公共科学图书馆一号。 2011; 6（7）：e21417。
代谢组分析揭示雄激素在激活前列腺癌细胞氨基酸代谢和甲基化中的作用 , 1 , 2 , ¤ , 5 , 1 , 2 , 1 , 2 , 1 , 2 , ¤ , 1 , 2 , ¤ , 6 , 6 , 6 , 7 , 7 , 8 , 9 , 5 和 1 , 2 , 三 , 4 , * , ¤
纳吉雷迪·普特鲁里
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
阿里·绍杰
5 美国密歇根州安阿伯市密歇根大学统计系
维哈斯·瓦苏
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
Srilatha Nalluri公司
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
Shaiju K.Vareed公司
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
Vasanta Putluri公司
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
Anuradha Vivekanandan-Giri公司
6 美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科肾脏科
杰曼·拜恩
6 美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科肾脏科
Subramaniam Pennathur公司
6 美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科肾脏科
西奥多·萨纳
7 美国加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司代谢组学实验室应用小组
史蒂文·M·费舍尔
7 美国加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司代谢组学实验室应用小组
加内什·S·帕拉帕图
8 美国德克萨斯州休斯顿卫理公会医院泌尿科
查德·克雷顿
9 丹。 美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院L.Duncan癌症中心
乔治·迈克利迪斯
5 美国密歇根州安娜堡密歇根大学统计系
阿伦·斯里库马尔
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
三 美利坚合众国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院泌尿系
4 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院外科
Jean-Marc Vanacker， 编辑器
1 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院癌症中心
2 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生物化学和分子生物学系
三 美利坚合众国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院泌尿系
4 美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院外科
5 美国密歇根州安阿伯市密歇根大学统计系
6 美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科肾脏科
7 美国加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司代谢组学实验室应用小组
8 美国德克萨斯州休斯顿卫理公会医院泌尿科
9 丹。 L.Duncan癌症中心，贝勒医学院，美国得克萨斯州休斯顿
法国里昂经济研究所
构思和设计实验：ASK。 执行实验：NP VTV SN SKV VP AV-G SP。分析数据：AS CJC GM。贡献的试剂/材料/分析工具：JB TRS SMF GSP。 撰写论文：NP ASK GSP。
¤ 当前地址：美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院Verna and Marrs McLean生物化学系和Alkek分子发现中心细胞和分子生物学系
2010年12月10日收到； 2011年6月1日接受。
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补充资料 图S1： 发现阶段使用的代谢组学分析平台的再现性。 使用正电离在Q-TOF上分析的五个技术复制品的12种代谢物标准混合物的色谱再现性。 （PDF格式）
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图S2： 我们的“ARD与ARI细胞系中改变的代谢谱”代谢组谱的分子概念分析网络视图（灰色节点）。 每个节点代表一个分子概念或一组生物相关基因。 节点大小与概念中的基因数量成比例。 每个边缘代表一个统计显著的富集（FDR q值<0.2）。 黄桥表明了描述“氨基酸代谢”的丰富概念。 （PDF格式）
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图S3： 表中描述了代谢组特征的一致性，该特征区分雄激素依赖性PCa细胞和雄激素依赖型细胞，以及雄激素诱导的VCaP细胞和前列腺衍生组织的代谢组特征。 （PDF格式）
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图S4： 对PCa细胞系和器官相关肿瘤/转移性疾病之间12种代谢物特征一致性的肿瘤素概念图（OCM）分析，描述蛋氨酸代谢、甲基化和烟酰胺代谢。 （PDF格式）
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表S1： 的列表 挑选出来的 前列腺癌细胞系特异性代谢组学特征丰富的分子概念。 （PDF格式）
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表S2： 的列表 全部的 前列腺癌细胞株特异性代谢组特征丰富了分子概念。 （PDF格式）
