跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
神经胶质生物学。作者手稿；PMC 2012年6月16日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经胶质生物学。2010年8月；6(3): 183–191.
2010年12月16日在线发布。 数字对象标识：10.1017/S1740925X10000219
预防性维修识别码：项目经理136572
尼姆斯：美国国立卫生研究院280425
PMID：21205365

用改进的膜靶向GCaMP报告子监测星形胶质细胞钙微区

EIJI SHIGETOMI公司,1 塞巴斯蒂安·克拉昆,1和BALJIT S.卡赫1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

星形胶质细胞参与大脑中的突触和脑血管调节。这些功能由细胞内钙信号调节，这被认为反映了星形胶质细胞的一种兴奋性。在最近的一项研究中，我们报道了用膜栓系结构域Lck修饰基因编码的钙指示剂（GECI）GCaMP2以生成Lck-GCaMP2。这种GECI使我们能够检测到新的微域钙信号。微域在性质上是随机的和“斑点状”的。为了更可靠地检测此类信号，在本研究中，我们进一步修改了Lck-GCaMP2，使其携带GCaMP2部分的三个突变（EGFP中的M153K、T203V和CaM域中的N60D），以生成Lck-GCaMP3。我们直接比较了Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3，评估了它们监测几种类型星形胶质细胞钙信号的能力，重点是斑点微区。我们的数据表明，就基本荧光强度、信噪比和微区检测能力而言，Lck-GCaMP3比Lck-GCaMP2好2-4倍。因此，Lck-GCaMP3的使用代表了一种监测星形胶质细胞钙信号（包括微域）的显著改进方法，并将促进对其分子机制和生理作用的详细探索。

关键词：胶质细胞、神经元、相互作用、信号传递

简介

星形胶质细胞是胶质细胞，被认为可以瓦解中枢神经系统并为神经元提供必要的支持功能(菲尔兹，2004年;科菲吉和纽曼，2004年;Magistretti，2006年). 也有越来越多的证据表明星形胶质细胞参与突触功能(阿拉克等。, 1999)调节血流以满足神经元活动的需求(戈登等。, 2007;Iadecola和Nedergaard，2007年).

与神经元不同，星形胶质细胞不易电兴奋，也不会在其过程中激发或传播动作电位（AP）(史密斯，1992年). 然而，星形胶质细胞被认为以细胞内钙浓度增加的形式表现出兴奋性，这种增加被认为在神经元网络中具有响应性、指导性和/或调节性作用(史密斯，1992年;Fields，2004年). 事实上，已知存在星形胶质细胞钙升高体内(平濑作五郎等。, 2004;王等。, 2006;董贝克等。, 2007;哥贝尔等。, 2007;贝卡尔等。, 2008;舒默（Schummers）等。, 2008)和人脑切片中的星形胶质细胞(奥伯海姆等。, 2009). 目前也已明确，星形胶质细胞钙瞬变自发发生，并可通过神经元AP放电和神经递质释放而增加(菲亚科等。, 2009). 因为钙是无处不在的第二信使(Clapham，2007年)星形胶质细胞钙兴奋性的存在越来越被认为是触发其与其他细胞（如胶质细胞、神经元和/或血管）交流的一种手段。然而，脑钙依赖性星形胶质细胞对神经元的信号传导仍存在争议，有支持和反对的证据(帕尔普拉等。, 1994;帕斯蒂等。, 1997;Fellin公司等。, 2004;菲亚科等。, 2007;李等。, 2007;佩特拉维茨等。, 2008;戈登等。, 2009;阿古尔洪等。, 2010;古林（Gourine）等。, 2010;亨尼伯格等。, 2010). 此外，过去的工作表明星形胶质细胞钙瞬变与其触发胞吐的能力之间的关系(Bowser和Khakh，2007年)并向神经元发出信号(茂富等。, 2008)不是二进制的，可能受钙信号的类型、位置和持续时间的影响。同样，研究表明，星形胶质细胞过程中的钙信号与体细胞中的测量值无关(净值等。, 2002;茂富等。, 2010)另一项研究为钙信号通过星形胶质细胞过程控制突触功能提供了有力证据(戈登等。, 2009). 因此，人们越来越认识到，星形胶质细胞钙信号可能比迄今为止认识到的更加多样化和异质性。这些问题已被广泛讨论(Lee和Haydon，2007年;Tritsch和Bergles，2007年;阿古拉洪等。, 2008;巴雷斯，2008年;菲亚科等。, 2009;Halassa和Haydon，2010年;汉密尔顿和阿特维尔，2010年)，提高对改进方法的认识，以无创监测星形胶质细胞钙信号的多样性。

基因编码钙指示剂（GECI）蛋白家族在结合钙时产生光信号(科特利科夫，2007年;雇佣等。, 2008). 利用星形胶质细胞中表达的基于荧光共振能量转移（FRET）的GECI扩展先前的工作(阿特金等。, 2009)为了测量星形胶质细胞突起和近膜区的钙信号，我们最近报道了一种改进的遗传方法，该方法使用一种称为Lck-GCaMP2的膜系留GECI(茂富等。, 2010). 这位记者结合了一种特征鲜明的基于EGFP的钙指示剂（GCaMP2）(Nakai公司等。, 2001;李等。, 2006;塔利尼等。, 2006)具有来自Lck蛋白酪氨酸激酶的强膜靶向双酰化基序（Lck）(兹拉特金等。, 1997;贝内迪克松等。, 2005). 使用传统的宽场表观荧光显微镜，Lck-GCaMP2的使用使我们能够监测星形胶质细胞过程中的钙信号，从而识别出细胞溶质钙指示剂（如GCaMP2）完全缺失的频繁且高度定位的近膜钙微域(茂富等。, 2010).

