癌症。 作者手稿； 可在PMC 2012年7月10日获得。
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尼姆斯： 美国国家卫生研究院255817
葡萄糖而非谷氨酰胺是头颈鳞癌细胞增殖和存活所需的主要能量来源 、医学博士、博士， 1, 2 ，医学博士， 2 ，博士， 2 ，博士， 2 ，博士， 2 ，博士， 三 ，医学博士， 1 ，博士， 三 和 医学博士 2
弗拉德·C·桑杜拉赫 1 德克萨斯州休斯顿贝勒医学院耳鼻咽喉头颈外科Bobby R.Alford
2 德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科
托马斯·J·欧 2 德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科
柯蒂斯·皮克林 2 德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科
米切尔·弗雷德里克 2 德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科
伊莎贝拉·福克特 三 德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
梅琳达·戴维斯·马列舍维奇 1 德克萨斯州休斯顿贝勒医学院耳鼻咽喉头颈外科Bobby R.Alford
沃尔德马尔·普里贝 三 德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
杰弗里·迈尔斯 2 德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科
1 德克萨斯州休斯顿贝勒医学院耳鼻咽喉头颈外科Bobby R.Alford
2 德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科
三 德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
通讯作者：Jeffrey N.Myers，德克萨斯大学安德森癌症中心1445单元头颈外科，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030。 电话：713-745-2667； 传真：713-795-2234 gro.nosrednadm@srymj
摘要 背景 肿瘤代谢是疾病进展和治疗反应的重要因素。 了解头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的代谢表型将有助于开发针对该肿瘤类型的适当抗代谢策略。
方法 对15个HNSCC细胞系的葡萄糖和谷氨酰胺依赖性以及对代谢抑制剂的敏感性进行了测定。 此外，使用质谱/液相色谱进行的广谱代谢组学分析与还原电位、三磷酸腺苷（ATP）和乳酸生成的个别测量相结合，以表征细胞代谢表型。
结果 HNSCC能量和降低电位水平与细胞外葡萄糖浓度密切相关。 尽管次级能量途径被激活，但葡萄糖饥饿仍会导致细胞死亡。 相反，HNSCC存活不需要谷氨酰胺，也不作为重要的能量来源。2-脱氧葡萄糖（2-DG）及其氟化衍生物降低糖酵解和克雷布斯循环活性、细胞能量和降低潜能，并抑制HNSCC细胞增殖。 添加二甲双胍可以增强2-DG效应，但不能抑制戊糖磷酸途径或谷氨酰胺水解。 尽管对葡萄糖分解代谢有依赖性，但我们发现了一部分相对耐饥饿的细胞系。 对一种这样的细胞系（HN30）的探索表明，野生型p53的存在可以部分保护肿瘤细胞免受葡萄糖饥饿的影响。
结论 HNSCC肿瘤细胞依赖葡萄糖而不是谷氨酰胺来产生能量和存活，这为针对葡萄糖分解代谢的治疗策略提供了理论基础。 然而，抗代谢策略可能需要适应肿瘤背景，更具体地说，是p53状态。
关键词： 糖酵解，谷氨酰胺，还原电位，2-脱氧葡萄糖，代谢
介绍 80多年前，人们描述了肿瘤细胞在厌氧和有氧条件下利用糖酵解的倾向（沃伯格效应） 1 自那时以来，已经证明肿瘤细胞也利用次级代谢途径，如谷氨酰胺水解，作为能量和合成代谢碳的替代来源 2 – 4 目前尚不清楚这种对营养缺乏的适应是否可以推广到所有形式的癌症，或者是否特定于癌症部位和组织学。 葡萄糖和次级营养素（如谷氨酰胺）的相对重要性可能与肿瘤类型有关，需要在多个实验系统中进行详细研究。
美国每年新诊断出40000多例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）。 尽管采用了多种治疗方法，但这种侵袭性实体瘤的预后仍然很差 5 来自其他实体肿瘤模型的数据表明，药物抑制葡萄糖或谷氨酰胺代谢会损害肿瘤细胞的存活和增殖 6 – 8 尚不清楚的是，哪种代谢途径是HNSCC代谢抑制的最合适靶点。 虽然葡萄糖转运蛋白（GLUTs）的过表达，特别是在低分化、侵袭性肿瘤中的过表达已被描述，但对HNSCC代谢缺乏更为机械的理解 9 – 12 .TP53突变报告， myc公司 和 ras（拉斯维加斯） HNSCC中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号的过度表达和改变表明HNSCC的葡萄糖或谷氨酰胺代谢可能发生改变 13 – 17 .