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表S3： 的列表 全部的 用10 nM R1881处理VCaP细胞24小时后，分子概念得到了丰富。 （PDF格式）
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表S4： 的列表 全部的 概念丰富了12种代谢物特征，这在PCa细胞系和组织之间是一致的。 （PDF格式）
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摘要 前列腺癌是美国男性癌症相关死亡的第二大原因。 临床局限性前列腺癌的发展和进展高度依赖雄激素信号。 转移瘤最初对抗雄激素治疗有反应，但随着病情进展，对该方案产生耐药性。 基因组学和蛋白质组学研究表明雄激素在调节前列腺癌代谢过程中发挥作用。 然而，迄今为止还没有进行过代谢组学分析研究来检测前列腺癌中雄激素调节的生化过程。 在这里，我们使用了无偏见的代谢组学分析结合基于富集的生物过程映射来深入了解前列腺癌细胞系中雄激素介导的生化变化。 我们的研究结果表明，雄激素暴露导致前列腺癌细胞中氨基酸代谢升高和甲基化潜能改变。 此外，代谢表型研究证实，雄激素治疗前列腺癌细胞中与氨基酸代谢相关的通路流量较高。 这些发现为深入了解前列腺癌中雄激素信号调节的潜在生化过程提供了线索。 在临床上，如果得到验证，可以利用这些途径开发治疗策略，以补充目前的雄激素消融治疗，同时观察到的雄激素调节代谢特征可以用作预测去势耐受性前列腺癌发生的生物标记物。
介绍 前列腺癌（PCa）是美国男性最常见的实体器官恶性肿瘤，是美国男性癌症相关死亡的第二大原因 [1] 雄激素和雄激素受体（AR）在前列腺癌的发展和进展中起着重要作用，雄激素消融是治疗局部晚期或转移性前列腺癌的主要治疗选择之一 [2] 近90%的转移性前列腺癌患者最初对去势诱导的雄激素停药有反应； 然而，这种治疗通常在不到2年的时间内有效，随后进展到去势抵抗状态（去势抵抗前列腺癌，CRPC）。 CRPC是一种致命疾病。 [3] 尽管CRPC对雄激素剥夺治疗有临床抵抗力，但它表达AR [4] 并通过雄激素受体信号轴的非传统激活表现出活跃的雄激素信号传导 [5] 血清前列腺特异性抗原（PSA）水平升高最能说明这一点，PSA是一种雄激素调节蛋白，目前被用作肿瘤生化复发的标志物，尽管CRPC已经发展 [6] CRPC中的AR活性是由对低水平循环雄激素敏感的高亲和力受体介导的，还是由受体获得与其他类固醇激素混杂作用的能力，目前仍存在争议 [4] , [7] , [8] 后者得到了一些研究的支持，这些研究描述了AR的激素结合域中的一个频繁突变（T877A），使得AR可以结合其他类固醇激素，从而克服了雄激素的特殊需求 [9] , [10] , [11] 然而，重要的是，目前还没有可用的标记物来预测肿瘤是否会进入去势抵抗状态。 因此，了解前列腺癌中雄激素作用引起的分子改变是至关重要的。 多个研究小组利用基因表达阵列和质谱技术研究了PCa细胞系中转录组和蛋白质组水平的雄激素调节变化 [12] , [13] , [14] , [15] , [16] , [17] , [18] 一项使用affymetrix寡核苷酸阵列的开创性研究强调了PCa细胞中雄激素信号与应激反应相关代谢过程的关联 [19] 此外，雄激素驱动的PCa细胞增殖已被证明涉及雷帕霉素（m-TOR）哺乳动物靶点的激活 [20] , [21] , [22] , [23] 其本身对肿瘤中的代谢紊乱很敏感 [24] , [25] 尽管存在这种关联，但对雄激素作用在PCa细胞中诱导的生化变化的了解有限。 通过对匹配基因表达和蛋白质组数据的综合分析，我们早先预测了雄激素处理的LNCaP（雄激素敏感型）前列腺癌细胞中氨基酸代谢的激活 [26] PCa组织的代谢组分析进一步加强了这一预期，显示氨基酸代谢是早期肿瘤发展的标志之一 [27] 在这里，我们采用基于质谱的雄激素处理的PCa细胞代谢组分析，指定改变的代谢物，识别和验证生化途径，并评估患者衍生组织中的激素相关特征。 我们的结果表明雄激素诱导的PCa细胞氨基酸代谢的升高和甲基化潜能的改变，这两者都证实了我们早期使用患者来源的局部和转移性PCa组织的发现 [27] .
方法 细胞系 前列腺细胞系（永生良性-RWPE；雄激素非反应性-PC3、DU145和雄激素反应性-VCaP和LNCaP）购自美国类型培养库（ATCC，Manassas，VA）。 RWPE细胞在角朊细胞-SFM培养基（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）中生长，该培养基补充有5 ng/ml表皮生长因子（EGF）和50µg/ml牛垂体提取物（Invit罗gen Corp，Carlsba，CA）。 VCaP细胞在补充有10%胎牛血清（FBS；Hyclone Labs，Thermo Scientific，Rockford，IL）和1%青霉素-链霉素（Hyclon Labs，Thermo Scientistic，Rock ford，IL.）的DMEM-Glutamax培养基（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）中生长。 DU145细胞生长在补充了10%FBS（Hyclone Labs，Thermo Scientific，Rockford，IL）、1%青霉素-链霉素（Hycclone Labs，Thermo Scientistic，Rock ford，伊利诺伊州）和1%HEPES（Hiclone Lab，Thermo-Scienticific，罗克福德，IL）的最低必需培养基（MEM）（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）中。 PC3和LNCaP细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Hyclone Labs，Thermo Scientific，Rockford，IL）和1%青霉素-链霉素（Hyclon Labs，Thermo Scientistic，Rock ford，IL.）的RPMI-1640培养基（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）中生长。。 所有细胞均维持在37°C和5%CO下 2 .
