p53和p73在启动子水平对促凋亡多域蛋白Bak的差异调节

p53诱导靶基因表达烘烤启动子结构

我们用不同数量的p53表达载体与报告质粒pGL3-p53BS共同转染HeLa细胞，其中包含所有三个假定的p53结合位点。显然，p53的联合转染浓度依赖性地诱导荧光素酶的表达烘烤-转染后48小时启动子(图1b). HCT116/p53的类似实验证实了这些数据^−/−细胞，其中外源性p53还特异性地诱导来自克隆区域的荧光素酶活性烘焙1基因位点(图1b).

为了研究三个假定p53结合位点中每一个的特定作用，我们生成了四个额外的荧光素酶报告载体，其中包含一个或三个假定的p53结合部位中的每一个突变。p53共有位点由序列5′-PuPuPuC（A/T）（A/T）GPyPyPy-3′的两个半位点组成，由0–13 bp分隔。¹⁵我们通过将必需的胞嘧啶和鸟嘌呤残基交换为腺嘌呤和胸腺嘧啶，分别在每个位点引入突变（补充表1）。此外，我们创建了一个报告载体，其中所有三个p53结合位点同时发生突变。然后将这四个报告基因质粒pGL3-Basic-mutBS1、−mutBS2、−mutBS3和−mut BS1-3与p53表达构建物共同转染到HeLa细胞中。出乎意料的是，与非突变结构相比，BS1或BS2的突变导致荧光素酶活性的变化可以忽略不计，而BS3的突变则导致荧光素酶活性显著降低约60%(图2a). BS3突变对HCT116/p53的影响相似^−/−细胞。同样，BS1或BS2的突变不会显著影响报告基因的表达，而pGL3-Basic-mutBS3诱导的荧光素酶活性降低了约60%(图2b). 与任一细胞系中BS3的单一突变相比，所有三个假定p53结合位点的同时突变并没有进一步降低荧光素酶活性。与先前的结果一致，HeLa中萤光素酶表达的诱导高于HCT116/p53^−/−细胞。这些数据表明p53诱导靶基因表达烘焙1启动子，此外，只有BS3是p53驱动的基因表达所必需的，而BS1和BS2是可有可无的。

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图2

确定BS3为功能性p53结合位点。赫拉家族(一)和HCT116/p53^−/−(b条)用指示的报告基因构建物和p53表达载体转染细胞。p53诱导的荧光素酶报告基因不受BS1或BS2突变的影响，而BS3突变显著降低荧光素酶活性。(c（c）)使用p53一致序列（p53con）、BS1、BS2、BS3或突变的BS3（mutBS3）以及依托泊苷处理的HCT116/wt和HCT116/p53提取物进行电泳迁移率变化分析^−/−细胞。添加p53抗体会在野生型样本中产生p53con和BS3的超位移（用星号表示），而不是在p53缺陷细胞中。未检测到BS1、BS2或mutBS3的移位。(d日)在无50或有50的情况下培养的HCT116/wt细胞的抗p53 ChIP检测μM etoposide 72 h。该图显示BS3富集，但BS1和BS2在输入DNA上未富集。值是两个独立实验的平均值。(e（电子）)用10或50个MOI的腺病毒转导HCT116细胞以表达p53或p14^{农业研究基金}3天后，收集细胞并用qRT-PCR分析总RNA。p53在HCT116/p53中的表达^−/−和第14页^{农业研究基金}HCT116/wt细胞诱导Bak mRNA表达，而p14^{农业研究基金}不会触发HCT116/p53中Bak mRNA的上调^−/−细胞。数值代表平均值±S。D.来自至少三个独立实验

p53直接与BS3结合

由于BS3的唯一突变降低了报告基因的活性，我们接下来使用ds公司-包含每个假定结合位点序列的寡核苷酸。我们还将突变的BS3和p53共识结合位点纳入这些分析中。用足叶乙甙处理HCT116/wt细胞48小时后，将放射性标记探针与HCT116/wt细胞的核提取物孵育。在含有p53共有位点的样品中，很容易检测到蛋白质/DNA复合物，并且添加抗p53抗体产生超位移，证明了p53/DNA复合体的身份(图2c). 尽管EMSA中每个结合位点的寡核苷酸都发生了意外的移位，但BS3寡核苷酸却被抗p53药物过度移位。无论是否存在p53抗体，BS3突变都会消除蛋白质结合。因此，p53直接与BS3结合，BS3序列中必需的胞嘧啶和鸟嘌呤残基的突变破坏了p53的结合。我们进一步进行了EMSA，用依托泊苷处理的HCT116/p53提取物^−/−并检测每个结合位点的蛋白质/DNA复合物；然而，添加抗p53-Ab并没有产生超位移。这些结果证实了p53与BS3的直接结合，但也表明BS1-3与其他蛋白质结合。最后，我们进行染色质免疫沉淀（ChIP）来分析p53与BS1、BS2和BS3的结合烘烤细胞环境中的启动子。在依托泊苷处理的HCT116/wt细胞的抗p53 ChIP中，我们发现BS3富集，但BS1或BS2不富集(图2d)从而证实内源性p53与BS3的特异性结合烘烤发起人。

p53上调内源性Bak mRNA的表达

先前的结果表明，p53诱导靶基因表达烘烤启动子通过结合BS3构建。因此，我们研究了内源性烘烤基因表达和转导HCT116/p53^−/−具有编码p53的腺病毒不同MOI的细胞。Ad-p53转导细胞中Bak的mRNA水平升高（3天后约为6倍）(图2e). 我们还旨在以更生理的方式实现p53的上调，从而转导HCT116/wt和HCT116/p53^−/−腺病毒编码p14的细胞^{农业研究基金}第14页^{农业研究基金}抑制MDM2介导的p53降解并诱导p53水平升高。提高内源性p53水平明显导致HCT116/wt细胞中Bak mRNA水平升高（>10倍）(图2e). HCT116/p53的转导强调了这些结果的特异性^−/−细胞，其中p14^{农业研究基金}未诱导Bak mRNA表达(图2e).