代谢靶向性已应用于临床前模型，并取得了不同的成功 18 – 20 己糖激酶抑制剂（2-脱氧葡萄糖（2-DG））与常规化疗药物联合使用时表现出抗肿瘤活性 7 , 19 , 21 , 22 近年来，研究表明，2-DG衍生物改善了细胞毒性和/或细胞抑制作用和药代动力学，促使人们继续关注这类药物 23 , 24 。在有限数量的HNSCC细胞系中对抗代谢药物的研究侧重于2-DG和活性氧毒性机制，而不是更全面地了解其抗代谢作用 25 , 26 由于现有的HNSCC细胞系具有异质性遗传背景，并且在 在体外 生长特征和致瘤潜力，我们认为有必要进行更全面的分析 27 .
为了评估HNSCC的代谢靶向性，我们试图回答几个对后续临床前和药物开发研究至关重要的问题。 首先，HNSCC的主要能量途径是什么？ 第二，这一途径是否可以专门针对HNSCC细胞减少能量生成并诱导细胞抑制或细胞毒效应？ 第三，代谢应激激活了哪些次级能量途径？ 为了回答这些问题，我们对代表不同上消化道亚型和疾病阶段的HNSCC细胞株进行了代谢组学分析。 我们的结果表明：1）谷氨酰胺是实现最大增殖所必需的，但不是主要的能量来源；2）抑制葡萄糖分解代谢可抑制细胞增殖，并在一系列药物浓度、治疗方式和HNSCC细胞系中抑制锚定物非依赖性生长。 我们还确定野生型p53的存在是HNSCC抗糖酵解策略相对抵抗的一种潜在机制。
材料和方法 化学制品 2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸、6-氨基烟酰胺、二甲双胍和氨基氧乙酸盐购自Sigma-Aldrich，（密苏里州StLouis）。 D-葡萄糖购自ICN Biomedical（加州欧文）。 丙酮酸钠购自Lonza（Walkersville，MD）。 2-卤代D-葡萄糖类似物（2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、2-脱氧2-氯-D-葡萄糖和2-脱氧2--溴-D-葡萄糖）由Waldemar Priebe博士（德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心，德克萨斯州休斯顿）提供。
细胞 HNSCC细胞系( )在Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）、DMEM/F12培养基或含有胎牛血清、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸和维生素的RPMI培养基中保持无支原体。 在含有或不含特定药物的生长培养基中进行48–120小时的增殖和细胞毒性实验。 实验期结束时，取下培养基，用台盼蓝直接计数，或用总DNA含量代替细胞数，确定相对细胞数 28 细胞周期分析采用碘化丙啶染色，细胞凋亡根据已发表的方案采用Annexin V染色进行评估 29 , 30 .