雄激素（R1881）治疗 如上文所述，在DMEM-Glutamax培养基中培养等量的VCaP细胞，并将其生长至60%的汇合处。 然后用无酚RPMI-1640培养基替换培养基两天，补充10%煤焦状FBS和1%青霉素链霉素（伊利诺伊州罗克福德热科学Hyclone实验室）。 一组细胞用10 nM合成雄激素甲基三烯酮（R1881；马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默）处理24或48小时，而车辆处理细胞（用乙醇处理）作为对照。 在处理结束时，将细胞进行胰蛋白酶化、造粒、用50 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）清洗，并将其储存在−140°C下，直至进一步分析。
细胞系代谢组基于质谱检测的样品制备 对冷冻前列腺细胞颗粒（约1000万个细胞）进行基于质谱的代谢组学分析。 代谢物提取过程包括引入溶于甲醇的11种标准化合物的等摩尔混合物（表油菜素内酯，[D 三 ]睾酮[ 15 N] 邻苯二甲酸、玉米素、茉莉酸、赤霉素、[D 4 ]雌激素[ 15 N] -色氨酸，[D 4 ]胸腺嘧啶[ 13 C] 肌酐和[ 15 N] 精氨酸），然后使细胞均匀化。 然后依次使用水（冷冻水）和有机（冷冻甲醇和氯仿）溶剂以1∶4∶3∶1（水∶甲醇∶氯仿∶水）的比例萃取匀浆 [28] 使用3 KDa分子过滤器（Amicon Ultracel-3K Membrane，Millipore Corporation，Billerica，MA）对所得提取物进行脱蛋白处理，并在真空下干燥含有代谢物的滤液（Genevac EZ-2 加 ，纽约州加德纳市）。 在进行质谱分析之前，将干燥的提取物重新悬浮在相同体积的注射溶剂中，该溶剂由水∶甲醇（50∶50）和0.2%乙酸组成，并进行液相色谱（LC）质谱分析。 作为监测分析过程的附加控制，11种标准化合物（表油菜素内酯[D 三 ]睾酮[ 15 N] 邻苯二甲酸、玉米素、茉莉酸、赤霉素、[D 4 ]雌激素( 15 N） 色氨酸，[D 4 ]胸腺嘧啶[ 13 C] 肌酐和[ 15 N] 精氨酸）和表征的小鼠肝脏池（与细胞系串联提取）与细胞系样品一起进行分析。 这些对照中的每一个都被多次纳入随机化方案中，以便能够持续监测样品制备和分析变异性。 此外，每个细胞系的分析至少通过两次空白运行进行，以防止样品之间的任何代谢物携带。 图S1 说明了使用上述标准混合物监测的剖析过程中的再现性。 值得注意的是，使用上述五个独立重复的小鼠肝脏提取物测量的整个分析过程的CV小于5%。
液相色谱/质谱（LC/MS） 无偏分析平台的LC/MS部分基于1200 SL快速分辨率LC和6520四倍飞行时间（Q-TOF）质谱仪（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）。 使用双电喷雾电离（ESI）源在正负电离模式下对样品进行独立检测。 通过使用配备100∶1分流器的独立1200 SL快速分辨率LC等速泵注入参考离子的标准混合物，以输出5µl/min的流速，实现质谱分析过程中的实时质量校正。供应商提供的参考混合物中含有 米/z 121.050873、922.009798和119.03632、966.000725分别用于正（+）和负（−）电离模式下的质量校正。 整个无偏剖面过程采用了50–1000 m/z之间的质量范围。 分析期间的数据采集使用Mass Hunter工作站数据采集软件进行控制。 质谱分析过程中使用的参数包括：1）源条件：毛细管电压，4000 V（负模式3500 V），2）源温度为325°C，3）干燥气体使用速度为10 l/min，4）雾化器压力保持在45 psig（参考离子雾化器10 psig），5）碎片电压设置为140， 撇沫器电压保持在65 V。在整个分析过程中，使用超高纯氮气作为雾化器和碰撞气体。 对于碰撞诱导解离（CID）实验，使用设置为高分辨率模式的四极分析器选择前体离子，同时使用TOF分析仪分析产物离子。 除非另有规定，否则所有实验中的碰撞能量均设置在10-40 eV之间。 在相同的实验条件下记录了本研究中分析的样品的光谱。 整个研究中使用的LC溶剂从Burdick&Jackson（密歇根州马斯科贡）购买，使用时无需进一步净化。
LC-QTOF上的反相（RP）色谱分离采用水（溶剂a）和甲醇（MeOH，溶剂B）梯度（两种溶剂均通过添加0.2%乙酸进行改性）。 二元泵流速为0.6ml/min，初始溶剂组成为2%B。在13分钟的时间内从2%B到98%B进行梯度操作，然后在（样品分析）后的6分钟和5分钟内进行98%B操作。 采用由保护柱Zorbax SB-C8（2.1×30 mm，3.5 um）和分析柱Zorbax SB-Aq（安捷伦科技，CA）（2.1×50 mm，1.8 um）组成的柱系统进行反相分离。 在整个色谱过程中，柱温保持在60°C。 此外，在进行基于质谱的代谢组学分析之前，所有样品均保持在4°C。 在质心模式和剖面模式下均获得了质谱数据。 为了监测任何运行间的变化，收集并存储了每台LC-相关泵的流量和压力曲线。
使用LC耦合三重四极杆质谱法（QQQ Agilent Technologies，Santa Clara CA）通过单反应监测（SRM）策略对化合物进行目标评估。 该质谱仪的操作参数包括1）源条件毛细管电压3000 V，源温度350°C，2）干燥气体保持在10 l/min，3）雾化器压力设置为35 psig，4）碎片电压设置为70 V。 除非另有说明，否则用于碎片化的碰撞能量设置为10–40 eV。
LC-QQQ上的反相（RP）色谱分离采用了含有水（溶剂a）和乙腈（ACN，溶剂B）的梯度（两种溶剂均通过添加0.2%乙酸和0.1%甲酸进行改性）。 色谱分离在Zorbax Eclipse XDB-C18柱（安捷伦科技公司，CA）（50×4.6 mm i.d.；1.8µm）上进行，保持在37°C，流速为0.2 ml/min。 梯度开始时的溶剂为2%B，然后在6.5分钟内逐渐增加到30%B，随后在接下来的0.5分钟内增加到90%B，再增加5分钟为95%B，并在8分钟内降低到2%B。 随后再进行5分钟的样品后平衡。 值得注意的是，每50次注射后，对色谱柱进行清洗和修复。
LC-QQQ上的水正相（ANP）色谱分离采用了含有乙腈（ACN，溶剂a）：水（溶剂B）的梯度，两种溶剂均通过添加0.2%乙酸和0.1%甲酸进行了改性。 流速设置为0.4 ml/min。初始溶剂为95%A，梯度为95%A至90%A，持续3分钟，90%A至80%A，随后80%A至75%A，75%A至55%A，2分钟，55%A至40%A，40%A至30%A，2 min，30%A至20%A，20%A至95%A，1 min，95%A，5 min。 然后将色谱柱重新调整至初始状态。 将金刚石氢化物柱（MicroSolv Technology，Eatontown，NJ）（4 um，100A 2.1×150 mm）保持在温度控制室（37°C）中，用于化合物分离。 在无偏见和有针对性的代谢组分析过程中，一些化合物在多个平台上被冗余可视化。 考虑到不同接口的灵敏度和线性有很大不同，这些冗余被用作质量控制过程的一部分。 此外，本研究中采用的严格质量控制涉及色谱分离，实验之间检测到的化合物的保留时间变化小于0.1分钟( 图S1 ). 此外，我们还使用含有纯化合物等摩尔混合物的内标物以及一个特征化的肝脏样本池来控制过程相关的变化。 这两个对照组与细胞系样品一起重复分析。 此外，为了确保分析过程的一致性，在这些实验开始时，所有的色谱柱和溶剂都是从单个制造商的批次购买的。
