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BMC开发生物。2001; 1: 4.
2001年3月27日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1471-213X-1-4
预防性维修识别码：PMC31338型
PMID：11299042

通过靶向插入EYFP公司和ECFP公司进入俄罗斯26轨迹

Shankar Srinivas公司,1,4 渡边富子,1 Chyuan Sheng Lin公司,2 克里斯·M·威廉,三 田北康夫,三 托马斯·杰塞尔,三和弗兰克·科斯坦蒂尼通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

背景

已经描述了几种Cre报告小鼠菌株，其中lacZ公司在表达Cre重组酶的细胞及其子细胞中，在Cre介导的切除液氧磷-侧翼转录“停止”序列。这些小鼠可用于细胞系追踪实验以及监测Cre转基因的表达。绿色荧光蛋白（GFP）和变体（如EYFP和ECFP）比lacZ公司作为一名记者，它们可以很容易地被可视化，而无需依赖于可视化活组织中β-gal所需的重要底物。

结果

鉴于靶向普遍表达的ROSA26位点的通用性，我们构建了一个通用的ROSA26-靶向载体。然后，我们通过插入EYFP公司或ECFP公司cDNA进入玫瑰26轨迹，前面有一个液氧磷-侧翼停止序列。通过将这些菌株与表达Cre的转基因菌株在一个普遍存在的(β-肌动蛋白核心)或特定于细胞的(克雷岛1号和En1 Cre公司)模式。由此产生的EYFP或ECFP表达模式表明，报告菌株可作为Cre活性的忠实监测者。

结论

与现有的相比lacZ公司记者行，其中lacZ公司EYFP和ECFP报告菌株不易在活组织中检测到表达，有助于监测Cre的表达，并追踪这些细胞及其后代在培养胚胎或器官中的谱系。EYFP和ECFP的非重叠发射光谱使其成为活组织双标记研究的理想选择。

背景

Cre公司-液氧磷位点特异重组系统[1]被广泛用于在小鼠中产生组织特异性和条件性敲除等位基因[2,三]. 最近，一名Cre-dependentlacZ公司报告菌株（R26R）是通过将lacZ基因靶向插入到普遍表达的ROSA26位点中，在此之前插入一个loxP侧翼（漂浮）强转录终止序列（tpA）而产生的[4,5]. 这个R26R型等位基因提前终止转录，但当小鼠与表达Cre的转基因小鼠杂交时，Cre介导的终止序列的切除导致构成lacZ公司表达式。因此，这些双转基因动物表达lacZ公司仅在表达Cre的细胞中，以及在其所有子细胞中。使用不同的启动子表达类似的Cre报告菌株lacZ公司[[6-9]]这一主题的另一个变体是Z/AP报告菌株的开发，该菌株在暴露于Cre重组酶活性后从lacZ转换为碱性磷酸酶表达[10]. 所有这些菌株都有助于监测Cre重组酶的表达以及细胞系标记实验[9, [11-14]].

在这里，我们描述了两个表达增强黄色或青色荧光蛋白（EYFP或ECFP）的类似Cre报告基因等位基因的产生，这是绿色荧光蛋白（GFP）的两种颜色变体。GFP及其变体是可在活细胞中显示的自荧光蛋白，因此对监测整个胚胎、动物或培养细胞和器官中的基因表达特别有用[15]. 之所以选择EYFP和ECFP，是因为它们的发射光谱重叠最小，所以当同时使用时可以区分它们，而EYFP和EC FP的发射光谱与EGFP的重叠程度更大[16,17] http://www.clontech.com/gfp/pdf/LivingColors.pdf。

在这项工作的过程中，报道了三株条件表达EGFP的新Cre报告菌株。两个转基因菌株[18,19]在Cre介导的终止序列切除后，使用β-肌动蛋白启动子/CMV增强子表达EGFP，在其中一种情况下，lacZ在Cre介导的切除事件之前表达。在第三个菌株中，原则上与这里报道的YFP和CFP等位基因相似，EGFP插入俄罗斯26轨迹[20]. 不同Cre报告菌株的可用性将很有价值，不仅因为不同报告蛋白的优势，而且因为Cre介导的切除效率可能取决于目标位点。