表1 细胞系 来源 性别 1°场地 阶段 LN金属 HN4型 科罗拉多大学健康科学中心 M（M） L（左） T2N0M0型 HN5型 大学医疗中心 M（M） OC公司 T2N0M0型 HN30型 韦恩州立大学 不适用 P（P） 不适用 海南31 韦恩州立大学 不适用 P（P） 不适用 Y（Y） UMSCC17A公司 大学医疗中心 F类 L（左） T1N0M0型 UMSCC17B公司 大学医疗中心 F类 L（左） T1N0M0型 Y（Y） UMSCC22B公司 大学医疗中心 F类 惠普 T2N1M0型 Y（Y） UMSCC25公司 大学医疗中心 M（M） L（左） T3N0M0型 PCI-13型 匹兹堡大学医学中心 M（M） OC公司 T4N1M0型 SCC61系列 芝加哥大学 M（M） OC公司 T4N2b类 MDA1586型 纽约大学 M（M） L（左） 不适用 平方1 U.T.M.D.安德森癌症中心 不适用 不适用 不适用 OSC-19型 卫生科学研究资源库 M（M） OC公司 不适用 Y（Y） FADU公司 美国式文化收藏 M（M） 惠普 不适用 图138 U.T.M.D.安德森癌症中心 M（M） OC公司 T3N0M0型
代谢研究 还原电位、三磷酸腺苷（ATP）和乳酸如前所述进行评估 31 , 32 。对两个HNSCC细胞系（HN30、HN31）的多个细胞内代谢途径的变化进行了评估。 如前所述，将三份亚融合培养物暴露于葡萄糖饥饿或2-DG[20mM]处理1h、4h和8h，并进行代谢分析（Metabolon Inc，Durham，NC） 33 使用“R”对日志转换数据进行统计分析( http://cran.r-project.org/ )，这是一个免费提供的开源软件包。 Welch的t检验用于比较实验组之间的数据。 与所有重要化合物相关的估计错误发现率（q值）如下：饥饿/对照1h，q=0.39； 4h，q=0.44； 8h，q=0.54； 2-DG/对照1h，q=0.26； 4h，q=0.05； 8小时，q=0.10。
软琼脂生长 HNSCC细胞接种于0.3%或0.6%低熔点琼脂中。 驯化24小时后，添加药物。 在实验期结束时，用结晶紫对菌落进行染色，并使用图像J 1.42q（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行计数和分析。
稳定的细胞系发育和p53分析 分别使用空慢病毒载体或表达抗p53短发夹RNA的载体（Addgene Inc.，Cambridge，MA）创建HN30对照（HN30-lent）和p53敲除稳定细胞系（HN30 shp53）。 在用5-氟尿嘧啶（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）刺激24小时后，用Western blotting检测p53（DO-1，抗p53抗体，圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯），验证p53敲除。