星形胶质细胞钙微结构域的随机性、秒时标性、微型性、“斑点”性和跨膜性使这些新事件更难检测到与更大且有充分记录的“全球”星形胶质细胞钙化信号相关的信号，如由G蛋白偶联受体激活触发的信号(菲亚科等。, 2009)从而挫败了确定其分子身份和生理作用的尝试。在本研究中，我们探索了进一步改进Lck-GCaMP2的方法，从而提高其监测近膜星形胶质细胞钙微区的能力。我们通过探索细胞溶质GCaMP3的最新进展实现了这一点(田等。, 2009;Seelig公司等。, 2010)结合Lck域标记的演示实用程序(贝内迪克松等。, 2005;茂富等。, 2010).

目标

本研究的目的是确定Lck-GCaMP2是否可以通过引入最近报道的细胞溶质GCaMP2中的三点突变来提高其监测星形胶质细胞钙信号的能力，以提高其追踪神经元中AP的能力(田等。, 2009).

方法

分子生物学

Lck-GCaMP2可从以前的工作中获得，并由最近描述的GCaMP2生成(茂富等。, 2010). 通过对Lck-GCaMP2进行三轮定点突变（Quick-Change，Stratagene）产生Lck-GCaMP3，从而依次引入以下单位点突变：M153K、T203V（EGFP中）和N60D（CaM中）(田等。, 2009). 使用了以下引物：

  • M153K:（+）CGAGAACGTCTATATCAAGCCCGAGAGAGAGAAG，
  • （−）CTTCTGCTTGTCGGCCTGATAGACGTCCG；
  • T203V：（+）CAACACTACCTGAGTGCCAGTCAGTCAAAACTTTCG，
  • （−）cgaaagttggactggacgctcaggttagtgtgttg；
  • N60D:（+）GTAGATGCCGCGGTGATGCACAATCGACTTC，
  • （−）GAAGTCGATTGTCCATCACCGTCGGCATCTAC

所有干预和最终构建均通过DNA测序进行验证。Lck-GCaMP2已存放在Addgene(网址：www.addgene.org)用于分配；Lck-GCaMP3也将同样可用。

HEK-293细胞培养

HEK-293细胞（取自ATCC）维持在75 cm2在DMEM/F12培养基中的细胞培养瓶中加入补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的谷氨酰胺（Invitrogen）。细胞生长在95%空气/5%CO的增湿环境中2在37°C的细胞培养箱中。当细胞汇合达到60-90%时，细胞分裂率为1/10，通常每3-4天。在转染前3-4天分裂时，通过在六孔板上电镀细胞来制备转染细胞。它们以60-90%的融合率转染。对于HEK-293中的瞬时表达，我们使用0.5–1μg质粒cDNA和效应基因转染试剂（Qiagen）对六孔板的每个孔进行转染。按照制造商的说明，每次转染使用4μl增强子和10μl效应基因。用于测定Lck-GCaMP2钙Kd的缓冲钙溶液在HEK细胞缓冲液中制备（mM:150 NaCl，1 MgCl2，10 D-葡萄糖，10 HEPES，1 EGTA，pH7.5（用NaOH调节），借助MaxChelator程序(贝尔斯等。, 1994)计算CaCl的量2添加以达到特定的最终浓度。为了实现渗透，用0.1%TritonX-100（无钙）处理细胞15–30秒。然后用零钙缓冲液清洗细胞三次，并按如下所述进行成像。

表观荧光显微镜

简单地说，我们使用了一台配备IXON DV887DCS EMCCD相机（Andor）、外荧光聚光镜、控制单元和多色V单色仪（TILL Photonics）的Olympus IX71显微镜。使用TILLVision软件实现了对激励和图像采集的控制。我们使用了奥林巴斯60X1.45 NA物镜。图像通常每一秒钟拍摄一次。对曝光时间和像素分格进行了优化，以可视化每个实验的荧光信号（最大分格为4×4）。用记录缓冲液（110 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl）灌注培养物2，0.8 mM氯化镁210 mM D-葡萄糖，10 mM HEPES，pH 7.4（用NaOH调节）。

海马星形胶质细胞-神经元培养

海马培养物的制备如下所述(Shigetomi和Khakh，2009年). 简单地说，每周在P1-2（Charles River）的两只幼鼠被用于每次解剖的海马培养。在本研究报告的实验中，我们在一年的实验过程中使用了来自42只幼鼠的105张盖玻片。在装有冰冷培养基的培养皿中解剖海马。将解剖后的海马（在培养基中，在冰上）切开，然后在37°C下用20 U/ml木瓜蛋白酶消化11–13分钟（沃辛顿papain-022）。孵育后，用预先加热的培养基清洗碎片，并用孔径逐渐变小的火焰抛光吸管研磨；使用120000个电池（22 mm盖玻片，VWR）或20000个电池（12 mm盖玻片，VVR）在每个盖玻片上电镀。盖玻片之前涂有聚-D-赖氨酸（50μg/ml；Sigma），然后在无菌解剖培养基中涂400μl（对于22 mm盖玻片）或100μl（针对12 mm盖玻片）20μg/ml层粘连蛋白（Sigma。电镀后一小时，用2ml预热培养基喂养细胞。

星形胶质细胞转染

转染前，取下一半培养基，用预先加热到37°C超过30分钟的新鲜培养基喂养星形胶质细胞。取下的培养基补充等量的新培养基，并保存在细胞培养箱中（这是“喂养和调节培养基”）。在EFS实验中，我们使用基于神经基础的培养基来保持神经元健康。我们在培养的4-6天用Effectene转染试剂（Qiagen）或Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染星形胶质细胞。实验在转染后3天内进行。

