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摩尔癌症治疗。作者手稿；PMC 2012年7月1日发布。
以最终编辑形式发布为：
摩尔癌症治疗。2011年7月；10(7): 1185–1193.
2011年5月13日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1535-7163.MCT-11-0061
PMCID公司：PMC3140695型
尼姆斯：美国国家卫生研究院295925
PMID：21571912

人前列腺癌细胞和肿瘤对PARP抑制与电离辐射联合作用的反应

胡安·卡米洛·巴雷托·安德拉德,1,2 埃琳娜·埃菲莫娃,2 海伦娜·莫切里,2 迈克尔·A·贝克特,2 哈罗德·萨顿,2,三 托马斯·达加,2 埃弗雷特·沃克斯,4 Mitchell C.波斯纳,1 斯蒂芬·克伦,2,5和拉尔夫·魏希塞尔鲍姆（Ralph R.Weichselbaum）2,三
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

放射治疗仍然是治疗局限性前列腺癌的一种有希望的方法，但剂量限制性毒性严重限制了其疗效。在较低辐射剂量下增强疗效的药物在不损害器官功能的情况下提高肿瘤控制方面可能具有相当大的价值。在这里，我们测试了PARP抑制剂ABT-888（veliparib）可以增强前列腺癌细胞和肿瘤对电离辐射（IR）的反应这一假设。在将DU-145和PC-3前列腺癌细胞系暴露于10μM ABT-888和6 Gy的组合中后，我们观察到DNA损伤灶和在体外放射增敏。我们之前已经观察到，ABT-888加IR后形成的持续DNA损伤灶有效地促进了细胞衰老的加速，但只有PC-3细胞表现出预期的衰老反应，即G2/M阻滞、p21和β-半乳糖苷酶表达的诱导，以及作为大而平的细胞的积累。反过来，与仅在PC-3异种移植瘤中单独使用两种药物相比，ABT-888与6Gy联合使用导致肿瘤再生延迟，而DU-145肿瘤继续生长。在用ABT-888+IR治疗后7天，PC-3肿瘤含有丰富的衰老细胞，显示出持续的DNA损伤灶，但在DU-145肿瘤中没有发现衰老迹象。ABT-888+IR的等效放射增敏在体外无法预测与肿瘤的可比结果体内提示PARP抑制剂的疗效可能部分取决于对累积DNA损伤的有效衰老反应。

关键词：前列腺癌、PARP、放射、衰老、PTEN

简介

目前治疗局限性前列腺癌的方法是放射治疗或手术。两者在低风险和中等风险患者中的生存结果相似。现代放射治疗方法，如调强放射治疗（IMRT），可以增加前列腺的放射量，同时保护邻近器官，降低急性和慢性毒性的可能性。然而，直肠炎、膀胱炎和勃起功能障碍仍是高剂量放疗的重要并发症。反过来，中高危患者放疗后的局部失败率仍为20-35%(1,2)导致转移增加和生存率降低。激素治疗与局部放射治疗相结合对中高危前列腺癌患者有价值，但也有其自身的发病率，包括增加心血管和血栓栓塞风险(三,4). 具有更具吸引力的副作用特征的新型药物，可与放射治疗相结合，以改善高危患者的局部控制和/或降低低危患者的剂量，将具有巨大价值。