结果 HNSCC细胞系需要葡萄糖才能存活，需要谷氨酰胺才能最大限度地增殖 HNSCC细胞系在代谢剥夺条件下生长( ). 在缺乏谷氨酰胺的情况下，与72小时的对照条件相比，细胞数量增长减少了7%至51%( 和数据未显示）。 葡萄糖饥饿导致大多数HNSCC细胞系（7/12）的细胞群生长显著减少，主要是由于细胞死亡( , ). 当营养素饥饿时间延长（120小时）时，所有细胞株在葡萄糖而非谷氨酰胺饥饿条件下都表现出细胞死亡（数据未显示）。 在葡萄糖剥夺敏感性和谷氨酰胺剥夺性之间没有检测到精确的相关性。 为了进一步验证这些发现，我们对HNSCC细胞株进行了细胞周期分析。 虽然葡萄糖饥饿导致G1亚组分显著增加（HN30从1%增加到9%；HN31从4%增加到14%），但谷氨酰胺停药没有明显效果（数据未显示）。 使用Annexin V PE和7-AAD染色证实了这些结果( ); 葡萄糖剥夺（HN 30细胞株）导致早期和晚期细胞凋亡分别从2%和5%增加到6%和19%； 谷氨酰胺缺乏没有导致这种变化。
HNSCC细胞系需要葡萄糖和谷氨酰胺才能最大限度地增加细胞数量 细胞在正常生长培养基（DMEM）（A）或缺乏谷氨酰胺（B）或葡萄糖（C）的DMEM中增殖。 在指定的时间，使用商用试剂盒对每个孔的总DNA含量进行分析。 Y轴值表示为T=Xhr时与T=0hr时的单元数变化。 D） 细胞在缺乏葡萄糖或谷氨酰胺的培养基中培养72小时，补充丙酮酸。 使用台盼蓝排除法评估活/死细胞。* 表示p<0.05。 E） 细胞在缺乏葡萄糖或谷氨酰胺的培养基中培养48小时。 收集细胞并进行Annexin V PE/7AAD分析，以确定早期和晚期凋亡以及坏死部分。 数据代表了多个独立实验。
HNSCC细胞系需要葡萄糖才能存活 允许细胞在葡萄糖[25mM]和谷氨酰胺[4mM]存在或不存在的情况下增殖0–72小时。 在每个时间点使用台盼蓝计数细胞，以排除非活细胞。 GLC=D-葡萄糖[20mM]，GLN=谷氨酰胺[4mM]。 FADU是一种对葡萄糖提取敏感的细胞系，PCI13是一种相对抗葡萄糖提取的细胞系。
在对葡萄糖剥夺敏感的细胞系中，补充过量丙酮酸部分逆转了对细胞群增长的影响( ). 发现丙酮酸“拯救”葡萄糖饥饿是由于抑制葡萄糖剥夺的细胞毒性作用( ). 虽然过量的丙酮酸可以暂时减弱葡萄糖提取的细胞毒性作用，但它不能完全或永久逆转葡萄糖对细胞生长的影响。 这些数据表明，通过糖酵解和下游途径的葡萄糖分解代谢是HNSCC细胞增殖和存活的主要代谢驱动因素。 虽然以下详细的实验是使用中详细介绍的细胞系面板进行的 ，从图形表示中选择所选数据，以提高清晰度。 选择所选细胞系的数据，以涵盖较大数据集中存在的变异性，并说明最大和最小反应。
药物抑制降低HNSCC细胞的糖酵解通量并触发全球代谢紊乱 由于还原电位是生物量合成、能量生成和自由基失活的重要组成部分，我们评估了谷氨酰胺和/或葡萄糖对HNSCC细胞株细胞内还原电位的影响 34 改良的MTT反应被用作细胞内还原潜能的综合测量。 如所示 ，我们测试的大多数细胞株显示出大量葡萄糖( [选定的代表性数据]和3C）和微量谷氨酰胺( [选定的代表性数据]）对生成还原潜力和生成ATP的依赖性( ). 为了进一步证实还原电位的产生对糖酵解的依赖性，我们将HNSCC细胞株暴露于抗糖酵酵解化合物2-DG中，该化合物在糖酵分解的第一步抑制己糖激酶。 2-DG导致还原电位的剂量依赖性降低( [选定的代表性数据]）。 在另一种己糖激酶抑制剂3-BP的情况下，这种现象是保守的，而在谷氨酸依赖性转氨酶抑制剂AOA的情况下则不是如此( ). 与推测的抗糖酵解作用一致，2-DG处理导致HNSCC细胞胞内乳酸生成减少( ). 由于己糖激酶抑制在很大程度上取决于潜在的化学结构，我们进一步测试了2-DG的三种卤代变体。 根据其结构预测，2-DG和2-FG表现出最强大的抑制作用，其中2-CG和2-BG表现出更温和的细胞内能量抑制和减少潜在存储( ). 补充过量丙酮酸部分缓解了2-DG的能量效应，表明糖酵解和非糖酵化葡萄糖分解代谢对维持细胞能量状态都很重要( ). 结合我们最初的增殖实验结果，这些数据表明，尽管谷氨酰胺对HNSCC细胞的最佳生长是必需的，但它似乎对细胞的能量状态没有显著影响，也不需要短期存活。