激动剂应用和电场刺激

使用华纳仪器VC-8阀门控制器将药物涂敷在单个细胞上，或涂敷在浸泡介质中玻璃盖玻片上的所有细胞上（2–3 ml/min）。如前所述，我们使用了一个显微镜载物台玻璃底室，内置铂电极（华纳仪器）连接到Grass S88刺激器，用于野外刺激(里奇勒等。, 2008). 我们使用100μs的脉冲宽度和30 Hz的刺激频率（刺激强度为85–90 V）。对于EFS实验，我们使用了静态浴。

数据分析

使用ImageJ（NIH）和Clampfit 10.2（Molecular Devices Inc.）进行图像分析。收集基线区域平均值的两个标准偏差以上的钙信号进行分析。所有统计测试都在GraphPad Instat 3.06（GraphPad-Software Inc.）和OriginPro 8（OriginLab Corp.）中运行，这两个软件也用于创建图形。统计显著性在P（P）值<0.05。在Origin Pro 8中使用Hill方程分析了Lck-GCaMP3处钙依赖性荧光增强的钙浓度-效应曲线。这些数字是在CorelDraw 12中组装的。数据显示为平均值±标准误差n个实验如文中所示。

结果

Lck-GCaMP3及其与Lck-GCaMP2的关系

GCaMP是一种基于基因编码的循环排列GFP的钙传感器，当钙离子结合时可增加其荧光产量(Nakai公司等。, 2001;科特利科夫，2007年). 根据最初的报告，GCaMP随后进行了优化，以确保在体温和更大的信噪比下的稳定性，从而生成GCaMP2(塔利尼等。, 2006). 反过来，细胞溶质GCaMP2(图1A)是最近三项旨在改善其作为特定应用的GECI性能的研究的起点(德鲁斯蒂等。, 2009;田等。, 2009;茂富等。, 2010). 一项研究将GCaMP2用作突变靶点，并通过引入四点突变产生GCaMP3，这与GCaMP1相关，显示了追踪神经元AP的改进(田等。, 2009). 其中一个突变删除了GCaMP2第2位的N末端精氨酸，两个突变（M153K，T203V）映射到荧光团EGFP结构域，一个突变（N60D）位于C末端CaM结构域(田等。, 2009). 第二项研究将GCaMP2与突触素融合，产生SyGCaMP2，SyGCaMP2与神经元突触囊泡相连，用于监测突触组的活动(德鲁斯蒂等。, 2009). 在我们最近的研究中，我们将26个残基Lck结构域融合到细胞溶质GCaMP2的N末端，以生成膜靶向Lck-GCaMP2，我们在HEK-293细胞中对其进行了表征，并利用其监测星形胶质细胞体和过程中的近膜钙动力学(茂富等。, 2010).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms280425f1.jpg
Lck-GCAMP3的设计和特性

（A） 细胞溶质GCaMP2、Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3的示意图。如绿色圆圈所示，Lck-GCaMP3是通过向Lck-GCaMP2中引入三个点突变而制成的。这里用于突变的编号系统不是基于线性序列中残基的位置，而是基于GCaMP2每个模块组件中突变的位置(田等。, 2009). Lck-GCaMP结构中的结构域大小并没有显示在氨基酸长度的线性范围内。（B） 表达Lck-GCaMP3（九个视场的代表）的两个HEK-293细胞的代表性图像和线条轮廓。注意，荧光强烈地位于细胞膜附近的边缘。（C） 利用渗透性HEK-293细胞研究Lck-GCaMP3的钙敏感性(n个=11–30个单元格，15个盖玻片）。误差条代表s.e.m.明显的相似性(Kd日)和Ca的希尔系数（nH）2+Lck-GCaMP3与Lck-GCaMP2相似（见正文）。

我们试图利用GCaMP3的进展来确定Lck-GCaMP2是否可以改进为一种膜系留探针来监测微域星形胶质细胞钙信号(茂富等。, 2010). 在用于从GCaMP2生成GCaMP3的四个突变中，我们将三个突变引入Lck-GCaMP2（EGFP中的M153K和T203V，CaM中的N60D；图1A). 我们没有去除GCaMP2第2位的N-末端精氨酸，因为在Lck结构域中，该残基不再是N-末端，因此不太可能导致蛋白质失稳(田等。, 2009). 根据过去的命名法，我们将我们修改后的GECI Lck-GCaMP3命名为(图1A). 然而，我们强调Lck-GCaMP3中的GCaMP部分与细胞溶质GCaMP3不同，在RSET结构域中启动蛋氨酸后有一个精氨酸残基(田等。, 2009).

为了进行初步评估，我们在HEK-293细胞中表达Lck-GCaMP3，并用共焦显微镜进行成像(图1B). 我们发现Lck-GCaMP3在HEK-293细胞边缘强烈表达，线条轮廓显示两个细胞交界处的荧光强度是单个HEK-292细胞边缘预期的两倍(图1B;n个= 9). 使用渗透性HEK-293细胞，我们还发现Lck-GCaMP3作为钙传感器，具有明显的钙EC50153 nM和~4的协同性(图1C;n个=每点11–30）。这两个值分别接近我们和其他人之前对Lck-GCaMP2和GCaMP2的估计(塔利尼等。, 2006;茂富等。, 2010). 因此，Lck-GCaMP3显示出比胞质GCaMP3更高的表观钙敏感性(田等。, 2009).