除了上述无偏分析外，还使用同位素稀释气相色谱-耦合质谱法对丙氨酸和肌氨酸进行了评估。 在此，通过与100 uL二甲基甲酰胺（DMF）形成共沸物，并在真空下干燥悬浮液，去除样品中的残余水。 所有样品均使用柱上注射器和安捷伦6890N气相色谱仪进行注入，该色谱仪配有15 m DB-5毛细管柱（内径0.2 mm；膜厚0.33微米；加利福尼亚州J&W Scientific Folsom），与安捷伦5975 MSD质量检测器相连。 这个 t吨 -采用同位素稀释电子碰撞电离GC/MS，通过选择离子监测（SIM）对肌氨酸的丁基二甲基硅基衍生物进行定量。分别在3.8和4.07分钟洗脱的丙氨酸和肌氨酸水平通过其各自的离子比进行定量 米 / z（z） 232来自天然代谢物（[M-O- t吨 -丁基-二甲基硅基] − )和 米 / z（z） 丙氨酸和肌氨酸分别为233和235，来源于同位素标记的氘化内标物[ 2 H（H） 三 ]用于肌氨酸。 使用同位素稀释GC/MS，肌氨酸的检测限（信号/噪声>10）为～0.1皮摩尔。
代谢组表型芯片 使用含有各种代谢物的96个平板作为唯一营养基质进行代谢表型分析。 含有营养素的平板取自Biolog Inc（加利福尼亚州海沃德），并按照制造商的说明进行分析。 共有88种糖、5种核苷酸和29种氨基酸作为底物在制造商标记为M1和M2的两个96 well板上进行检测。 基本上，该分析测量了生长细胞对这些代谢物的利用率，作为NADH通量的函数，而NADH流量又是通过四氮唑染料的还原程度来测量的。 后者在590 nm处通过分光光度法定量，而在790 nm处评估任何非特定背景活性。 在代谢表型研究中，VCaP细胞饥饿96小时，并以20000个细胞/孔的密度接种到96 well板的孔中。 值得注意的是，VCaP细胞在接种时用10 nM R1881或载体（乙醇）处理。 然后让细胞在37℃、5%CO的条件下生长24小时 2 培养24小时后，通过使用分光光度计监测590 nm处的光密度来测量NADH通量。 同时，在790 nm处读取读数，以评估背景活性。 第一次读数是在添加雄激素后24小时测得的，随后每隔1小时测得一次读数，最多30次 第个 小时，然后在34 第个 , 42 第 和48 第个 添加雄激素后小时。 数据在excel表中制成表格，并按照统计方法进行分析。
代谢组学库 Metlin库（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）用于搜索质谱数据。 该库是使用大约1000种商用化合物创建的，这些化合物的保留时间是使用上述RP和ANP色谱法确定的。 此外，这些标准化合物的质量和碎片离子信息也在正电离和负电离模式下获得，并包含在Metlin库中。
统计分析 从分析中去除缺失值超过60%的代谢物。 由于质谱仪数据的阈值化，代谢数据被保留审查。 为了解释不同类别缺失模式的差异，雄激素反应性（ARD）、雄激素非反应性（ARI）和良性（Ben）缺失值比例的分布 对样品进行了检查，每组缺失值超过85%，总缺失值低于60%的化合物被认为具有生物缺失性。 雄激素治疗组和对照组样本的治疗方法相同。 将这些代谢物的缺失代谢物测量值替换为检测水平（2000年）。 剩余代谢物中缺失的测量值使用最近邻算法进行插补，k=5，使用R-package pamr。 然后对估算数据进行log2转换。 Q-TOF数据的归一化是使用limma R包对每个样本进行分位数归一化。 QQQ样本通过中位数定心和IQR标度进行归一化。
分别使用R包gplot、stats和limma绘制热图、箱线图和维恩图。 然后对从不同平台获得的数据按化合物进行缩放，并在样品之间进行比较。 重复化合物的样品通过对相同化合物多次出现的样品进行平均来组合。 使用具有Pearson相关性的完全连锁进行分层聚类。 在双样本试验中，采用双侧t检验评估每种代谢物与雄激素反应状态的相关性。 然后，通过使用R包fdrtool计算q值，使用q*=0.2的FDR对所得p值进行多次测试调整 [29] .
首先对代谢表型分析的数据进行背景信号校正，背景信号是从空孔读数中获得的。 然后通过从每个时间点的所有其他样本中减去三个阴性对照井的平均值来调整数据。 使用热图和箱线图比较雄激素治疗对生长在氨基酸和糖平板中的前列腺癌细胞与对照细胞的影响。 此外，基因集分析（R-package GSA [30] )用于评估每个时间点各自平板中氨基酸和糖途径的总体富集情况。
结果 前列腺衍生细胞系的代谢组学分析 为了分析前列腺癌中雄激素调节的代谢组，我们使用液相色谱法结合质谱法来研究前列腺衍生细胞系（永生良性-RWPE；雄激素非应答-PC3和DU145以及雄激素应答-VCaP和LNCaP）中代谢物的相对水平。 除了描述前列腺癌特异性（PCa）代谢特征外，我们还检测了雄激素应答（ARD）与非应答细胞（ARI）的代谢变化，以及VCaP细胞中雄激素直接调节的代谢变化。 如中所述 本研究中使用的无偏代谢组学分析平台包括反相色谱和水-正相色谱，以及1）正离子模式（+）下的电喷雾电离（ESI）和2）负离子模式（-）下的ESI。 此外，在分别以（+）和（−）离子模式运行的三重四极质谱仪上使用单反应监测（SRM）对57种化合物进行了目标评估( ). 细胞系衍生的质谱曲线经过预处理，包括数据过滤、插补、对数转换和标准化，如 然后对标准化数据进行检查，以确定代谢物是否能够区分1）良性前列腺细胞系（Ben）和前列腺癌细胞系（PCa），2）雄激素反应性前列腺癌细胞（ARD）和雄激素非依赖细胞（ARI），以及3）雄激素治疗前列腺癌细胞和未治疗对照组。 此外，利用我们小组早些时候发表的组织衍生代谢组学图谱，在局部组织和转移组织中评估区分ARD和ARI细胞系的代谢物 [27] 对类特异性代谢特征进行基于富集的生物过程映射，然后使用体外代谢表型实验进行验证。
前列腺细胞系的代谢组学分析。 前列腺细胞系代谢组分析中涉及的各个步骤的图示。 主要步骤包括代谢物提取和分离、基于质谱的检测、光谱分析、数据归一化、类别特定代谢物和改变路径的描述及其功能表征。 样品提取、分离和质谱的变化使用加标标准进行控制，并使用各种质量控制参数进行评估( 图S1 ).