一种新出现的提高低红外剂量疗效的策略是使用放射增敏剂识别靶点并修复DNA损伤(5). 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一个使用NAD的酶家族+作为底物将PAR聚合到细胞靶上(6). PARP1和PARP2同工酶被DNA损伤激活，并通过激活XRCC1和碱基切割修复（BER）参与单链断裂（SSB）的修复，以及可能通过影响同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）机制参与双链断裂（DSB）。DSB后，PARP被迅速招募，并触发PARP本身、组蛋白和其他介体蛋白的多聚腺苷核糖基化，以刺激染色质松动和DNA修复。PARP长期以来被认为是一个有希望的治疗靶点，一些小分子PARP1和PARP2抑制剂目前正在进行临床前和临床试验，单独或与DNA损伤剂联合使用(7,8). 已经观察到PARP被电离辐射（IR）和化疗药物激活，这为研究PARP抑制剂和基因毒性疗法在肿瘤模型和临床试验中的联合作用提供了理论依据(9–11). 最近的研究结果证实了PARP抑制剂通过“合成致死性”靶向特定基因型癌症的能力(12–15)其中，PARP抑制通过抑制代偿途径NHEJ暴露了对DNA修复途径（如HR）中缺陷造成的DNA损伤的耐受性不足。一个具体的例子是BRCA突变癌细胞对PARP抑制的敏感性，导致选择性肿瘤细胞毒性(16,17). BRCA1和BRCA2突变不被认为是家族性或散发性前列腺癌的主要原因。然而，其他一些减少HR修复反应的突变也可以使细胞对PARP抑制剂敏感，包括肌醇磷酸酶PTEN的缺陷，PTEN是前列腺癌中常见的失活基因(18). 低氧条件下HR通路的下调也会导致对PARP抑制的敏感性，这种效应被称为“上下文合成致死”(19). DNA DSB修复缺陷的细胞被PARP抑制剂致敏于DNA损伤剂(20). 也许PARP介导了所有这些效应，可能会持续招募到HR缺陷细胞的持续损伤中，导致其被聚ADP-核糖修饰并部分失活(21).

尽管如此，PARP抑制剂介导其有益作用的机制体内仍然定义不清。我们之前的研究表明，IR和PARP抑制剂ABT-888（veliparib；2-[（R）-2-甲基吡咯烷-2-基]-1H-苯并咪唑-4-甲酰胺）联合使用可增加乳腺癌细胞衰老在体外和体内意味着持续的DNA损伤是一种机制(22). 衰老是一种重要的肿瘤抑制机制(23–25). 衰老、复制性衰老的细胞等效物是对端粒侵蚀的DNA损伤检查点反应，端粒侵蚀由p53/p21和/或p16/ARF/Rb通路的激活介导，其特征是不可逆的细胞周期阻滞而非细胞死亡(26–28). 应激诱导的过早衰老或加速衰老是由于癌基因激活、氧化应激、过多的有丝分裂信号、染色质扰动或未修复DNA损伤的积累，导致具有无限增殖能力的细胞中类似的持续细胞周期阻滞(25,29–31). 目前的数据表明，持续DNA断裂位点的修饰染色质焦点在促进衰老停滞的信号传递中发挥作用(31,32). 癌症中常见的p53和/或Rb肿瘤抑制途径的缺陷可能通过阻断衰老信号同时促进细胞增殖和存活，使肿瘤细胞保持基因组不稳定并耐受持续的DNA损伤。

γH2AX和53BP1定位于IR诱导的病灶（IRIF）可以作为未修复DSB和DNA损伤反应的替代物(33,34). 在此，我们利用融合到53BP1染色质结合域的绿色荧光蛋白（GFP）作为活细胞报告物，并对IRIF标记物γH2AX和内源性53BP1进行荧光免疫细胞化学，监测PARP抑制对受照前列腺癌细胞和肿瘤异种移植物的影响。我们假设使用ABT-888抑制PARP将增强辐射对人前列腺癌细胞的抗肿瘤作用在体外在小鼠实验性前列腺癌肿瘤中。令人惊讶的是，尽管PARP抑制介导了两种肿瘤细胞系的放射敏感性在体外，只有PC-3表现出显著的肿瘤消退体内。我们的结果表明在体外放射敏感性分析可能无法预测体内PARP抑制剂对辐射的疗效以及诱导衰老可能是PARP诱导放射敏感性的重要机制体内.

材料和方法

细胞培养和构建

使用两种人类雄激素无反应前列腺癌细胞系：PTEN阴性的PC-3、p53-null和DU-145、PTEN野生型、p53突变(35). 这两种细胞系均购自美国型培养物收集中心（ATCC）。2011年2月，使用Identifiler试剂盒（Applied Biosystems）在约翰霍普金斯大学进行了短串联重复序列（STR）分析，并将其与已知的图谱（ATCC STR图谱数据库和NCI-60细胞系面板，参考。36).