Lck-GCaMP3测量全球星形胶质细胞钙信号

我们在培养的星形胶质细胞中表达Lck-GCaMP3，并与Lck-GCaMP2进行比较(图2). 与之前Lck-GCaMP2的研究一致，这两种GECI在星形胶质细胞中均稳定且均匀表达(图2A)斑点、胞内小泡或高密度簇无明显表达(茂富等。, 2010). 正如预期的那样，通过分析表观荧光图像显示的星形胶质细胞的二维区域，如图2A在7510±1910μm表达Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3的细胞之间没有差异2(n个=8）和5240±688μm2(n个=25），这意味着星形胶质细胞的形状和大小正常(茂富等。, 2010). 然而，表达Lck-GCaMP3的星形胶质细胞的图像比通过检测星形胶质细胞每像素荧光强度的分布来评估的表达Lck/GCaMP2的图像要亮两倍(P（P）= 0.024;图2A;表1). 我们的解释是，Lck-GCaMP3的基础荧光高于Lck-GCaMP2(表1)，可能是因为第2位的精氨酸与N末端的距离(田等。, 2009).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms280425f2.jpg
星形胶质细胞中Lck-GCaMP3和Lck-GCaMP2基础荧光和ATP诱发钙信号的比较

（A） Lck-GCaMP2的代表性图像(n个=30个细胞，5个盖玻片）和表达Lck-GCaMP3的星形胶质细胞(n个=30个电池，6个盖玻片）。Lck-GCaMP3比Lck-GCaMP2明亮。直方图显示了表达Lck-GCaMP2和3的星形胶质细胞的荧光强度（参见表1对于平均数据）。（B） 应用ATP（30μM）之前（对照）和期间表达Lck-GCaMP2和3的星形胶质细胞的代表性图像。注：在应用ATP之前和期间，Lck-GCaMP3的荧光比Lck-GCaMP2的荧光更亮。（C） 轨迹显示Lck-GCaMP2的强度与时间曲线(n个=10–12个电池，四个盖玻片）和Lck-GCaMP3(n个=10–11个细胞，3–4个盖玻片），在暴露于ATP和谷氨酸之前、期间和之后表达星形胶质细胞。

表1

用Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3在星形胶质细胞中收集的数据摘要。

Lck-GCaMP2型
Lck-GCaMP3
折叠更改
荧光T型0.5（s）荧光T型0.5（s）
平均值±s.e.m。平均值±标准误差。n个平均值±标准误差。平均值±标准误差。n个
基线（a.u.）*642±56—301206 ± 154—301.8*
ATP峰值信号（d如果/如果)†0.84 ± 0.042.9 ± 0.2392.7 ± 0.153.5 ± 0.2443.2*
谷氨酸峰值信号（d如果/如果)‡1.0 ± 0.12.1 ± 0.1173.3 ± 0.43.6 ± 0.2103.3*
EFS信号（d如果/如果)
1个AP0.36 ± 0.0817 ± 4.781.5 ± 0.3512.2 ± 5.074.2*
90名AP0.98 ± 0.1321 ± 14143.0 ± 0.4729 ± 7.7133.1*
微域（d前/后)
联营0.50 ± 0.013.9 ± 0.25151.45 ± 0.082.6 ± 0.31522.8*
躯体事件0.46 ± 0.014.0 ± 0.24271.24 ± 0.092.2±0.271092.6*
流程中的事件0.68 ± 0.043.7 ± 0.4881.99 ± 0.162.2±0.27432.9*

-表示无法测量此参数。a.u.表示12位标度上的任意荧光单位。

*表明Lck-GCaMP3和Lck-GCaMP2在荧光信号方面存在显著差异(P（P）< 0.05). 从这些值中减去背景荧光，得到12位尺度上的Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3信号。
†30μM ATP诱发的反应。
‡300μM谷氨酸诱发的反应。

接下来，我们确定了Lck-GCaMP3与Lck-GCaMP2在监测先前用胞浆钙指示剂染料测量的具有良好特征的全局细胞内钙升高方面的比较(菲亚科等。, 2009). 因此，我们使用30μM ATP作为P2Y来激活GPCR1作为星形胶质细胞代谢性谷氨酸受体激动剂的激动剂和300μM谷氨酸(Fields and Burnstock，2006年;菲亚科等。, 2009;茂富等。, 2010) (图2B). 我们绘制了应用ATP和谷氨酸前后整个星形胶质细胞的Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3荧光强度，并测量了峰值d如果/如果(图2C、D). 用Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3测量的ATP和谷氨酸诱发的钙瞬变在上升时间、形状和衰减方面定性相似，但在这些GECI之间在峰值d方面存在显著差异如果/如果(图2;表1). TTX（1μM）对神经元AP放电的阻断并未显著改变星形胶质细胞对ATP或谷氨酸的反应，因为峰值反应幅度为105±4%(n个=8个细胞）和93±5%(n个=12个细胞）。这与之前的工作一致，表明ATP和谷氨酸都激活星形胶质细胞上的受体(茂富等。, 2010). 因此，用Lck-GCaMP3测得的ATP和谷氨酸诱发反应比用Lck/GCaMP2测得的要大三倍，这意味着Lck-GCaMP3显示出更有利的信噪比(表1).