结果和讨论

考虑到俄罗斯26以普遍存在的方式表达各种序列的基因座[4,5,21]，我们生成了一个通用靶向载体（pBigT），任何感兴趣的序列都可以很容易地插入到漂浮的neo-tpA盒的下游，然后用俄罗斯26基因组侧翼臂。ECFP公司或EYFP公司插入到pBigT中，并将结果序列插入到包含俄罗斯26允许同源重组的基因组序列（图​（图1A）。1安培). 将靶向载体电穿孔到ES细胞中，并分析每个构建体的27个G418耐药菌落。根据Southern blot杂交（图​（图1B）。1B年). 靶向ES细胞，最初来源于菌株129X1/SvJ[22]将，注射到C57BL/6J囊胚中，并将产生的嵌合小鼠培育为C57BL/6J雌性小鼠，以通过生殖系传递突变。因此，产生的小鼠是菌株129X1/SvJ和C57BL/6J的混合物。

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目标俄罗斯26轨迹。A、 自上而下：pBigT，一种含有loxP侧翼带的质粒PGK-neo公司可选标记和tpA转录停止序列，其中EYFP公司或ECFP公司被克隆；pROSA26PA，含基因组俄罗斯26同源重组序列和白喉毒素基因(PGK-DTA公司)用于ES细胞的阴性选择；野生型俄罗斯26轨迹，指示探针位置；靶位点的结构；以及在Cre介导的液氧磷-侧翼的(PGK-neo公司，tpA）盒式磁带。LoxP公司地点用实心箭头表示。B、 7个ES细胞系DNA的Southern blot，用EcoRV消化并与A中指示的探针杂交。11 kb带是野生型带，3.8 kb带代表目标等位基因。Y25和C4系为野生型，而其余系为目标等位基因杂合型。

正如预期的那样（数据未显示），由于启动子和编码序列之间插入了强大的转录停止序列，因此在R26R-EYFP或R26R-ECFP小鼠中未检测到EYFP或ECFP的背景表达。然而，当报告小鼠与β-actin-Cre转基因小鼠杂交时[23]在大多数或所有细胞（包括早期胚胎中的细胞）中组成性表达Cre，由此产生的双转基因胚胎显示出EYFP或ECFP的普遍表达（图​（图2），2)，表明有效地切除了floxed stop序列。EYFP与ECFP的表达可以使用适当的滤波器组进行清楚区分（图​（图2）。2). EYFP或ECFP的这种普遍表达是通过遗传方式传递给下一代的（数据未显示），导致小鼠的普遍表达系，这将有助于嵌合体小鼠或胚胎的谱系追踪，类似于原始的ROSA26 lacZ启动子陷阱株[21].

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EYFP或ECFP在携带β-肌动蛋白Cre转基因。两个胚胎，一个携带R26R-EYFP型（右）和一个R26R-ECFP型（左），均为杂合子β-肌动蛋白核心转基因。它们可以通过YFP滤波器组（a）、亮场照明（B）或CFP滤波器组（C）进行可视化。

通过将R26R-EYFP和ECFP系与以组织特异性方式表达Cre的小鼠菌株杂交来测试它们的特异性。Isl1是一种LIM同源域转录因子，在运动神经元、背根和颅感觉神经节中表达[24]. 通过靶向产生Isl1-Cre小鼠Cre公司进入岛屿1轨迹（参见材料和方法）。杂合Isl1-Cre小鼠存活且可繁殖，而纯合小鼠在E9-E10.5死亡，正如之前所描述的，Isl1第二个LIM结构域的外显子被删除的小鼠[25]. 图​图3A3A级显示了一项实验，其中R26R-YFP小鼠与Isl1-Cre小鼠杂交，导致双转基因后代的运动神经元和背根神经节中EYFP的表达。因此，R26R-YFP小鼠忠实地报告了神经元亚群中Isl1/Cre的细胞特异性模式。作为对照，Isl-1/Cre小鼠也与原始小鼠交配R26R lacZ公司等位基因[4]，导致类似的表达模式lacZ公司.

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EYFP在携带克雷岛1号.A，E14.5 R26R-EYFP/+的横截面；克雷岛1号/+胚胎，显示EYFP在运动神经元和背根神经节中的表达。表面外胚层中的明显表达是一种伪影，正如在非转基因胚胎中所见（数据未显示）。面板B，E12.5的横截面R26R-lacZ；克雷岛1号胚胎，表现出类似的β-半乳糖染色模式。

Engrailed-1（En-1）是一种同源结构域蛋白，在早期体节期胚胎的中后脑交界处以及胚胎发生后期的许多部位特异表达。图​图44显示了一项实验，其中R26R-YFP小鼠与Cre被敲入英语-1轨迹[26]导致YFP在E8.5胚胎的中后脑交界处特异性表达。为了进行比较，我们还将En-1/Cre小鼠与原始小鼠杂交R26R lacZ公司等位基因[4]，导致在E8.5的同一区域中lacZ表达（图​（图4C4摄氏度).

