是分段的(图4B类)类似于体内电穿孔视网膜(图1). 相反，当载体从玻璃体侧转染时，只有少数细胞呈GFP阳性(图4抗体). 当泛素C启动子用于表达GFP时，也观察到类似的结果（数据未显示）。

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图4。

体外电穿孔小鼠视网膜外植体。(A类)P0 CD1小鼠视网膜(一和b条)，成人CD1(c（c）和d日)或成年瑞士人——韦伯斯特患有视网膜变性突变(e（电子）和（f）)是体外从巩膜侧用pCAG-GFP电穿孔(一,c（c）、和e（电子）)或者从玻璃体一侧(b条,d日、和（f）)培养5天。电穿孔后16小时观察到类似结果。(B类)CD1小鼠视网膜切片体外在P0处用pCAG-GFP电穿孔并培养10天。

使用体外电穿孔技术，我们检测了DNA是否可以电穿孔到成年小鼠视网膜。在成年CD1小鼠的正常视网膜中，即使从巩膜侧转染载体，也很少观察到GFP阳性细胞(图4交流电). DNA也没有从玻璃体侧有效转染(图4广告). 有趣的是，当从巩膜侧转染具有视网膜变性突变的成年瑞士-韦伯斯特小鼠视网膜时，检测到许多GFP阳性细胞(图4Ae公司). 抗谷氨酰胺合成酶抗体免疫染色显示，GFP阳性细胞大多为Müller胶质细胞（数据未显示）。这些结果表明，通过电穿孔将DNA转染到成熟的杆状PR和GC中并不容易。

促销员分析。一个应用程序体内电穿孔是转录调控元件的映射，这些转录调控元件可能受到病毒元件的影响，并且经常需要大于病毒载体的允许值。为了评估这种应用，我们选择了一个有特征的和两个无特征的调节区域。牛视紫红质启动子的2.2-kDa片段（从-2174到+70）已被证明可在转基因小鼠中直接表达PR特异性(13). 将表达DsRed的牛视紫红质2.2-kDa启动子与pCAG-GFP共转染到P0大鼠视网膜。如所示图5A类在P5，DsRed的表达仅在位于VZ上部的少量细胞中检测到(图5A和A–c（c）). P8时，仅在ONL中检测到DsRed的表达，并且ONL中的大多数GFP阳性细胞与Ds Red共存(图5美国–（f）). 在P14，DsRed在ONL中的表达增强(图5A克–我)，与视紫红质表达谱一致(三,13).

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图5。

使用视紫红质、CABP5和CRALBP启动子进行细胞类型特异性标记。(A类)大鼠视网膜共电穿孔体内pCAG-GFP（3μg/μl）和牛视紫红质启动子2.2K-DsRed(一–c（c）)，第8页(d日–（f）)，或P14(克–我)和分段。(B类)大鼠视网膜共电穿孔体内在P0处用pRho-2.2K-CFP（3μg/μl）和小鼠CABP5启动子4.7K-DsRed（pCABP5-4.7K-Ds Red，3μg/ml），在P14处收获并切片。(C类)大鼠视网膜共电穿孔体内在P0处用pCAG-GFP（3μg/μl）和小鼠CRALBP启动子4.0K-DsRed（pCRALBP-4.0K-Ds红色，3μg/ml），在P10处收获并切片。一些DsRed阳性的Müller胶质细胞在切片过程中被截断。

为了确定该技术是否可以标记其他视网膜细胞类型，我们测试了小鼠CABP5启动子区的一个无特征序列（从-4534到+148）和CRALBP的一个部分特征启动子序列（从-3932到+71，参考文献。24)通过基因组PCR获得。CABP5由杆状双极细胞和锥形双极细胞的子集表达(25,26)而CRALBP由Müller胶质细胞表达。CABP5启动子仅在INL的细胞中导致DsRed的表达，这与双极细胞的标记一致(图5B类). 另一方面，CRALBP启动子仅在Müller胶质细胞中导致DsRed的表达(图5C类).

函数增益分析。使用包含CAG启动子和IRES-GFP盒（pCAGIG，图6A类)，我们测试了电穿孔技术是否适用于候选基因的功能分析。我们专注于同源盒转录因子Rax(15)[也称为Rx(27)]其功能已在发育中的大鼠视网膜中用复制不全逆转录病毒载体表征(28). Rax是通过增殖视网膜前体细胞和分化Müller胶质细胞来表达的，使用MLV载体在P0大鼠视网膜中强制表达Rax，导致产生类似Müler胶质细胞的细胞(28).