葡萄糖是降低HNSCC细胞株潜能和ATP生成的主要来源 细胞在含有增加D-葡萄糖（a）或谷氨酰胺（B）浓度的盐溶液中培养2小时，然后进行2小时的MTT反应。 C、 将0mM和25mM葡萄糖（GLC）的基线还原电位归一化为总DNA含量。 D、 测量ATP水平并将其标准化为细胞数。
抑制糖酵解可降低HNSCC还原电位、ATP水平和乳酸生成 （A） 将细胞暴露于浓度增加的2-DG或（B）2-DG[12.5mM]、3-BP[50μM]和AOA[500μM]中，并在5mM D-葡萄糖存在下暴露2hr（A），然后进行2hr MTT反应。 （C） 细胞在有或无2-DG[10mM]的D-葡萄糖[1mmM]中培养6小时，然后测量细胞内乳酸水平（*表示p值<0.05）。 （D） 在D-葡萄糖[10mM]和丙酮酸[20mM]存在下，用2-DG、2-FG、2-CG、2-BG[25mM]处理细胞2小时后，测量细胞内ATP和还原电位。
为了更好地了解糖酵解抑制对HNSCC代谢的影响，我们使用了一个定量、广泛的质谱平台来分析细胞内代谢物水平的变化，以响应葡萄糖饥饿或2-DG治疗。 葡萄糖饥饿和2-DG治疗导致涉及多个细胞内途径的代谢物水平发生显著的时间依赖性变化( ). 在时间和范围方面，2-DG的影响比葡萄糖饥饿的影响更为显著，并且在多种化合物方面具有统计学意义。 在本分析中，使用高通量代谢筛查确定代谢物水平的趋势( )以及基于0.1的错误发现率（q值）截止值确定的统计显著性。 代谢物根据一般代谢途径进行分组( http://www.genome.ad.jp/kegg/ ; 在中列出 ) 35 代谢产物水平的评估表明，在没有葡萄糖或存在2-DG的情况下，糖酵解通量降低，乳酸生成减少，Krebs循环中间体水平降低。 细胞内2-DG水平随时间增加，与依赖葡萄糖转运蛋白活性的调节摄取机制一致，并似乎分流到山梨醇/果糖途径。 2-DG治疗（以及在较小程度上的葡萄糖饥饿）导致UDP-葡萄糖醛酸盐水平大幅下降，戊糖磷酸途径中的中间产物积累以及嘌呤核苷酸中间产物的改变。 在HN31细胞系（来源于HN30肿瘤来源的同一患者的颈部转移）中观察到类似的趋势，尽管氧化应激和分流到山梨醇途径的变化幅度较大，戊糖磷酸途径和克雷布斯循环的变化幅度较小（数据未显示）。
2-DG触发全球代谢变化 去除HN30细胞的葡萄糖或用2-DG[20mM]（在含有25mM D-葡萄糖的DMEM存在下）处理1、4或8小时，并分析细胞内代谢物水平。 （A） 数据表示为以控制条件为分母的比率。 黄色文本表示统计显著性（p值<0.05）。 代谢物水平的趋势以颜色表示（绿色=减少，红色=与对照条件相比增加）。 表右侧显示了一般路径。 插图显示了细胞内2-DG水平随时间的变化。 误差线表示标准偏差。 （B） 全球路径整合如附图所示。 2-DG治疗效果用绿色（减少）和红色（增加）箭头表示。