为了检测PARP抑制对活细胞中IRIF持续性的影响，我们利用我们之前描述的IRIF报告子，该报告子由融合到53BP1 IRIF结合域的GFP组成，在四环素诱导的对照下表达（GFP-IBD，参考。22). 使用FuGENE HD转染试剂（Roche）将克隆到pLVX-Tight-Puro载体（Clontech）中的GFP-IBD与pLVX-Tet-On Advanced（vector）一起转染到PC-3细胞系。在G418和嘌呤霉素筛选后，在DMEM/F12培养基（Invitrogen）和10%Tet系统批准的胎牛血清（Clontech）中培养的细胞用1μg/ml多西环素诱导并分选，以建立PC-3 GFP-IBD细胞系。

免疫荧光

使用的抗体为1:500稀释的兔抗磷酸-H2AX Ser139（γH2AX，细胞信号技术）和1:500稀释后的兔抗53BP1（Novus Biologicals），由1:1000稀释的德克萨斯红抗兔IgG（Vector Laboratories）检测。细胞在盖玻片中生长，处理后用PBS冲洗并用4%多聚甲醛在4°C下固定30分钟。用0.3%Triton X-100进行渗透，用5%牛血清白蛋白在PBST中封闭30分钟。在室温下用一级抗体孵育1小时。用PBS洗涤后，在室温下用第二抗体在黑暗中孵育1小时。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染盖玻片，并使用ProLong Gold抗褪色试剂（Invitrogen）固定。收集的肿瘤在10%福尔马林中固定48小时，并包埋在石蜡中。4μm切片脱蜡，然后使用相同的方案进行染色。使用哈马松ORCA ER数码相机和Improvision OpenLab软件，在蔡司Axiover 200M外荧光显微镜上用63X PlanApo 1.4 NA物镜拍摄图像。

克隆原性测定

将500个细胞接种在p100平板中形成菌落，第二天单独用6 Gy处理，或用10μM ABT-888处理，30分钟后再用6 Gy。当有足够大的菌落至少50个细胞可见时（PC-3和DU-145细胞分别在1周和2周后），用甲醇固定平板并用结晶紫染色。计数含有50个以上细胞的菌落。

细胞死亡和细胞周期分析

为了进行细胞死亡分析，在治疗后48小时收集细胞并用碘化丙啶（PI）染色。为了进行细胞周期分析，将细胞固定在冰冷的甲醇中，同时摇晃以避免凝集，并将其重新悬浮在PBS、RNAse和PI中。染色细胞在LSR-II流式细胞仪（Becton Dickinson）中进行分析。使用细胞周期平台在FlowJo（Becton Dickinson）上分析数据，并通过拟合Watson Pragmatic模型计算G1、S和G2/M分数。

qPCR基因表达分析

使用Trizol（Invitrogen）分离总RNA，并使用QuBit平台（Invit罗gen）进行量化。按照制造商的方案，使用扩增级DNAseI（Invitrogen）对850 ng总RNA进行DNAse I消化。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）在20μl反应体积中对550 ng DNAsed RNA进行cDNA合成，随后以1:10稀释用于qRT-PCR。qRT-PCR在384孔板中的ABI7900HT上进行，反应体积为5μl，包含2.5μl 2x Power SYBR主混合物（Applied Biosystems）、0.5μl 10μM引物混合物和2μl稀释的cDNA。GAPDH被用作内源性控制，并使用比较ct方法进行褶皱变化计算。引物序列如下：

  • CDKN1A（第21页）-f:GCGAGGCGGGATGTGG
  • CDKN1A（第21页）-r:CAGCCGTTTGGAGTGGT
  • GAPDH-f:CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC
  • GAPDH-r:GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA

衰老相关β半乳糖苷酶（SAβ-Gal）染色

如前所述进行SAβ-Gal分析(37). 图像是在由OpenLab软件控制的蔡司Axiover 200M和蔡司Exiocam彩色数码相机上拍摄的，相机的物镜为20倍。

异种移植瘤

雌性裸鼠皮下注射1×107100μl PBS中的PC-3或DU-145细胞。一旦肿瘤生长到100 mm三小鼠在IR前48小时和IR后48小时口服0或6 Gy剂量且不含ABT-888或25 mg/kg ABT-888。

结果

抑制PARP在PC-3细胞中诱导DSB病灶，无需额外的基因毒性治疗

为了研究PARP抑制剂ABT-888和辐射对前列腺癌细胞系的分子效应，我们首先研究了它们对PC-3和DU-145细胞DNA损伤灶形成的影响。我们最初监测了ABT-888单独对表达GFP-IBD（PC-3 GFP-IBD）的PC-3细胞的影响。未照射的PC-3细胞表现为泛核GFP-IBD，无核病灶或散在核病灶。向培养基中添加10μM ABT-888导致GFP-IBD报告者重新定位到核病灶，2小时后发现，24小时后仍未解决。这些病灶已被证明是未修复的内源性DNA损伤的累积(38)在没有遗传毒性暴露的情况下形成(图1a). γH2AX和内源性53BP1免疫荧光证实PC-3细胞DNA损伤灶的形成(图1b). 相比之下，用10μM ABT-888单独治疗后，DU-145细胞未显示GFP-IBD核病灶增加，免疫荧光仅显示相同标记物的泛核荧光或散在病灶(图1b).