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图6。

使用IRES-GFP载体异位表达Rax。(A类)pCAGIG和pCAGIG-mRax载体的结构。(B类)大鼠视网膜体内用pCAGIG电穿孔(一和b条)或pCAGIG-mRax(c（c）和d日)在P0时，在P21处收获并切片。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。

当用pCAGIG mRax表达载体电穿孔的P0大鼠视网膜在P21进行分析时，几乎所有的GFP阳性细胞都在INL中具有细胞体，其过程延伸到外界膜和/或GCL(图6B c类和d日). 这种形态是分化Müller胶质细胞或视网膜前体细胞的特征，证实了以前用逆转录病毒载体获得的结果(28). 相反，在转染pCAGIG空载体的大鼠视网膜中，大多数GFP阳性细胞为ONL中的杆状PRs，少数细胞为双极性和Müller胶质细胞(图6B类).

功能损失分析。最近，一些研究小组开发了基于DNA的RNAi载体，可在哺乳动物细胞中稳定产生双链小干扰RNA(16,29–34). 使用这种RNAi载体，我们测试了体内电穿孔技术将有助于视网膜功能丧失的分析。在这个实验中，我们选择了两种视网膜转录因子，Crx(35–37)和Nrl(38)，因为它们的功能丧失表型是通过对传统敲除（KO）小鼠的研究已知的(39,40). 这两种突变小鼠的视网膜细胞类型都正常，而非PR。Crx KO小鼠最初的PR水平接近正常，但缺乏OS，而Nrl KO小鼠缺乏杆状体，锥体数量超过正常值，但OS异常。据报道，这两种突变小鼠的许多杆蛋白特异性基因（包括视紫红质）显著减少。

基于小鼠Crx和Nrl核苷酸序列设计了几个RNAi载体。我们希望有一种靶向视网膜RNA的RNAi载体作为对照，而不是一种无效的双链RNA，以防成功的靶向载体会引发细胞反应，从而非特定地改变PR的发展。为此，设计了一种抑制小鼠GAPDH表达的对照RNAi载体。我们发现，产生与mCrx（408–428）、mNrl（306–326）和mGAPDH（393–413）编码区相对应的双链RNA的载体分别有效且选择性地抑制了mCrx:GFP、mNr:GFP和mGAPD H:GFP融合蛋白的表达，293T细胞（图9，作为PNAS网站上的支持信息发布）。

为了确定这些RNAi载体是否能在视网膜中起作用，对它们进行了共电穿孔体内P0时pCAG-GFP进入CD1小鼠视网膜。当电穿孔视网膜在P10处分离为单个细胞并用抗体染色时，转染Crx-、Nrl-和GAPDH-RNAi载体（U6-Crx、U6-Nrl和U6-GAPDH）的视网膜中GFP-阳性部分的Crx-，Nrl-，和GAPDH阳性细胞的数量分别显著和特异性地减少(图7A类). 在转染U6-Crx和U6-Nrl的视网膜中，视紫红质阳性细胞的数量也显著减少。空的RNAi载体（U6）没有明显的效果。

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图7。

使用RNAi载体敲除小鼠视网膜中Crx和Nrl的表达。(A类)RNAi载体转染小鼠视网膜中Crx、Nrl、GAPDH和视紫红质表达的特异性下调。CD1小鼠视网膜共电穿孔体内pCAG-GFP（2μg/μl）和RNAi载体（U6、U6-Crx、U6-Nrl或U6-GAPDH；4μg/微升）在P0，在P10收获，并分离成单个细胞。用抗Crx、抗Nrl、抗GAPDH或抗视紫红质抗体对分离的细胞进行染色，并对阳性细胞数进行评分。对GFP阳性（绿色条）和GFP阴性（黄色条）细胞进行分析。(B类)转染RNAi载体的视网膜细胞的形态学。CD1小鼠视网膜共电穿孔体内pCAG-GFP和P0处的RNAi载体，在P20处采集并切片。切片用抗视紫红质抗体（红色）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色）染色，并用共焦显微镜（Zeiss LSM 510）拍摄图像。(插图)操作系统的高倍视图。（放大倍率：×800。）