利用描述的条件，我们采用海马神经元和星形胶质细胞共培养，并确定Lck-GCaMP3是否可以监测神经元向星形胶质细胞释放神经递质所介导的信号传递(里奇勒等。, 2008;茂富等。, 2010). 在过去工作的基础上，我们使用电场刺激（EFS）来激发培养的海马神经元释放ATP，并测量了星形胶质细胞在30 Hz、3 s内诱发1和90个AP时的反应(图3). 峰值d如果/如果30例AP高于1例AP，但Lck-GCaMP3在两种情况下均高于Lck-GCaMP2(图3;表1). 综上所述，这些实验表明，Lck-GCaMP3显示出比Lck-GCaMP2更高的基础荧光，并且由于GPCR激活和AP介导的神经递质释放到星形胶质细胞上，显示出更大的钙整体升高信号。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms280425f3.jpg
神经元EFS期间表达Lck-GCaMP3的星形胶质细胞的反应

（A） EFS前后星形胶质细胞表达Lck-GCaMP3的典型图像。（B） 来自四个盖玻片的13个星形胶质细胞的痕迹（灰色）及其叠加的平均值（黑色）显示了EFS期间的Lck-GCaMP3反应。条形图总结了平均数据（参见表1).

Lck-GCaMP3监测星形胶质细胞中的局部斑点钙信号

利用Lck-GCaMP2结合EPI显微镜，我们最近报道并表征了自发近膜星形胶质细胞钙微结构域的性质(茂富等。, 2010). 由于几个原因，这些事件很有趣，但检测起来很有挑战性。首先，使用表观荧光显微镜，细胞溶质GCaMP2没有检测到微域钙信号，很可能是因为它们代表了膜平面附近的钙通量(茂富等。, 2010). 此外，微域被定位（宽度约为5μm），并且相对于通常覆盖整个细胞并持续数十秒的全局信号而言，微域很短（持续约1.5秒）(菲亚科等。, 2009). 鉴于微域的这些特征，我们有兴趣确定Lck-GCaMP3是否可以报告微域钙信号，以及GECI是否改善了这些单位样事件的信噪比。使用Lck-GCaMP3，我们很容易在星形胶质细胞中观察到大量、短暂和斑点状的钙信号（参见在线补充电影1和图4). 微区显示全宽半最大4.8±0.6μm(n个= 7;图5A)，远大于我们的显微镜在0.4μm处的点扩散功能(茂富等。, 2010).图4A显示了使用Lck-GCaMP3和图5B比较Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3的记录：从原始数据和分析的微区痕迹可以明显看出Lck-GCaMP3的改进(图5B). 中的累积概率图图5C和中的平均数据表1显示峰值d如果/如果用Lck-GCaMP2测量的微畴值(n个=515）和Lck-GCaMP3(n个=152）表明Lck-GCaMP3显著提高了信噪比(P（P）将这两种分布与Kolmogorov–Smirnoff统计数据或未配对学生的t吨-测试；表1). Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3测定的微区动力学没有显著差异(P（P）= 0.781;图5D;表1). 此外，与Lck-GCaMP2（21%）相比，Lck-GCaMP3（43%）的细胞显示出斑点状钙信号的比例更大，这表明信噪比的提高(图5B、C)导致检测能力提高了两倍。与此一致，Lck-GCaMP3报告了每个细胞更多的微域信号（每个细胞2.1±0.4个事件；n个=19）比Lck-GCaMP2（每个细胞1.3±0.3个事件；n个=8），尽管这没有达到统计显著性。在我们过去的研究中，在星形胶质细胞胞体和从星形胶质细胞体延伸20μm以上的突起中观察到微结构域（76%）(茂富等。, 2010). 后一种微区独立于星形胶质细胞胞体中测得的瞬变，其振幅大约60%，但其基本性质没有其他实质性差异(表1). 总的来说，这些数据表明，与Lck-GCaMP2相比，Lck-GCaMP3更适合检测和量化星形胶质细胞钙微结构域，并且不会检测到改变其动力学(图4).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms280425f4.jpg
用Lck-GCaMP3测量星形胶质细胞的微域信号

（A） 以1赫兹采集的300帧电影的最大投影图像（参见在线补充电影1）。显示了六个感兴趣的区域（如1-6）。这六个ROI的强度分布如右图所示。（B） 对于ROI 6，在面板A中的图的200到300秒之间的静止帧。微域钙信号肉眼可见。图像之间的时间间隔为1秒。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms280425f5.jpg
比较Lck-GCaMP3和Lck-GCaMP2监测星形胶质细胞微域钙信号的能力

（A） A和d如果/如果使用Lck-GCaMP3在星形胶质细胞中自发钙信号的图像。虚线显示了成像星形胶质细胞的轮廓，白色箭头指向一个微区。请注意，高信噪比使微域的视觉检测成为可能。中间的图像是另外四个自发钙信号的例子(如果图像）。右图显示了事件半最大值的全宽(n个=7个站点）。（B） Lck-GCaMP2（灰色）和Lck-GCaMP3（黑色）的5个ROI的强度与时间曲线。请注意，Lck-GCaMP3中的信噪比有所提高。（C） 钙微区峰d的累积概率图如果/如果使用Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3测量的值。（D） 与C中相同，但对于微域T型0.5值（请参见表1平均值和统计文本）。

结论

  • Lck-GCaMP3显示出比Lck-GCaMP2高两倍的基础荧光。
  • 对于各种星形胶质细胞钙信号，Lck-GCaMP3的信噪比比Lck-GCaMP2高3-4倍。
  • Lck-GCaMP3在检测和准确监测星形胶质细胞微域钙信号的能力上明显优于Lck-GCaMP2。

讨论

本研究的主要发现是，Lck-GCaMP3是一种固定在质膜上的精制基因靶向钙传感器，可用于监测几种不同类型的星形胶质细胞钙信号，特别适用于监测由于跨膜钙通量而导致的星状胶质细胞斑点微区。