使用本研究中使用的不同质谱法在六种前列腺细胞系中检测到总共1553种化合物（见上文， ). 其中，40种化合物仅在Ben中检测到，而在ARI和ARD细胞系中分别检测到102种和55种化合物( ). 值得注意的是，本简编包含72种命名代谢产物( ). 基于具有显著差异表达化合物的层次聚类图完美描绘了前列腺细胞系( ).
前列腺癌细胞系的代谢组。
一 )1553种代谢物在5个前列腺细胞系中的层次聚类热图表示。 样本类别由彩色条表示[良性=绿色，雄激素非反应性前列腺癌（ARI）：黄色，雄激素反应性前列腺瘤（ARD）：红色条]。 列表示单个细胞系，行表示不同的代谢物。 黄色阴影表示代谢物的升高，蓝色阴影表示代谢物相对于中位代谢物水平的降低（见色标）。 B类 )维恩图表示1553种代谢物在良性（RWPE）、ARI（DU145和PC3）和ARD（LNCaP和VCaP）细胞系中的分布，使用液相色谱耦合质谱法进行测量。 C类 )与中相同( 一 )，但对于72种命名的化合物 D类 )树状图表示B中描述的前列腺相关细胞系的层次聚类，使用具有显著差异表达的化合物。
特定的代谢特征将Ben与PCa和ARD与ARI区分开来 为了描述Ben和PCa细胞系之间的代谢组学变化，我们使用了2个样本 t吨 -测试。 在多次比较调整后，共有674/1553个化合物在这两个类别中存在差异，错误发现率（FDR）为20%。 该列表中包括29种命名代谢物，其相对水平如 PCa细胞系中这种改变的代谢组特征包含较高水平的氨基酸，如肌氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸，以及较高水平的与氮代谢相关的化合物，如肌酸、肌酐、瓜氨酸和N-乙酰精胺。 另一方面，与Ben相比，PCa中属于色氨酸代谢的代谢产物，即色氨酸、1-甲基色氨酸和咖啡酸的水平降低。 同样，ARI和ARD PCa细胞系之间的913/1553个化合物发生了改变( ). 改变后的清单包括52种命名代谢物，其中精胺、N1-乙酰精胺和氨基酸水平，如丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、同型半胱氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸等，在ARD中升高( ). 相反，ARD细胞中S-腺苷甲硫氨酸（SAM，细胞的甲基化货币）的水平降低，同时其分解产物同型半胱氨酸的水平增加( ). 这表明前列腺癌中甲基化活性增加，与我们早期对晚期前列腺癌组织的研究结果一致 [27] .
前列腺癌细胞系的代谢变化。
一 )热图显示前列腺癌细胞与良性细胞系中29种命名的差异代谢物( 第页 <0.05，FDR=20%），使用 t吨 -测试与排列耦合( n个 = 1000）来确定 第页 -用于比较组的值。 热图是在对数据进行对数缩放和分位数归一化后生成的。 颜色方案与中的相同 . B类 )与中相同( 一 )但对于ARI（黄色条）和ARD（红色条）前列腺癌细胞之间的52种指定差异代谢物。 C类 )我们的“PCa细胞系特征改变”（灰色节点）代谢组学特征的分子概念分析网络视图。 每个节点代表一个分子概念或一组生物相关基因。 节点大小与概念中的基因数量成正比。 每个边缘代表统计上显著的富集（FDR q个 -值<0.2）。 黄桥表明了描述“氨基酸代谢”的丰富概念。
PCa-衍生代谢组的集成分子概念建模 在描述Ben、ARD和ARI前列腺细胞系的代谢组学模式后，我们随后在生化途径的背景下评估这些变化，并在前列腺癌发生和发展过程中描述改变的生化过程，同时保持其对雄激素的反应。 为了描述前列腺癌细胞系以及雄激素反应性前列腺癌细胞中改变的整体生物过程，使用Oncomine概念图（OCM， 网址：www.oncomine.org ) [31] , [32] 这里，“分子概念”是指以某种生物学意义上的方式相关的任何一组分子成分。 在这项分析中，我们使用了两种一般类型的分子概念：（1）来自外部数据库的基因和蛋白质注释，以及（2）计算衍生的调控网络。 外部注释包括染色体位置、蛋白质结构域和家族、分子功能、细胞定位、生物过程、信号传递和代谢途径、蛋白质相互作用网络、蛋白质复合体和基因表达特征。 通过扫描人类启动子中已知的转录因子基序，并通过比较基因组学分析确定保守启动子和3′UTR元件，从而衍生出调控网络。 总共收集并分析了来自13个数据库和335个高通量数据集的数据。 在富集分析之前，使用京都基因和基因组百科全书（KEGG， 网址：www.genome.jp/kegg ). 在代谢物是其相应酶活性的功能性最终产物的前提下，使用KEGG再次将其转换为相应的酶-基因ID（EGID）。 然后使用从类特异代谢组获得的EGID来选择潜在感兴趣的分子概念，其中对包含KEGG中发现的所有EGID概要的空集进行富集分析。 所选的分子概念在20%的FDR阈值下意义重大。 这种方法使我们能够系统地将代谢组特征与前列腺癌相关的生物过程联系起来，并受雄激素作用的调节。 PCa-特异代谢组丰富的选定分子概念子集显示在 并与相应的FDR一起列出 q个 -补充中的值 表S1 此外，PCa-特异代谢组丰富的所有概念的列表在补充中列出 表S2 .