糖酵解抑制剂抑制HNSCC增殖和软琼脂生长 HNSCC细胞对葡萄糖分解代谢的明显依赖性表明，糖酵解的药物抑制可以显著抑制HNSCC的增殖和存活。 我们使用高通量96-well分析法，在持续药物暴露72小时的情况下，检测了3种化合物在HNSCC细胞中的相对细胞抑制和/或细胞毒性作用，如 己糖激酶抑制剂3-BP和2-DG在生物相关浓度范围内表现出强大的抗增殖活性。 相比之下，AOA表现出最小的抑制作用（<20%），这与其对细胞内还原电位的最小影响一致。 由于3-BP作为糖酵解抑制剂和烷基化剂的双重活性，我们将注意力集中在2-DG上，以关注抑制糖酵分解的效果。 我们在两个特征良好的HNSCC细胞系中观察到可变的2-DG敏感性( )这一点在整个卤化2-DG衍生物小组中得到了保持。 只有2-氟脱氧-D-葡萄糖（2-FG）表现出与母体化合物2-DG相比更好的抗增殖作用( ). 相比之下，2-BG和2-CG表现出更高的半最大抑制浓度（数据未显示）。 除FADU外，所有受试HNSCC细胞系的IC50值均较低，与组织发生起源不同的细胞系相比，IC50值较低( ) 36 用2-DG处理HNSCC细胞也导致HNSCC软琼脂集落形成显著减少（ 在体外 致瘤性替代物）( 和数据未显示）。 添加戊糖磷酸途径抑制剂（6-氨基烟酰胺）或谷氨酰胺分解抑制剂（氨基氧乙酸）未能显著增强2-DG的作用。 相反，添加葡萄糖增敏剂二甲双胍后，多个细胞系中的2-DG效应显著增强，与p53突变状态无关( 以及未示出的数据）。
抑制糖酵解减少HNSCC增殖和软琼脂生长 （A） 将细胞暴露于2-DG[12.5mM]、3-BP[62.5μM]和AOA[500μM]72小时。确定细胞数量并相对于对照（仅培养基）条件呈现。 （B–D）附着后，将细胞暴露于浓度增加的2-DG、2-DG或2-FG中72小时。确定实验期结束时的细胞数量。 对至少2个独立实验的IC50值进行平均。 （E） 细胞接种在0.3%软琼脂中，在常规培养基（CNT）或含有2-DG[5mM]的培养基中培养6天，用结晶紫染色并计数。 插图中显示了具有代表性的图像。* 表示p值<0.05。
二甲双胍增强2-DG对HNSCC增殖的影响 在二甲双胍（met）、氨基氧乙酸盐（AOA）或6-氨基烟酰胺（6AN）存在或不存在的情况下，将细胞暴露于2-DG 72小时。确定细胞数量并相对于对照（仅培养基）条件呈现。
野生型p53缺失部分解释了HNSCC细胞亚群对葡萄糖饥饿的抵抗 共鉴定出三种细胞系，它们始终表现出对葡萄糖提取的相对抗性。 其中，我们重点分析了HN30，即来源于HNSCC原发肿瘤（HN30）及其相关宫颈转移（HN31）的一对等基因细胞系的一半。 尽管这两种细胞来源相同，但发现它们对葡萄糖提取或2-DG及其衍生物治疗表现出不同的敏感性( 和数据未显示）。 TP53基因外显子2-11的测序确定了HN30中的野生型（WT）p53和HN31中TP53的两点错义突变（数据未显示）。 先前的研究已经证明WTp53在肿瘤细胞代谢中的重要作用 37 – 39 在这个细胞系系统中，WTp53的表达减少和shpRNA导致HN30对葡萄糖剥夺的抵抗部分消融( )和2-DG处理( ). 细胞周期分析表明，含有WTp53的细胞最初在葡萄糖饥饿后的G1期停滞，而缺乏WTp53细胞在较早的时间点开始死亡，而没有在G1期开始积累( 和数据未显示）。 我们的数据例证了与HNSCC中关键肿瘤抑制途径相关的耐药机制，表明抗糖酵解剂的敏感性可能取决于在各种肿瘤中发现的突变谱。
WTp53的缺失消除了葡萄糖饥饿诱导的G1期阻滞并使HN30细胞增敏 （A） WT（HN30shp53）被稳定击倒。 用5-FU（5ng/ml）刺激HN30亲本和HN30慢病毒（HN30L）转染细胞中WTp53的24小时上调表达。 （B） 细胞在有或无葡萄糖的条件下生长72小时。在实验期结束时测定细胞总数。 （C） 细胞暴露于2-DG[5mM]72小时。在实验期结束时测定总细胞数。 （D） 在使用碘化丙啶进行细胞周期分析之前，将细胞缺糖36小时。