在Lck-GCaMP2中引入三点突变以产生Lck-GCaMP3，显著提高了GECI的基础荧光（增加约2倍）和动态范围（增加约3-4倍），而不改变膜靶向性或明显改变钙敏感性(图1). 我们不知道为什么Lck-GCaMP3（153 nM）的表观钙敏感性高于先前报道的细胞溶质GCaMP3（660 nM）值(田等。, 2009)，但一种可能性是，与洗涤剂中纯化的GCaMP3蛋白相比，渗透细胞中钙依赖性的测量（如本文所述）存在实验差异(田等。, 2009). 这些问题之前已经讨论过(雇佣等。, 2008). 我们的Lck-GCaMP3表观钙敏感性值为153 nM，与我们（168 nM）和其他人（146 nM(塔利尼等。, 2006;茂富等。, 2010). 毫无疑问，Lck-GCaMP3和GCaMP3数百毫摩尔范围内的钙敏感性都适合检测星形胶质细胞体和小体积（如其精细过程）中的生理钙增加。尽管目前可用的GECI存在次优响应动力学问题(雇佣等。, 2008)，这对于它们用于研究不显示毫秒时间尺度瞬变但显示持续秒数的钙信号的星形胶质细胞来说不是一个问题(菲亚科等。, 2009). 总的来说，这里报告了Lck-GCaMP2和Lck-GCaMP3之间的改进(表1)与Looger实验室报道的胞质GCaMP3高于GCaMP2的结果一致(田等。, 2009)，进一步证实了Lck结构域作为GECI的强膜系带在功能上无害的观点(茂富等。, 2010).

我们的实验表明，与Lck-GCaMP2相比，Lck-GCaMP3提供了更精确的星形胶质细胞钙微域读数。首先，d如果/如果Lck-GCaMP3微域信号比用Lck-GCaMP2测量的信号大三倍。其次，Lck-GCaMP3显示微域信号的细胞比例是Lck-GCaMP2成像细胞的两倍。第三，Lck-GCaMP3存在每个细胞更多微结构域信号的趋势。最简单的解释是，这些结果表明，Lck-GCaMP2的使用遗漏了一些钙微域事件，并且Lck-GCaMP3提供了更好的方法来检测星形胶质细胞中动态范围和事件数量方面的钙微域信号。

Lck-GCaMP3的当前发现补充了Lck-GCaMP2的最新研究(茂富等。, 2010)以及星形胶质细胞中表达的基于FRET的细胞溶质GECI(阿特金等。, 2009). 我们过去的工作表明，Lck-GCaMP2在报告星形胶质细胞钙微区方面比细胞溶质GCaMP2好14倍，而目前的实验表明，Lck-GCaMP3比Lck-GCaMP2好3倍。从星形胶质细胞钙信号的角度来看，细胞溶质GECIs和Lck-GCaMP2都是足够的，并且提供了一个易于测量的动态范围，以检测通过药物或神经元内AP放电诱发的全局信号。然而，我们认为Lck-GCaMP3是GECI的首选（迄今为止可用的GECI），用于测量星形胶质细胞中随机、秒级、微型、斑点状和跨膜微域钙信号，特别是在精细过程中。现在可以利用这一特征来探索星形胶质细胞钙微结构域的分子特性和生理意义体内通过病毒转导和小鼠遗传学。以下各项的组合体内双光子显微镜下Lck-GCaMP3的表达应能更精确地观察和更好地理解来自胞体的星形胶质细胞突起中的钙信号，以及突触附近的精细突起和血管附近星形胶质细胞终末足中的钙信息。因此，通过测量星形胶质细胞过程中的钙信号，Lck-GCaMP3的使用应该可以揭示胶质细胞-神经元和胶质细胞-血管相互作用的细节和生理作用。

通过重新设计和/或突变，荧光蛋白和GECI不断得到改进。很可能在不久的将来，新一代GECI将可用。GCaMP2的高分辨率结构(罗德里格斯·吉尔贝等。, 2008;王等。, 2008;阿克布姆等。, 2009)利用不同的膜靶向策略和结构驱动优化的最新进展表明，它对设计工程特别有用(李等。, 2006;德鲁斯蒂等。, 2009;田等。, 2009;西利格等。, 2010;茂富等。, 2010;威洛比等。, 2010). 从这个角度来看，平均d如果/如果(~150%;表1)对于用Lck-GCaMP3测量的星形胶质细胞中的钙微结构域如果/如果GCaMP3测量海马锥体神经元中一个和两个AP分别在约40%和约185%放电时的值(田等。, 2009). 因此，星形胶质细胞可能提供一种有用的细胞类型，用于以高通量格式筛选GCaMP3突变库，因为培养的星形胶质细胞在光学显微镜下呈现相对平坦均匀的表面，并且具有非重叠的区域(哈拉萨等。, 2007)允许将光信号明确分配给单个单元。此外，星形胶质细胞可以很容易地在细胞培养中维持(Shigetomi和Khakh，2009年)进行细胞分裂，易于转染，并容易被GFAP和S100β等细胞特异性启动子靶向(布伦纳等。, 1994;阿特金等。, 2009). 最后，这里和过去工作中提供的数据(茂富等。, 2010)表明星形胶质细胞具有自发的斑点状钙微结构域，不需要化学或电气干预即可启动，从而最大限度地减少筛选过程中的实验干预。这些特性的结合可能有助于设计用于快速测试GECI突变库的初步筛选分析。

致谢

感谢MV Sofroniew博士和加州大学洛杉矶分校天体细胞生物学和生物物理亲和小组成员的讨论。感谢Loren Looger博士（Janelia Farm Research Campus）预先打印了他们在GCaMP3上的工作。我们的工作得到了美国国立卫生研究院（NS071292、NS063186、NS060677）、白厅基金会和斯坦因-奥本海默捐赠奖（给B.S.K.）的支持。