值得注意的是，PCa-特异性代谢谱丰富了描述氨基酸代谢的多个相互关联的概念，与早期雄激素调节转录组学和蛋白质组学特征综合分析中观察到的类似 [33] ( ，黄桥）。 这些概念描述了脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和组氨酸的丰富代谢活性，以及转氨酶活性和通过尿素循环动员产生的氮。 第二组概念描述了通过富集氨酰-tRNA和翻译机制将这些氨基酸用于蛋白质合成。 有趣的是，描述ARI和ARI的代谢组特征也丰富了描述雄激素反应细胞中氨基酸代谢升高的类似概念( 图S2 ). 此外，PCa-特异性代谢特征也丰富了核苷酸酶和连接酶活性，提示细胞增殖( ).
激素反应性前列腺癌中雄激素调节代谢物的描述 我们对上述前列腺癌细胞系和先前报道的临床定位组织的研究结果 [27] ，表明雄激素在优先提高肿瘤代谢氨基酸的能力方面发挥作用。 为了证实这一点并描述雄激素影响的其他代谢生态位，我们对雄激素处理的VCaP细胞进行了无偏见的代谢分析。 具体地说，用10 nM R1881处理这些细胞24或48小时，并使用 .
在24小时和48小时雄激素处理的细胞中检测到的代谢谱分别包含1024和1146种化合物，这在无监督的情况下完全区分了雄激素处理细胞和对照细胞( ). 本时间课程概要中包括69种和56种分别在这两个时间点确定的命名代谢物( ). 有趣的是，约70%的雄激素改变的化合物在24和48小时时表现出一致的变化模式( ). 此外，与PCa细胞系的结果类似，雄激素治疗引起的重要代谢产物列表主要包含氨基酸和氮代谢途径的成分( ). 此外，与我们早期对ARD细胞株的研究结果类似，VCaP的雄激素治疗降低了这些细胞中的SAM水平，同时甲基化代谢物如N-甲基甘氨酸（肌氨酸）、2-甲基戊二酸、二甲基甘氨酸、甲基缬氨酸等的水平也相应增加( ). 这表明雄激素可能在改变前列腺癌细胞甲基化潜能中发挥作用，正如我们早先使用组织所报道的那样 [ 27 ] 是肿瘤进展的关键组成部分。
雄激素治疗前列腺癌细胞后的代谢变化。
一 )树状图表示雄激素处理细胞和对照细胞使用其总代谢谱的无监督分层聚类。 B类 )热图显示了与未经治疗的对照组相比，用10 nM合成雄激素（R1881）治疗24小时后VCaP前列腺癌细胞中改变的48种命名差异代谢物( 第页 <0.05，FDR=20%），使用 t吨 -测试与排列耦合( n个 = 1000）以确定 第页 -用于比较组的值。 热图是在对数据进行对数缩放和分位数归一化后生成的。 颜色方案与中的相同 . C类 )与中相同( B类 )但雄激素治疗48小时后的代谢改变 D类 )雄激素治疗后24小时和48小时VCaP前列腺癌细胞代谢物变化的相关图 E类 )我们的“雄激素诱导代谢组特征”（灰色节点）代谢组特征的分子概念分析的网络视图。 每个节点代表一个分子概念或一组生物相关基因。 节点大小与概念中的基因数量成正比。 每个边缘代表一个统计显著的富集（FDR q个 -值<0.2）。 描述“氨基酸代谢”和“甲基化潜能”的丰富概念分别由黄色和红色桥表示。
为了超越个体代谢变化并了解雄激素对整个生化过程的影响，我们对激素治疗24小时后获得的雄激素调节代谢特征进行了富集分析。 由该特征丰富的选定分子概念的子集显示在 并且，所有丰富的概念列表都列在补充中 表S3 以及相应的FDR调整 q个 -值。
值得注意的是，正如预期的那样，雄激素调节代谢组的OCM分析揭示了氨基酸代谢的丰富性，与我们对ARD细胞的结果相似，并且描绘了多个概念，重新证实了雄激素介导的甲基化级联改变( ). 有趣的是，尽管雄激素作用使氨基酸代谢富集与临床定位前列腺癌组织中的生物过程相呼应，但甲基化潜能的变化与转移性肿瘤中的发现相似 [27] 这表明雄激素具有潜在的双重作用，一种是增强肿瘤在发育早期优先利用氨基酸的能力，另一种是加强对肿瘤进展至关重要的甲基化潜能的变化。
代谢表型分析证实雄激素诱导前列腺癌细胞氨基酸代谢升高 上述代谢组分析结果强调了雄激素诱导前列腺癌细胞对氨基酸的依赖性。 为了证实这一点，我们测试了这些细胞代谢各种营养物质（包括糖、核苷酸和氨基酸）的能力。 本质上，这种所谓的代谢表型阵列（Biolog，Inc.，Hayward，CA）测量了活跃增殖的癌细胞利用代谢底物产生的NADH流量。
如所示 并在中绘制 与未经治疗的对照组相比，雄激素治疗后，前列腺癌细胞在糖和核苷酸底物代谢方面没有表现出任何时间依赖性的变化。 然而，与未经处理的细胞相比，添加雄激素后24小时开始，这些细胞表现出更高的氨基酸代谢( ). 雄激素处理细胞的氨基酸代谢升高趋势在激素治疗后27小时显著，并持续到30小时（GSA 第页 -所有三个时间点的值均为0.0001，详见统计方法）( ). 氨基酸途径活性的增加与我们的细胞系衍生代谢谱密切相关，这些代谢谱显示前列腺癌中雄激素驱动的这些代谢产物水平升高。 此外，这种雄激素介导的前列腺癌细胞氨基酸代谢的增加可能导致蛋氨酸的有效利用( ，蛋氨酸），从而产生更高水平的SAM，从而改变细胞的甲基化潜能。