讨论 近年来，代谢改变在肿瘤的发病机制、进展和对不同治疗的抵抗中的作用越来越受到关注。 尽管GLUT表达和2-氟脱氧葡萄糖摄取（[18F]氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描）与低分化疾病相关，但关于HNSCC肿瘤内特定营养物质流动的数据仍然喜忧参半 9 , 11 , 12 , 18 9 , 10 , 40 在本研究中，我们阐明了HNSCC肿瘤发生的一些代谢基础，并评估了抗代谢策略在代表多种疾病部位和分化程度的细胞系中抑制HNSCC细胞增殖和存活的潜力。
在有氧条件下，大多数受试HNSCC细胞系依赖葡萄糖而非谷氨酰胺代谢来产生ATP和还原潜能。 虽然谷氨酰胺可能作为一种必需的氨基酸和蛋白质构建块发挥重要作用，但与一些胶质瘤细胞系的研究结果相比，谷氨酰胺的分解代谢似乎对HNSCC细胞直接产生能量或产生还原潜能没有重大影响 2 值得注意的是，过量的丙酮酸只能部分地将HNSCC细胞从葡萄糖饥饿中解救出来，这表明该中间体的上游（糖酵解、磷酸戊糖途径）和下游（转化为乳酸、三羧酸（TCA）循环）的分解代谢步骤对能量生成和生存都很重要。
尽管所有受试的HNSCC细胞株都表现出对葡萄糖的偏爱，但我们发现有三种细胞株在葡萄糖缺乏时持续表现出延长生存期。 在这些细胞系中，SQCCY1通常保存在低血糖培养基中，可能代表对特定的 在体外 生长条件。 有趣的是，HN30代表来自患者原发肿瘤和相关宫颈转移的一对等基因细胞系（HN30和HN31）的一半。 这两种细胞系的不同代谢表型促使我们进一步分析了抵抗饥饿的潜在机制。 我们的数据表明，HN30中WTp53的缺失导致对葡萄糖戒断或糖酵解抑制剂治疗的敏感性增加。 缺乏WTp53的HN30细胞在死亡前未能进入G1期停搏，可能是停糖后死亡时间延迟的原因。 文献中描述了p53影响肿瘤细胞代谢的多种机制 37 – 39 p53改变在HNSCC进展中的重要性以及p53在HNSCCC细胞代谢中的意义值得深入探讨，然而，WTp53缺失可能驱动HN30细胞代谢表型的确切机制超出了本文的范围。 然而，值得注意的是，WTp53的缺失不能解释HNSCC细胞株中观察到的所有对葡萄糖饥饿的相对抵抗，因为PCI13和SQCCY1都表达突变型p53（数据未显示）。 毫无疑问，除p53状态外，细胞背景中的其他因素会影响对葡萄糖饥饿的敏感性。 尽管如此，从我们的研究和其他研究来看，p53在葡萄糖缺乏反应中发挥着重要作用。 事实上，p53抑癌基因的缺失通常是肿瘤发生过程中的一个重要步骤，但也会使细胞极易受到葡萄糖饥饿的影响，这为在这些肿瘤的治疗中考虑抗糖酵解治疗提供了支持。
HNSCC细胞明显的葡萄糖成瘾表明抗糖酵解剂可能是这种肿瘤类型的一种有希望的治疗选择 41 。由于3-BP被认为具有烷基化活性，我们将注意力集中在2-DG上，这是一种50多年前首次发现的药物。 我们的数据表明，2-DG在HNSCC细胞系中诱导细胞内还原电位和ATP的快速、剂量依赖性降低。 除了对乳酸生成的影响外，2-DG的抗糖酵解作用的特异性还通过其卤代类似物的差异活性得到了进一步证实 23 , 42 通过降低细胞内还原潜能和ATP水平，2-DG可以潜在地抑制新生物量生成和DNA损伤修复 1 这些效应对顺铂和外照射（HNSCC治疗的主要方法）具有重要的治疗意义 8 , 25 广泛的代谢组学分析用于评估2-DG对糖酵解的抑制作用以及糖酵酵解流量损失时激活的代偿能量途径。 糖酵解应激激活了几种替代机制，包括谷氨酰胺水解和分流到山梨醇-果糖和磷酸戊糖途径 43 TCA循环中间产物和谷氨酸水平的降低（结合早期实验）表明，虽然谷氨酰胺可以分解代谢以满足某些细胞能量需求，但这不足以平衡我们测试的细胞系中的糖酵解损失。 戊糖磷酸途径中间产物的积累可能反映了细胞周期的停滞，这与核苷酸合成所需的细胞内还原电位降低一致。 谷胱甘肽水平的变化与细胞内氧化应激的增加相一致，证实了我们关于细胞内还原电位的研究结果以及先前的研究 25 , 26 虽然这种效应可以增强传统化疗药物和辐射毒性，但它显然只是2-DG引起的剧烈全球代谢紊乱的一个方面。