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（a）PC-3 GFP-IBD细胞在IR处理前显示泛核荧光，但在照射后2 h显示电离辐射诱导灶（IRIF），24 h后部分溶解。PARP抑制剂ABT-888可自行诱导DNA损伤灶。在IR中添加ABT-888显著增加了IRIF在24小时Bar，10μm条件下的持久性。（b）经ABT-888±IR处理后的PC-3和DU-145细胞的免疫荧光染色。两种细胞株在未经ABT-88或IR处理的情况下均显示少量γH2AX和53BP1病灶。6 Gy在2小时时在每个细胞系中诱导了相似数量的γH2AX和53BP1病灶，24小时后部分溶解。正如GFP-IBD所观察到的那样，ABT-888单独诱导PC-3细胞中的γH2AX53BP1灶，而DU-145细胞没有类似的作用。将ABT-888添加到IR中可增加两种细胞系24小时的γH2AX和53BP1病灶持续性。棒材，10μm。

PARP抑制增加了IR诱导的PC-3和DU-145细胞DNA损伤灶的持续性

在单独使用ABT-888治疗后，我们探索了其与IR联合治疗的效果。6 Gy后PC-3细胞中快速形成核GFP-IBD病灶，在2 h时显著，但在接下来的24 h内逐渐消失(图1a). IR和ABT-888联合使用可显著降低GFP-IBD病灶24小时以上的分辨率(图1a). 单独或与ABT-888联合用药6Gy后PC-3细胞γH2AX和内源性53BP1的免疫荧光染色显示，核病灶的模式和动力学相似(图1b). ABT-888诱导了持续性病灶，仅IR在2小时内诱导了核病灶，24小时后大部分消散，而ABT-888~6 Gy的IR在24小时后阻止了病灶消散。如在PC-3细胞中观察到的，用6 Gy处理的DU-145细胞在2小时时显示出γH2AX和53BP1病灶，部分消散24小时，当6 Gy与10μM ABT-888联合使用时，病灶持续存在。我们得出结论，DU-145细胞对仅通过抑制PARP诱导DNA损伤灶不敏感，但在IR后能够形成病灶，并在与6Gy和ABT-888联合治疗后显示病灶持续存在。

抑制PARP增强IR治疗PC-3和DU-145前列腺癌细胞的效果在体外

为了确定对细胞存活的影响，分别用ABT-888和IR单独或联合治疗后的PC-3和DU-145细胞进行克隆形成分析。10μM ABT-888单独使用可显著抑制PC-3细胞的集落形成（对照组为100±5%，ABT-888为77±6%；P（P）= 0.006,t吨试验），但在DU-145细胞中未观察到显著影响（对照组为100±11%，而ABT-888为90±10%；P（P）= 0.37,t吨测试，图2a). 然而，与单独使用IR相比，10μM ABT-888与IR联合使用可减少两种细胞系中的集落形成。在PC-3细胞中，从1 Gy开始，差异显著（IR单独为89±10%，IR+ABT-888为44±3%；P（P）= 0.002,t吨试验），在每种高达6 Gy的红外剂量下具有类似的折叠效应(图2b). 在DU-145细胞中，存活分数开始与2Gy不同（IR单独为58±4%，IR+ABT-888为47±4%；P（P）= 0.038,t吨测试，图2b).