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携带R26R-EYFP E8.5胚胎的中后脑交界处EYFPs的特异性表达英语1Cki公司，一个工程-1 Cre敲入等位基因。A、 暗场照明，显示胚胎前部。B、 YFP在同一胚胎中的表达。胚胎的轮廓用虚线表示。C、 E8.5胚胎来自英语1Cki公司和R26R lacZ公司等位基因[4]，导致lacZ公司在同一个中后脑区域表达。

ECFP的表达在固定组织和切片组织中更难检测（数据未显示），尽管在未固定的胚胎组织中可以清楚地检测到（图​（图2C）。2摄氏度). 与ECFP相比，EYFP具有更高的量子产率和消光系数，这并不奇怪，这两者都会导致更高的荧光强度。

结论

我们构建了两个报告系小鼠，它们只在表达Cre重组酶的细胞及其子细胞中表达EYFP或ECFP，方法是将这些cDNA靶向普遍表达的ROSA26基因座，然后在其前面添加一个液氧磷侧面的“停止”序列。与一株普通Cre表达菌株（βactin-Cre）和两株组织特异性Cre菌株（Isl1-Cre和En1-Cre）的杂交表明，报告菌株与特征良好的R26R-lacZ菌株相似，其功能如预期。与…对比拉奇EYFP和ECFP报告菌株（连同目前可用的GFP报告菌株）将非常有助于监测Cre在活组织中的表达，或追踪这些细胞及其后代在培养胚胎或器官中的谱系。此外，通过使用重组酶活性可诱导的改良型Cre，可以使用这些报告小鼠对发育过程中不同时间点的细胞谱系进行详细分析。

材料和方法

质粒来源

的组件俄罗斯26靶向载体是菲利普·索里亚诺（Philippe Soriano）的礼物。腺病毒剪接受体（SA）和牛生长激素多聚腺苷酸化序列（bpA）来自质粒pSAβgeo[21]. 这个液氧磷侧面的新盒和SV40多聚腺苷化序列（tpA）的三聚体来自质粒PGKneotpAlox2[4]. 这个俄罗斯26基因组序列和白喉毒素（DTA）表达盒来自质粒pROSA26-1[4]，用于ES细胞基因型的外部探针的模板来自质粒pROSA26-5’[4].

含有EYFP和ECFP cDNA的质粒pEYFP-N1和pECFP购自Clontech Laboratories Inc。

目标构造函数

质粒pBigT由腺病毒剪接受体序列和液氧磷位点，新表达盒，强转录停止序列（三重SV40多聚腺苷化序列），另一个液氧磷与第一个定位相同的位点，一个多重克隆位点（MCS），以及牛生长激素多聚腺苷化序列。一个PacI站点被纳入SA的5'，一个AscI站点被纳入bpA的3'。这两种酶是罕见的八碱基对切割器，在消化时会产生粘性末端，可用于切除整个结构，以便插入带有俄罗斯26基因组臂。用于插入到俄罗斯26基因组位点[4]被一个链接器（PacI、SwaI、AscI）取代，因此可以用PacI和AscI消化它，并接收bigT序列。

为了制备pBigT，质粒pSAβgeo被ClaI和XbaI消化以去除β地缘和bpA序列，但留下SA，末端被Klenow填充，质粒自噬。用SacI和PstI消化产生的质粒，去除5'MCS，然后用PacI连接子替换。由此产生的质粒被称为pPacSA。

接下来，用SacI消化pSAβgeo以去除SA和β地缘序列，但留下bpA和自标记。用XbaI和ApaI消化得到的质粒，以去除大部分3'多组分灭菌剂（除了末端KpnI位点），其被AscI接头取代。由此产生的质粒被称为pbpAAsc。

这个液氧磷-新-tpA（总吨位）-液氧磷用NotI切割，Klenow填充，然后用KpnI切割，从质粒PGKneotpAlox2中切除。将其插入pPacSA中SA的下游，用SalI消化，Klenow填充，然后用KpnI切割。合成了一个含有XhoI、ApaI、SacII、NotI、Sac I、EcoRV和KpnI限制性位点的MCS，并将其插入第二个MCS的下游液氧磷用XhoI和KpnI消化DNA并在MCS中连接，MCS已被合成为具有相容的内聚端。这个质粒被称为pSAleotpA。通过SacI和KpnI消化，从pbpAAsc中去除bpA序列和3'AscI位点，并通过SacI-KpnI的消化将其插入pSAleotpA中MCS的下游。由此产生的质粒被称为pBigT，其MCS包含限制酶NheI、SalI、AccI、XhoI、ApaI、SacII、NotI、Sac I和BclI的位点。