当在P20下分析电穿孔视网膜的切片时，在用U6-empty、U6-Crx、U6-Nrl和U6-GAPDH载体转染的视网膜中，ONL中GFP阳性细胞与INL中GFP阳性细胞的比率几乎相当(图7B类). 然而，在U6-Crx和U6-Nrl转染的视网膜中，ONL中大多数GFP阳性细胞没有明确的OS结构(图7B B类和c（c）)，与基因敲除小鼠的报告表型一致。此外，在U6-Nrl转染的视网膜中，ONL中大多数GFP阳性细胞的细胞核都位于外界膜的正下方，锥体PR也是如此。在Crx-RNAi载体转染的视网膜中也观察到类似的趋势，尽管没有那么显著。在U6-empty或U6-GAPDH载体转染的视网膜中，ONL中的GFP阳性细胞具有清晰的OSs(图7B和a和d日).

讨论

我们证明，通过电穿孔，DNA可以很容易地导入新生小鼠和大鼠的视网膜细胞体内和体外试验。体内电穿孔已应用于各种动物的各种组织，包括小鼠、鸡和青蛙(9). 对于哺乳动物的中枢神经系统，这项技术已被用于将基因导入小鼠胎脑，靶向VZ中的神经前体细胞(41–43). 它也被用于视网膜，因为Dezawa等。(44)最近报道了从玻璃体将DNA导入成年大鼠视网膜GC的研究。然而，至少在我们的实验中，当GFP表达载体注射到新生大鼠的玻璃体中，然后进行电穿孔时，我们只能看到少数GFP阳性细胞。此外，当载体电穿孔到新生和成年小鼠视网膜的玻璃体侧时，我们可以检测到少量GFP阳性细胞体外很可能玻璃体侧的电穿孔效率较低，需要进一步改进转染条件。内界膜上基底层的存在可能会阻碍载体的渗透。尽管如此，这对于将基因引入GC来说也是一种非常有用的技术，因为GC很难用其他方法进行转导。

与传统方法相比，这里描述的电穿孔技术具有几个优点，可以将基因传递到啮齿动物视网膜。首先，该方法快速、安全。第二，当准确地注射DNA时，DNA转导效率可以显著提高。第三，引入不同类型的DNA构建体是可能的，其大小限制远远大于病毒载体的大小限制。这些结构包括用于表达报告基因的细胞类型特异性启动子以及最近开发的基于DNA的RNAi载体。第四，可以将多个DNA构建物引入单个视网膜细胞。最近，有报道称，多种转录因子的组合，而不是单一的转录因子，对视网膜细胞类型的鉴定很重要(45,46). 例如，Math1或Math3与Chx10的共表达可有效诱导视网膜外植体中的杆双极细胞发生，而Math1/Math3或Chx10单独的错误表达则不能(45). 因此，第四点将特别有助于分析视网膜转录因子的功能。

与整合到宿主基因组并长时间稳定表达外源基因的逆转录病毒载体不同体内电穿孔不应该如此稳定。虽然我们没有确切地确定导入的基因在视网膜中的表达时间，但该基因的表达不太可能持续数月以上。因此，体内电穿孔可能不适合用于治疗用途，例如遗传性视网膜疾病的基因治疗。尽管如此，我们确实发现GFP的表达至少在50天内可见，足以用于视网膜发育的研究，包括分化视网膜细胞的成熟（例如，杆OS的伸长）。

最近，我们通过基因表达的微阵列分析和序列分析（SAGE）确定了大量与视网膜发育和疾病有关的候选基因(1,三). 这个体内和体外电穿孔技术和传统的病毒介导的基因转移系统将大大有助于阐明这些候选基因的功能。

补充材料

致谢

笔记

这篇文章是2002年4月30日当选的国家科学院院士发表的特别系列就职文章的一部分。

缩写：MLV、Moloney鼠白血病病毒；CABP5，钙结合蛋白5；细胞视网膜醛结合蛋白CRALBP；GC，神经节细胞；GCL、GC层；INL，内核层；ONL，外核层；OS，外段；VZ，心室区；PR，光感受器；RNA干扰；巨细胞病毒；P（P）n个，出生后第天n个; EF，伸长率；IRES，内部核糖体进入位点。

参见第页随附的传记14.

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