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（a）ABT-888单独处理对PC-3和DU-145细胞系集落形成的影响。仅在PC-3细胞中观察到明显的生长抑制。（b）PC-3和DU-145细胞经0到6 Gy的IR剂量，加或不加10μM ABT-888处理后的克隆形成存活率。尽管PARP抑制剂使两种细胞系都对辐射敏感，但这种作用在PC-3细胞中更为显著。横杆，SD。

我们利用通透性、碘化丙啶染色和流式细胞术研究了PARP抑制和IR对治疗后48小时细胞周期动力学的影响。与单独添加ABT-888后IRIF的形成一致，PC-3细胞向G2/M DNA含量方向移动，而DU-145细胞的细胞周期分布没有明显变化(图3). IR处理增加了每个细胞系中G2/M DNA含量的细胞比例。ABT-888增强了这种作用，PC-3细胞显示出比DU-145细胞更大的G2/M位移。

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ABT-888和IR单独或联合治疗后PC-3和DU-145细胞的细胞周期分析。ABT-888±IR处理48 h后进行碘化丙锭流式细胞术，用FlowJo模拟细胞周期统计。在10μM ABT-888中培养48 h后，PC-3细胞中的G2/M分数增加，但对DU-145细胞没有影响。6Gy照射降低了两种细胞系的S期，增加了G2/M比例。ABT-888增强了这一效果。ABT-888和IR对PC-3细胞的联合作用也显著耗尽了群体中的G1期细胞，表明G2细胞周期停滞。

PARP抑制与IR联合诱导PC-3细胞衰老

DNA损伤灶的持续存在和G2/M移位导致我们研究了ABT-888和IR治疗的细胞后果。通过分析未渗透细胞对碘化丙啶的摄取，在任何治疗组合后的短时间内，两种细胞系的细胞死亡没有差异；两种细胞系中所有组的PI摄取细胞百分比均在2.5%至6.8%之间。当细胞保持活力并显示出持续的DNA损伤时，一个潜在的结果是诱导加速衰老。因此，我们评估了处理细胞的衰老特征标记，包括大而扁平的细胞形态、SA-βGal积累和p21过度表达。ABT-888或IR单独处理均未在两种细胞系中诱导显著的SA-βGal活性或p21表达。然而，我们在ABT-888和IR处理后4天观察到PC-3细胞加速衰老的标志物，包括扩大的扁平形态和SA-βGal阳性染色(图4a). PCR检测到p21基因表达也增加了五倍(图4b)免疫荧光检测到蛋白表达增加(图4c). 在DU-145细胞中，只有分离的细胞表现出SA-βGal活性，p21没有增加(图4a–c). 我们没有观察到其他衰老标记（包括p16和p27）在两种细胞系中的过度表达。

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ABT-888和IR单独或联合诱导DU-145和PC-3细胞加速衰老。（a）治疗后7天对SA-βGal活性的分析表明，6 Gy加或不加10μM ABT-888均可增加PC-3细胞中SA-β-Gal的活性。IR单独对DU-145细胞的影响较小，这表明IR+ABT-888对SA-βGal染色的影响有所增加。棒材，20μm。（b）对p21表达的qPCR分析表明，仅在使用10μM ABT-888治疗6 Gy后48 h，PC-3细胞中p21表达显著增加。横杆，SD。（c）治疗后72小时的免疫荧光分析显示，仅在IR和ABT-888处理的PC-3细胞中，p21蛋白有显著积累。棒材，10μm。

ABT-888和IR对前列腺肿瘤的作用体内

为了研究PARP抑制和IR单独或联合应用于肿瘤异种移植的效果，将PC-3和DU-145细胞注射到裸鼠体内形成肿瘤。如上所述，用ABT-888和/或IR治疗小鼠。治疗后4天采集肿瘤，并评估组织切片中的γH2AX和53BP1病灶。肿瘤组织中的发现反映了结果在体外显示ABT-888在PC-3异种移植物中单独诱导DNA损伤灶，但在DU-145细胞中没有。在受照射的PC-3和DU-145肿瘤中，与单纯IR相比，添加ABT-888可在治疗后4 d导致病灶持续存在(图5a). 治疗后第7天采集更多肿瘤，并分析冰冻切片中的衰老标记物。在PC-3肿瘤中，许多细胞SA-βGal染色阳性(图5b)PCR显示联合治疗后p21表达增加（未显示）。在DU-145肿瘤中，只有分离的细胞具有可检测到的SA-βGal活性(图5b)p21的诱导作用不明显（未显示）。