要使俄罗斯26与pBigT质粒pROSA26-1兼容的基因组序列用XbaI、Klenow填充物和连接物（PacI、SwaI、AscI）消化。该质粒被称为pROSA26PA。

为了构建R26R-YFP目标结构EYFP公司用ApaI和NotI从pEYFP-N1中切下cDNA，并插入用ApaII和NotI消化的BigT中。然后用PacI和AscI消化BigT，释放出整个漂浮物新-tpA和电子飞行计划组装，并插入经PacI和AscI消化的pROSA26PA中。该质粒随后用KpnI线性化并用于电穿孔。

为了使R26R-CFP靶向结构pECFP用AgeI消化，Klenow填充然后用NotI消化以切除ECFP公司cDNA。将其插入BigT中，用XhoI消化，Klenow填充，然后用NotI消化。然后用PacI和AscI消化BigT以释放整个漂浮的新tpA和CFP组件，并插入用PacI与AscI酶解的pROSA26PA中。该质粒随后用KpnI线性化并用于电穿孔。

在试图生长最终的靶向载体时，观察到大量重组，导致分子量较小的异常质粒。因此，将这两种质粒的混合物用KpnI消化，KpnI将两种质粒线性化，并凝胶纯化正确的靶向载体。随后通过诊断PCR、限制性消解和测序（数据未显示）确认其为正确的靶向载体。

目标俄罗斯26ES细胞中的位点

JM-1 ES细胞[22]通过在添加LIF的培养基中培养饲养细胞来扩大。约15×106用10μg的每种靶向载体电穿孔细胞，并在300μg/ml G418中选择培养基，无需饲养器培养7天。选取96个菌落，筛选27个菌落进行电穿孔，分别使用两种结构体R26R-YFP和R26R-CFP。对EcoRV消化的ES细胞DNA进行基因组Southern杂交。由于目标等位基因中存在额外的EcoRV位点，因此使用的5'探针检测到11 kb野生型带和3.8 kb靶向带。

携带靶向等位基因的小鼠通过如上所述的PCR进行基因分型[4].

Isl1-Cre小鼠株的构建

如Pfaff等人所述，Isl1基因组DNA之前已从小鼠129/Sv基因组文库（Stratagene）中分离出来[25]. 在编码Isl1第二个LIM结构域的外显子的EcoRI位点中引入了一个PacI位点。将一个包被IRES Cre SV40 pA和pgk-新霉素的盒式结构克隆到该PacI位点，以创建一个靶向结构，其侧翼分别为5'和3'基因组DNA臂5kb和2kb。如Pfaff等人所述，靶向并筛选ES细胞[25].

小鼠菌株

En-1/Cre小鼠（En1Cki公司等位基因）是亚历山德拉·乔伊纳博士和沃尔夫冈·沃斯特博士的礼物[26]. β-actin/Cre小鼠是Gail Martin博士的礼物[23]. R26R-lacZ报告鼠是Philippe Soriano博士的礼物[4].

检测EYFP和ECFP的表达

对于整体安装照片（图​（图22和​和4），4)，使用配备ECFP（青色GFP Ex436/20 Dm455 Bar480/40）和EYFP（黄色GFP Ex500/20 Dm515 Bar535/30）Chroma滤光片组的尼康表观荧光显微镜拍摄未固定胚胎。使用Spot相机采集数字图像。

组织学切片（图​（图3），三)，胚胎在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜，在PBS中洗涤2次10分钟，然后在以下溶液中平衡，直到胚胎沉淀在底部（约30分钟）：PBS、PBS中5%蔗糖、PBS内10%蔗糖和PBS中15%蔗糖。然后在OCT的1:1混合物中平衡它们（Tissue-Tek，Mile，Inc.）和15%的蔗糖在PBS中放置>1小时，并在干冰上嵌入OCT中。切片在8-12μM下切割，在低热下吹干30分钟，然后在-80°C下与干燥剂一起储存在气密袋中。在拍照之前，将载玻片置于室温下，在PBS中清洗3次，装在Vectashield（Vector Laboratories）内，用盖玻片覆盖并用透明指甲油密封。如上文所述，对部分进行拍照。

致谢

我们感谢Alex Joyner和Wolfgang Wurst提供的En-1/Cre小鼠、Philippe Soriano提供的ROSA26基因组序列、Roger Pederson提供的JM-1 ES细胞系以及Zaiqi Wu提供的卓越技术援助。F.C.得到了NIH的资助。T.M.J.得到了NIH的资助，是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

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文章来自发育生物学由以下人员提供BMC公司