雄激素治疗后前列腺癌细胞代谢流量的测量。 热图显示雄激素治疗24小时后前列腺癌细胞对86种碳水化合物和核苷酸底物的利用程度。 基本上，10 nM R1881（处理24小时）或未处理的VCaP细胞在雄激素治疗后的不同时间点（绘制在X轴上）利用各种营养底物（表示为Y轴上的途径活性）的能力在复制品中进行了检测。 通过计算产生的NADH流量来评估代谢营养物质的能力，NADH流量通过读取590nm处的光密度（OD）来测量。 热图是在对数据进行背景减除、对数缩放和分位数归一化后生成的。 黄色阴影表示活动增加，而蓝色阴影表示活动减少（参考色标）。 B类 )与中相同( 一 )但要利用29种氨基酸。 C类 )表示方框图，显示雄激素治疗后不同时间点前列腺癌细胞中糖和核苷酸（粉红色）以及氨基酸（棕色）通路的中位数流量。 对于每个箱线图，中间值由中心水平线表示； 上（75%）和下（25%）四分位数由方框的上下边界表示。 从方框延伸的上下垂直线表示上下四分位的四分位范围的1.5倍。
细胞系衍生雄激素相关代谢组特征与组织衍生代谢组的比较 在本研究中，通过首先比较激素非依赖性细胞系（也称为ARI，即DU145和PC3）的代谢组与雄激素反应细胞（也称为AR，即VCaP和LNCaP）的代谢谱，获得了雄激素调节特征的见解。 尽管这些细胞类型的雄激素反应已经有很好的记录， 这些细胞在分子组成上表现出差异。因此，区分ARD和ARI细胞系的代谢组学特征可能会被这些细胞的分子组成差异以及它们对雄激素的反应差异所混淆。 为了防止前者，我们还分析了用合成雄激素处理的VCaP细胞的代谢组。 对两种代谢特征（ARI vs ARD谱和因添加雄激素而改变的代谢组）进行一致性分析，以了解雄激素可能调节的代谢物。 为了进一步确定它们在前列腺癌发展和进展中的相关性，在早先发表的雄激素反应代谢组和组织衍生代谢组特征之间进行了类似的荟萃分析 [27] 后者由代谢物组成，与良性邻近组织（n=16）和转移性疾病（n=14）相比，在组织局限性PCa（n=12）中检测到代谢物概要 [27] 因此，本质上，这种荟萃分析方法通过1）24小时雄激素处理细胞2）48小时雄激素治疗细胞3）局限性PCa和4）转移性疾病的代谢组学特征，检查了区分ARI和ARD细胞的代谢组分指纹。
在上述四个数据集中的至少一个数据集中，总共选择了43/52种代谢物进行荟萃分析( 图S3 ). 最初，我们比较了区分ARI和ARD与雄激素处理的VCaP细胞相关的代谢组学特征（24和48小时）。 在这一比较中，26/43个代谢物是一致的。 其中，后者包括天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸和色氨酸等氨基酸，以及肌酸、肌酐和乙酰化多胺等氮代谢成分。 此外，该清单还包括SAM及其代谢产物同型半胱氨酸。
同样，ARD与ARI特征的总共24/43个代谢物显示出与器官局限性PCa和转移性疾病相关的代谢组的类似变化模式。 此比较中一致的化合物包括氨基酸、SAM以及色氨酸分解的成分，如犬尿氨酸、犬尿酸和代谢产物，如组胺、精胺和亚精胺。 重要的是，根据对雄激素的反应区分PCa细胞系的总共12种代谢物在雄激素处理的VCaP细胞和患者衍生组织中的表达模式相似。 其中包括SAM、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、天冬酰胺、丝氨酸、组氨酸、色氨酸、同型半胱氨酸、肌酸酐、次黄嘌呤、天冬氨酸、酪氨酸和赖氨酸。 基于OCM的这12种代谢物特征的富集分析（使用ARD和ARI细胞系（n=72）中检测到的所有命名代谢物作为空集）揭示了描述蛋氨酸代谢、SAM活性和甲基化（FDR<20%， 图S4 ，请参阅 表S4 获取由12-代谢物特征丰富的所有概念的列表 第页 -值和 q个 -值）。 值得注意的是，这些丰富的概念与转移性前列腺癌中的概念相似 [27] 并支持我们的观点，即雄激素在前列腺癌中的作用可以改变甲基化潜能，从而有助于肿瘤的进展。 需要进一步研究来验证这12种代谢物在PCa中的作用。
讨论 为了描述雄激素作用改变的生化过程，我们采用了基于全球质谱的前列腺癌细胞株代谢组无偏见分析策略。 然后，分析数据被用于通过基于生物信息学的通路映射描述改变的生物过程，然后通过代谢表型微阵列分析进行通路功能验证。 总体而言，我们对良性和前列腺癌细胞系进行了分析，后者包括雄激素反应细胞和非反应细胞。 尽管多个研究小组已经研究了这些细胞系中转录组和蛋白质组水平的雄激素调节变化 [12] , [13] , [14] , [15] , [16] , [17] , [18] ，这些细胞中雄激素诱导的代谢组改变尚未见报道。 定义这一点的必要性源于我们早期对前列腺癌组织代谢组学特征的研究，该研究揭示了氨基酸代谢和甲基化潜能的改变分别是惰性肿瘤和晚期肿瘤的标志 [27] 然而，根据该研究，尚不清楚这些改变是否受到雄激素的影响，雄激素是前列腺癌发展和进展的关键调节因子。
本研究中进行的无偏代谢组学评估采用高重复性化学中心色谱分离代谢物，并结合Q-TOF/QQQ质谱仪检测代谢物。 通过使用多组标准和特征组织提取物进行监测，剖面分析过程中的整个过程变化低于5%。 使用这种强有力的策略，该研究在前列腺衍生细胞系中检测到1000多种化合物，包括雄激素治疗前后的细胞系。 重要的是，这些代谢谱可以在无监督的层次聚类中将细胞系划分为不同类别，暗示存在类别特定的代谢生态位。 因此，PCa和Ben细胞系之间的代谢谱比较显示了多种氨基酸水平的改变。 该列表中包括前列腺癌中与良性前列腺癌相比升高的肌氨酸，这一发现与我们早期对前列腺组织的分析研究一致 [27] 此外，氮代谢的成分，即肌酸酐、瓜氨酸、肌酸酐和N1乙酰精胺也升高，表明氨基酸利用率增加。 值得注意的是，这种氨基酸成瘾反应在生物过程浓缩中，其中PCa-特异代谢组丰富的大多数概念强调了氨基酸代谢的改变。 