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ABT-888和IR单独或联合治疗PC-3和DU-145肿瘤的病灶持续和加速衰老。（a）ABT-888±IR治疗4d后采集的肿瘤PC-3和DU-145组织切片进行免疫荧光染色。仅6Gy后4d，两种细胞株均显示少量γH2AX和内源性53BP1核病灶。ABT-888增加了PC-3中的持续病灶数量，但对DU-145肿瘤的影响较小。棒材，10μm。（b）治疗后第7天切除肿瘤，切片并分析SA-βGal在IR+ABT-888治疗后PC-3肿瘤中的活性增加。DU-145肿瘤仅显示SA-βGal染色的孤立细胞。棒材，20μm。

我们还分析了单独或联合使用6Gy和ABT-888治疗后小鼠的肿瘤生长情况。ABT-888对PC-3肿瘤的生长有一定的减缓作用（15天时的平均V/V0，ABT-889组为13与控件中的.10，图6a). 与6 Gy联合使用，PARP抑制的效果更为强烈，并显著延迟PC-3肿瘤的再生（32 d时的平均V/V0，IR组为12与联合组为4.5，P（P）= 0.07,t吨测试）。ABT-888单独或联合IR治疗均不能减缓DU-145肿瘤的生长。事实上，我们注意到ABT-888,6Gy后对DU-145瘤的生长有一定的保护作用(图6b).

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ABT-888和IR单独或联合治疗后PC-3和DU-145肿瘤生长动力学。在PC-3中随时间跟踪肿瘤体积（a）和DU-145（b）用ABT-888和IR治疗动物的异种移植瘤。PC-3肿瘤对ABT-888+单独治疗的敏感性最低，但加入ABT-888-6Gy后肿瘤再生明显延迟。剂量为6 Gy的DU-145肿瘤生长没有明显减缓，添加ABT-888似乎有轻微的保护作用。

讨论

PARP抑制剂是一类极具前景的靶向治疗药物，在临床前模型和临床试验中，单独或与基因毒性治疗相结合，在广泛的癌症中显示出益处(7,8). 大部分关注点都集中在“合成杀伤性”机制上(12–15)这将这些药物带到了治疗BRCA突变和三阴性乳腺癌的前沿。前列腺癌患者的试验仍处于早期阶段，尚未显示出明显的益处。在为数不多的研究前列腺癌细胞中PARP抑制剂的论文中，突出的例子集中于利用合成致命性的潜力。这些研究检查了PARP抑制作为因PTEN缺乏导致Rad51表达缺失导致HR缺陷的增敏剂（PC-3，参考文献。18)或缺氧诱导（DU-145，参考。39). 其他研究已经检测了PARP抑制剂与替莫唑胺联合使用对前列腺癌细胞的影响(40). 在前列腺癌中，PARP抑制剂最有可能与常规治疗（如放射治疗）结合使用。也许对体内研究表明，尽管PARP抑制剂的分子靶点已知，作用机制似乎已经建立，但PARP抑制剂如何与基因毒性药物协同作用，以及如何介导其对肿瘤的生长抑制作用，目前尚不清楚。

当IR处理添加到PARP抑制中时在体外我们在PC-3和DU-145细胞系中观察到放射增敏，表现为集落形成减少、IRIF持续性增加和细胞周期阻滞诱导。这个在体外与DU-145相比，PC-3细胞的作用更大，联合治疗后PC-3细胞出现衰老特征。组合的有效性已得到证实体内与IR相比，PC-3肿瘤异种移植物延迟肿瘤生长并诱导衰老表型。然而，在DU-145异种移植物中观察到IR的效果没有改善。我们假设PC-3细胞的衰老可以部分解释体内反应的差异，因为在DU-145细胞中没有观察到明显的衰老。发现DU-145细胞具有更强的抗辐射性在体外据报道，与DU-145肿瘤相比，PC-3肿瘤的低氧分数较高（分别为52%和7%），这可能会增加PC-3的放射抗性体内(41). 然而，据报道，ABT-888也能使缺氧癌细胞的敏感性达到与有氧放射敏感性相似的水平(39); 这种机制可能克服PC-3肿瘤中较高低氧分数的潜在放射抗性。