脚注

利息清单

作者没有与这项工作有关的利益冲突。

补充材料

本文中提到的补充材料可以在journals.cambridge.org/ngb上找到。

工具书类

  • Agulhon C、Fiacco TA、McCarthy KD。海马的短期和长期可塑性不受星形胶质细胞Ca的调节2+发出信号。科学。2010;327:1250–1254.[公共医学][谷歌学者]
  • Agulhon C、Petravicz J、McMullen AB、Sweger EJ、Minton SK、Taves SR等。星形胶质细胞钙在神经生理学中的作用是什么？神经元。2008;59:932–946. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Akerboom J、Rivera JD、Guilbe MM、MalavéEC、Hernandez HH、Tian L等。GCaMP钙传感器的晶体结构揭示了荧光信号变化的机理，有助于合理设计。生物化学杂志。2009;284:6455–6464. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Araque A、Parpura V、Sanzgiri RP、Haydon PG。三部分突触：胶质细胞，未确认的伴侣。神经科学趋势。1999;22:208–215.[公共医学][谷歌学者]
  • Atkin SD、Patel S、Kocharyan A、Holtzclaw LA、Weerth SH、Schram V等。表达骆驼荧光钙的转基因小鼠2+星形胶质细胞和雪旺细胞中的指示剂可用于胶质细胞钙的研究2+信号就地和体内.神经科学方法杂志。2009;181:212–226. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Barres BA。胶质细胞的神秘与神奇：对其在健康和疾病中作用的透视。神经元。2008;60:430–440.[公共医学][谷歌学者]
  • Bekar LK，He W，Nedergaard M.蓝斑基因座α肾上腺素能介导的体内皮质星形胶质细胞活化。大脑皮层。2008;18：2789–2795。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Benediktsson AM，Schachtele SJ，Green SH，Dailey ME。器官型海马片培养中星形胶质细胞的弹道标记和动态成像。神经科学方法杂志。2005;141:41–53.[公共医学][谷歌学者]
  • Bers DM、Patton CW、Nuccitelli R.钙制备实用指南2+缓冲区。细胞生物学方法。1994;40:3–29.[公共医学][谷歌学者]
  • Bowser DN，Khakh BS。用全内反射荧光显微镜观察两种形式的单囊泡星形胶质细胞胞吐。美国国家科学院院刊。2007;104:4212–4217. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brenner M，Kisseberth WC，Su Y，Besnard F，Messing A.GFAP启动子在转基因小鼠中指导星形细胞特异性表达。神经科学杂志。1994;14:1030–1037. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Clapham DE。钙信号。单元格。2007;131：1047–1058。[公共医学][谷歌学者]
  • Dombeck DA、Khabbaz AN、Collman F、Adelman TL、Tank DW。用细胞分辨率对清醒、活动小鼠的大规模神经活动进行成像。神经元。2007;56:43–57. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dreosti E，Odermatt B，Dorostkar MM，Lagnado L.体内突触活动的基因编码报告人。自然方法。2009;6:883–889. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fellin T、Pascual O、Gobbo S、Pozzan T、Haydon PG、Carmignoto G。星形细胞谷氨酸通过激活突触外NMDA受体介导的神经元同步性。神经元。2004;43:729–743.[公共医学][谷歌学者]
  • Fiacco TA、Agulhon C、McCarthy KD。从药理学中梳理星形胶质细胞生理学。药理学和毒理学年度回顾。2009;49:151–174.[公共医学][谷歌学者]
  • Fiacco TA、Agulhon C、Taves SR、Petravicz J、Casper KB、Dong X等。原位选择性刺激星形胶质细胞钙不会影响神经元兴奋性突触活动。神经元。2007;54:611–626.[公共医学][谷歌学者]
  • Fields RD。大脑的另一半。科学美国人。2004;290:54–61.[公共医学][谷歌学者]
  • Fields RD，Burnstock G.神经元相互作用中的嘌呤能信号。自然评论神经科学。2006;7:423–436. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Göbel W，Kampa BM，Helmchen F.使用快速3D激光扫描三维成像细胞网络动力学。自然方法。2007;4:73–79.[公共医学][谷歌学者]
  • Gordon GR、Iremonger KJ、Kantevari S、Ellis-Davies GC、MacVicar BA、Bains JS。星形胶质细胞介导下丘脑谷氨酸突触的分布可塑性。神经元。2009;64:391–403. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gordon GR，Mulligan SJ，MacVicar BA。脑血管系统的星形胶质细胞控制。格利亚。2007;55:1214–1221.[公共医学][谷歌学者]
  • Gourine AV、Kasymov V、Marina N、Tang F、Figueiredo MF、Lane S等。星形胶质细胞通过依赖pH的ATP释放来控制呼吸。科学。2010;329:571–575. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Halassa MM、Fellin T、Takano H、Dong JH、Haydon PG。由单个星形胶质细胞的区域定义的突触岛。神经科学杂志。2007;27:6473–6477. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Halassa MM，Haydon PG。集成脑电路：星形细胞网络调节神经元活动和行为。生理学年鉴。2010;72:335–355. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hamilton NB，Attwell D.星形胶质细胞真的会分泌神经递质吗？自然评论神经科学。2010;11:227–238.[公共医学][谷歌学者]
  • Henneberger C，Papouin T，Oliet SH，Rusakov DA。长期增强依赖于星形胶质细胞释放D-丝氨酸。自然。2010;463:232–236. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hirase H，Qian L，Bartho P，Buzsaki G.体内皮质星形细胞网络的钙动力学。公共科学图书馆生物学。2004;2：E96。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 雇佣SA、Tian L、Looger LL。用基因编码的钙指示剂报告神经活动。脑细胞生物学。2008;36:69–86. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Iadecola C，Nedergaard M.脑微血管的胶质调节。自然神经科学。2007;10:1369–1376.[公共医学][谷歌学者]