此外，与激素非反应性细胞相比，雄激素反应性前列腺癌细胞中也观察到氨基酸代谢的显著变化。 后者促使我们研究雄激素在向前列腺癌细胞注入氨基酸依赖性中的作用。 正如预期的那样，代谢数据和生物过程富集分析都证实了前列腺癌中氨基酸代谢过程的升高。 此外，这些也揭示了雄激素治疗前列腺癌细胞甲基化潜能的改变。 这一结果与我们早期发现的转移性前列腺癌代谢组的甲基化潜能升高有关，非常有趣 [27] 此外，已知甲基化诱导的表观遗传学变化是癌症进展的原因 [34] , [35] , [36] , [37] , [38] , [39] , [40] 此外，前列腺癌中雄激素受体的表达长期以来被认为部分受甲基化调控 [41] , [42] , [43] , [44] , [45] 根据这些研究，我们的结果表明雄激素在刺激甲基化潜能中的作用是有趣的。 我们认为，这可能是前列腺癌细胞对氨基酸利用增加的结果，可能受到雄激素的影响。 我们使用代谢表型微阵列证实了这一点，该微阵列显示雄激素治疗后前列腺癌细胞对氨基酸的利用随时间而增加，糖和核苷酸代谢途径的稳态活性没有任何明显变化。 氨基酸代谢的增加包括蛋氨酸的有效利用，蛋氨酸可以产生较高水平的SAM，即细胞的甲基化货币。 有趣的是，OCM对细胞系和前列腺癌组织之间一致的代谢特征的分析描述了蛋氨酸代谢和SAM活性的富集，支持上述前提。 此外，雄激素治疗后前列腺癌细胞中甲基化代谢物如N-甲基甘氨酸、肌氨酸、2-甲基戊二酸、二甲基甘氨酸和甲基丙氨酸等水平升高，以及甲基转移酶如EZH2、， 转移性疾病。 从临床角度来看，雄激素在提高癌细胞甲基化潜能中的作用可能对治疗药物的开发有意义 [46] 这一前提得到了使用5-Aza-2′-脱氧胞苷的体外研究的支持，这些研究表明前列腺癌细胞克隆原性降低 [47] .
总之，我们描述了前列腺癌细胞系中雄激素调节的代谢组（雄激素诱导的代谢组改变），并将其与前列腺衍生组织（包括良性、局限性肿瘤和转移性疾病）进行比较。 我们的结果表明雄激素在调节前列腺癌细胞氨基酸代谢和甲基化潜能方面具有潜在作用。
支持信息 图S1 发现阶段使用的代谢组学分析平台的再现性。 使用正电离在Q-TOF上分析的五个技术复制品的12种代谢物标准混合物的色谱再现性。
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图S2 我们的“ARD与ARI细胞系中改变的代谢谱”代谢组谱的分子概念分析网络视图（灰色节点）。 每个节点代表一个分子概念或一组生物相关基因。 节点大小与概念中的基因数量成正比。 每个边缘代表统计学上显著的富集（FDR q值<0.2）。 黄桥表明了描述“氨基酸代谢”的丰富概念。
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图S3 表中描述了代谢组特征的一致性，该特征区分雄激素依赖性PCa细胞和雄激素依赖型细胞，以及雄激素诱导的VCaP细胞和前列腺衍生组织的代谢组特征。
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图S4 对PCa细胞系和器官相关肿瘤/转移性疾病之间12种代谢物特征一致性的肿瘤素概念图（OCM）分析，描述蛋氨酸代谢、甲基化和烟酰胺代谢。
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表S1 的列表 挑选出来的 前列腺癌细胞株特异性代谢组特征丰富了分子概念。
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表S2 的列表 全部的 前列腺癌细胞株特异性代谢组特征丰富了分子概念。
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表S3 的列表 全部的 用10 nM R1881处理VCaP细胞24小时后，分子概念得到了丰富。
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表S4 的列表 全部的 由PCa细胞系和组织之间一致的12种代谢物特征丰富的概念。
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致谢 作者感谢Sitaram Gayathri和Akula Sureshkumar提供的技术援助。
脚注
竞争利益： 提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金： 这项工作得到了美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）拨款RO1CA133458-04（AS）、1 R03 CA139489-01（AS）和RCA145444A（AS），多丽丝·杜克基金会（Doris Duke Foundation）和分子表型核心（Molecular Phenotyping Core）以及DK089503（全部给SP）的部分支持。 AS得到乔治亚癌症研究杰出科学家奖的支持。 该项目还得到了安捷伦科技公司的支持，该公司提供了方法学指导。 TS和SF受雇于安捷伦科技。 本研究未收到额外的外部资金。
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