与Mendes-Pereira等人之前的工作一致(18)，我们发现单独使用ABT-888治疗有一定疗效在体外PC-3前列腺癌细胞中PTEN缺陷。据描述，PTEN缺陷会导致人类肿瘤细胞中的同源重组（HR）缺陷，使其成为PARP抑制剂的治疗靶点(18,42,43). PTEN除了灭活P13-K/AKT通路外，还具有控制染色体完整性和调节Rad51表达的核功能，从而减少自发双链断裂的发生率(44). 单独抑制PARP可诱导PC-3细胞DNA损伤灶，抑制细胞增殖并促进G2/M周期阻滞。在PC-3肿瘤异种移植物中观察到类似的趋势，肿瘤生长受到中度抑制。仅ABT-888对DU-145细胞没有上述任何作用在体外在类似的药物浓度下。这些结果支持了目前的模型，即PARP抑制剂对HR缺乏的BRCA1-、BRCA2-或PTEN阴性癌细胞的疗效是未修复的内源性DNA损伤积累的结果。可以假设，如果PARP抑制剂对PTEN缺乏的前列腺肿瘤的疗效转化为显著的临床益处，那么在选定的病例中，它们可以用作单一疗法，从而在防止放射治疗和手术相关并发症的同时实现充分的肿瘤控制。

我们的结果与其他报告一致，这些报告显示，添加PARP抑制剂后IR的疗效增加(9,11)进一步暗示IRIF持续性是加速衰老增加的决定因素(31,32). 衰老可以由几种诱导物引起，包括未修复的DNA损伤的积累。越来越多的报道称，治疗性衰老是细胞凋亡和坏死之外的另一种细胞死亡方式，并建议在使用细胞毒药物治疗后有助于肿瘤控制(29,45). 与之前的研究一起(11,39)，我们对PC-3细胞和肿瘤的研究结果表明，PARP抑制剂可能是一种有效的放射增敏策略。此外，与我们之前的工作一致(22)加速衰老可能是某些人类肿瘤对IR和PARP抑制联合治疗反应的一个因素。

Liu等人(39)之前观察到，经IR和ABT-888处理的DU-145细胞毒性增加，但未发生凋亡。在我们的实验中，ABT-888使DU-145细胞对IR敏感，这是通过克隆形成试验和诱导DNA损伤灶来测量的，没有诱导衰老或凋亡，表明存在有丝分裂死亡。这个p53突变细胞系在Rb基因中也有无义突变(35)，损害p53/p21和p16/ARF/Rb衰老途径(32). 我们将ABT-888对DU-145肿瘤缺乏益处归因于其对持续DNA损伤的独特反应。我们也承认，可能有其他未知的宿主或肿瘤因子影响ABT-888在DU-145肿瘤中的疗效。对我们数据的有利解释是，PARP抑制剂疗效的关键决定因素体内可能是它们驱使细胞衰老的能力。由于基因毒性治疗诱导的衰老细胞可以在组织中持续数周或数月，并且可以通过旁分泌信号改变微环境(46,47)，它们可能会限制其他肿瘤细胞的恢复。这些结果也突出了针对每种肿瘤量身定制治疗的重要性。

我们的结论是，PARP抑制剂与放射治疗相结合，甚至作为DNA修复缺陷肿瘤的单一疗法，对特定类型的前列腺癌具有治疗潜力。诱导加速衰老是一种新的治疗方法，值得临床试验考虑。尽管人们越来越认识到它是一种潜在的肿瘤控制替代品，但仍然缺乏可靠的衰老诱导剂，这一领域仍然是一个有待进一步研究的开放领域。PARP抑制剂是实现这一目的的有力候选药物，但可能局限于特定的肿瘤类型。

致谢

财务支持：路德维希前列腺癌转移研究中心，NCI SPORE前列腺癌P50 CA090386（RRW，SJK），NIH R21 CA138365（SJK，RRW），NIH-R01 GM60443（SJK），Foglia家庭基金会，Francis L.Lederer基金会，放射治疗中心，美国临床肿瘤学会转化研究教授（EEV）。

缩略语列表

PARP项目聚ADP-核糖聚合酶
红外电离辐射
DSB/SSB双股断裂，单股断裂
PTEN公司10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物
人力资源同源重组
NHEJ公司非同源末端连接
53制动踏板1p53结合蛋白1
IRIF公司电离辐射诱导焦点
GFP公司绿色荧光蛋白
H2AX型组蛋白2A，成员X
圆周率碘化丙锭
SAβ-Gal衰老相关β-半乳糖苷酶
聚合酶链反应聚合酶链反应

脚注

利益冲突：没有一位作者存在潜在的利益冲突。

工具书类

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