肿瘤细胞对D-葡萄糖类似物的敏感性取决于肿瘤类型、环境氧张力和可能与肿瘤亚型相关的特定细胞特征 36 , 42 , 44 除了一个例外（FADU），我们检测的HNSCC细胞株显示出低（一位数）D-葡萄糖IC 50 值。 在正常葡萄糖稳态和2-DG药代动力学的背景下，这些值具有治疗前景。 HNSCC细胞株对卤化2-DG类似物的敏感性与潜在的化学结构一致，更具体地说，是卤素基团大小。 受试HNSCC细胞株对2-DG和2-FG的敏感性相当，进一步表明靶向抗糖酵解作用可能是导致毒性的主要机制 23 , 45 这些数据使我们得出结论，HNSCC细胞在常压条件下对非代谢性D-葡萄糖类似物敏感。 我们预计通常与HNSCC肿瘤相关的缺氧将进一步增强抗糖酵解剂的作用 23 研究表明，靶向多个代谢途径可能比单途径抑制更有效。 我们的数据表明，与单独的2-DG相比，对磷酸戊糖途径或谷氨酰胺裂解的药理学抑制几乎没有益处。 相反，二甲双胍的添加大大增强了糖酵解抑制作用，而与p53状态无关。 这与其他肿瘤类型的已发表报告一致，并表明了一种强有力的代谢协同作用，应在 体内 设置 39 FADU对2-DG的相对抗性有点令人费解，因为它与葡萄糖饥饿的抗性并不确切相关。 这种二分法可能表明葡萄糖转运蛋白或己糖激酶活性发生改变。 低亲和力转运体或缺乏己糖激酶变体可解释低血糖条件下无法生存的原因，同时可防止2-DG的显著代谢抑制。 我们实验室的一项平行研究的初步数据表明，在该细胞系中，p53状态是R248L突变的杂合状态，同时可能存在剪接位点突变。 在蛋白质水平上，p53构成性过度表达（数据未显示）。 正在进行的实验旨在阐明这种突变的作用，HN31和我们剩下的细胞系中存在的突变在调节HNSCC代谢中的作用。
我们的结论是：1）根据我们对大量HNSCC细胞株的评估，抑制葡萄糖分解代谢是治疗HNSCC的一种合理的药理学和几乎普遍的方法，2）糖酵解抑制具有深远的全球代谢后果， 对于HNSCC中的治疗靶向和3）糖酵解靶向，每一种都具有重要的潜在意义，可以推广到整个类别的非代谢D-葡萄糖类似物和原药。 我们确定HNSCC高度依赖葡萄糖，抗糖酵解治疗似乎是治疗该病的有效选择。 抗糖酵解剂可能是当前化疗和放疗的重要佐剂，值得进一步评估。 了解先天性或后天性HNSCC对代谢应激的耐受性的潜在机制，是开发此类药物作为治疗方案的关键。 我们对大量HNSCC细胞株进行了表征，并初步观察到HNSCC对抗糖酵解剂的耐药模式，为进一步研究HNSCC的代谢靶向性奠定了基础。
致谢 拨款支持： 国家卫生研究院通过国家研究科学奖研究训练拨款（NIDCD）T32DC007367（VCS）、国家科学奖研究培训拨款（NCI）T32CA060374（VCS。 安德森癌症中心支持拨款CA016672和PANTHEON计划，并由美国耳鼻喉科学院-美国头颈学会核心试点拨款。 内容完全由作者负责，不一定代表国家癌症研究所或国家卫生研究院的官方观点。
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