  • Kofuji P，纽曼EA。中枢神经系统中的钾缓冲。神经科学。2004;129:1045–1056. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kotlikoff MI基因编码钙2+指标：利用遗传学和分子设计来理解复杂的生理学。生理学杂志。2007;578:55–67. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee CJ、Mannaioni G、Yuan H、Woo DH、Gingrich MB、Traynelis SF。突触NMDA受体的星形细胞控制。生理学杂志。2007;581:1057–1081. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee MY、Song H、Nakai J、Ohkura M、Kotlikoff MI、Kinsey SP等。局部亚质膜Ca2+系留Ca探测到的信号2+传感器。美国国家科学院院刊。2006;103:13232–13237. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee SY，Haydon PG。星形细胞谷氨酸靶向NMDA受体。生理学杂志。2007;581:887–888. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Magistretti私人。神经节代谢耦合与可塑性。实验生物学杂志。2006;209:2304–2311.[公共医学][谷歌学者]
  • Nakai J、Ohkura M、Imoto K。高信噪比Ca2+由单一绿色荧光蛋白组成的探针。自然生物技术。2001;19:137–141.[公共医学][谷歌学者]
  • Nett WJ、Oloff SH、McCarthy KD。海马原位星形胶质细胞表现出独立于神经元活动的钙振荡。神经生理学杂志。2002;87:528–537.[公共医学][谷歌学者]
  • Oberheim NA，Takano T，Han X，He W，Lin JH，Wang F，等。成人星形胶质细胞独特的类人特征。神经科学杂志。2009;29:3276–3287. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Parpura V、Basarsky TA、Liu F、Jeftinija K、Jeftinoja S、Haydon PG。谷氨酸介导的星形胶质细胞-神经元信号传导。自然。1994;369：744–747。[公共医学][谷歌学者]
  • Pasti L，Volterra A，Pozzan T，Carmignoto G。星形胶质细胞中的细胞内钙振荡：神经元和星形胶质细胞之间的高度可塑性双向原位通讯形式。神经科学杂志。1997;17:7817–7830. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Petravicz J、Fiaco TA、McCarthy KD。IP3接收器相关Ca损失2+海马星形胶质细胞的增加并不影响基线CA1锥体神经元突触活动。神经科学杂志。2008;28:4967–4973. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Richler E、Chaumont S、Shigetomi E、Sagasti A、Khakh BS。体外和体内传递门控P2X受体图像激活方法。自然方法。2008;5:87–93. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rodríguez Guilbe MM、Alfaro MalavéEC、Akerboom J、Marvin JS、Looger LL、Schreiter ER。基因编码荧光钙指示蛋白GCaMP2的结晶和初步X射线表征。结晶学报F辑，结构生物学和结晶通讯。2008;64:629–631. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Schummers J，Yu H，Sur M.调节星形胶质细胞的反应及其对视觉皮层血流动力学信号的影响。科学。2008;320:1638–1643.[公共医学][谷歌学者]
  • Seelig JD、Chiappe ME、Lott GK、Dutta A、Osborne JE、Reiser MB等。在光动行走行为期间，头戴式果蝇的双光子钙成像。自然方法。2010;7:535–540. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shigetomi E，Bowser DN，Sofroniew MV，Khakh BS。两种形式的星形胶质细胞钙兴奋性对NMDA受体介导的锥体神经元慢内向电流有明显影响。神经科学杂志。2008;28:6659–6663. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shigetomi E，Khakh BS。测量星形胶质细胞的近质膜和整体细胞内钙动力学。可视化实验杂志。2009;26:10.3791/1142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shigetomi E、Kracun S、Sofroniew MV、Khakh BS。一种用于监测星形胶质细胞过程中钙信号的基因靶向光学传感器。自然神经科学。2010;13:759–766. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Smith SJ。星形胶质细胞处理神经信息吗？脑研究进展。1992;94:119–136.[公共医学][谷歌学者]
  • Tallini YN、Ohkura M、Choi BR、Ji G、Imoto K、Doran R等。心脏中的细胞信号成像体内：高信号钙的心脏表达2+指标GCaMP2。美国国家科学院院刊。2006;103:4753–4758. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tian L，Hires SA，Mao T，Huber D，Chiappe ME，Chalasani SH等。用改进的GCaMP钙指标对蠕虫、苍蝇和小鼠的神经活动进行成像。自然方法。2009;6:875–881. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tritsch NX，Bergles DE。定义星形胶质细胞在神经调节中的作用。神经元。2007;54:497–500.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang Q，Shui B，Kotlikoff MI，Sondermann H。GCaMP2钙传感的结构基础。结构。2008;16:1817–1827. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 王旭，娄恩，徐强，田广发，彭伟光，韩旭，等.星形胶质细胞钙2+感觉刺激诱发的信号传导体内.自然神经科学。2006;9:816–823.[公共医学][谷歌学者]
  • Willoughby D、Wachten S、Masada N、Cooper DM。离散Ca的直接演示2+与腺苷酸环化酶不同亚型相关的微结构域。细胞科学杂志。2010;123:107–117. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zlatkine P，Mehul B，Magee AI.通过Lck蛋白酪氨酸激酶双酰化基序将细胞溶质蛋白重定位到质膜。细胞科学杂志。1997;110:673–679.[公共医学][谷歌学者]