然后我们研究了内源性p53在DNA损伤反应中的激活是否会驱动Bak的表达。我们孵育HCT116/wt细胞，作为对照，孵育等基因HCT116/p53^−/−然后用定量实时PCR（qRT-PCR）分析Bak mRNA的表达。在依托泊苷处理的HCT116/wt细胞中，Bak mRNA水平随着时间的推移而上调(图3a)也就是说，Bak表达在24小时后增加1.75倍，在72小时时增加到4.5倍^−/−用足叶乙甙处理的细胞，Bak mRNA表达的诱导作用不太明显（48小时为1.5倍，72小时为2.7倍；图3a).

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图3

p53依赖性基因诱导对DNA损伤反应的时间过程。HCT116/wt和HCT116/p53^−/−用50个μ依托泊苷24、48和72小时及Bak的表达(一)，第21页(b条)、美洲狮(c（c）)和Bax(d日)用qRT-PCR分析mRNA。Bak、Bax、Puma和p21的mRNA表达随着时间的推移在HCT116/wt和HCT116/p53中的依托泊苷治疗的反应而升高^−/−细胞。数值为平均值±S。D.来自三个独立实验

EMSA结果表明不同于p53的蛋白与BS1、BS2和BS3结合，这反映在p53阴性细胞中的Bak mRNA诱导。为了测试在没有p53的情况下上调是否是Bak特异性的，我们研究了已知的p53靶基因的诱导，如细胞周期依赖性激酶抑制剂p21、Bax和BH3-only蛋白Puma。^9,11,16,17与文献一致，qRT-PCR分析显示，所有靶基因对依托泊苷处理HCT116/wt细胞的反应都具有时间依赖性诱导。p21的诱导作用最强，72小时时达到55倍的表达水平(图3b). Puma的诱导低于p21（72小时时为25倍，图3c)Bax最弱（72 h时为7倍，图3d). 与Bak的结果相比，所有这些确定的p53靶基因也在p53缺失的HCT116/p53中诱导^−/−细胞，尽管程度较小。因此，我们的结论是烘烤可以被视为真诚地p53靶基因。

我们还测试了p53介导的靶基因诱导是否与DNA损伤强度相关。为此，我们治疗了HCT116/wt和HCT116/p53^−/−细胞与不同剂量的足叶乙甙作用48小时，导致浓度依赖性烘烤HCT116/wt和HCT116/p53中的诱导作用较小^−/−单元格(图4a). 为了进行比较，我们还分析了Bax、p21和Puma的mRNA诱导。在HCT116/wt细胞中，Bax mRNA的诱导与Bak的诱导相当(图4b)Puma mRNA的诱导表达高于Bax和Bak（高达4.5倍，图4c). 值得注意的是，无论依托泊苷的浓度如何，p21的诱导倍数约为16倍(图4d). HCT116/p53的多域蛋白Bax和Bak mRNA表达显著降低^−/−细胞与HCT116/wt细胞的比较(图4a–b). 足叶乙甙治疗后HCT116/p53中p21和Puma mRNA的表达略有升高^−/−单元格(图4c–d).

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图4

依托泊苷对p53靶基因mRNA和蛋白表达的影响分析。HCT116/wt和HCT116/p53^−/−用10μM、 50个μM、 和100μ足叶乙甙48小时和Bak的表达(一)，Bax(b条)、美洲狮(c（c）)和第21页(d日)用qRT-PCR分析mRNA。Bak和Puma mRNA的表达随着依托泊甙浓度的增加而增加，而Bax和p21 mRNA的诱导表达与依托泊甙的浓度无关。(e（电子）)HCT116/wt和HCT116/p53^−/−细胞与50μwestern blotting分析24、48和72小时的M etoposide以及p53、Bak、Bax和p21的表达。(（f）)HCT116/wt和HCT116/p53^−/−用指示浓度的足叶乙甙培养细胞48小时，并同样分析p53、Bak、Bax和p21蛋白的表达。在HCT116/wt中，在较小程度上也在HCT116/p53中^−/−细胞，Bak表达水平在一段时间内上升-(e（电子）)和浓度-(（f）)依赖的方式。数值为平均值±S。D.来自三个独立实验

p53依赖性上调Bak蛋白水平以应对DNA损伤

我们证明了p53对烘烤基因表达，并由此分析了用足叶乙甙处理24小时至72小时的细胞中Bak蛋白的表达。证实了我们的qRT-PCR结果，足叶乙苷在HCT116/wt细胞中强烈上调Bak蛋白，在HCT116/p53细胞中仅有微弱上调^−/−单元格(图4e). 在足叶乙甙治疗24小时时，p21蛋白的表达已经被高度诱导，然后随着时间的推移略有下降。Western blot分析也证实了Bax的p53依赖性诱导(图4e). 有趣的是，与野生型细胞相比，HCT116/p53^−/−细胞减少了Bak表达的基础水平。HCT116/wt细胞中Bak的表达可能是由基本量的p53引起的，而HCT116/p53中Bak表达较少^−/−细胞可能是由其他转录因子引起的。总之，低剂量足叶乙甙已经诱导了p21和Bax的表达，而Bak的表达呈剂量依赖性增加(图4f).

克隆和诱变

这个烘焙1通过PCR从克隆RPCIP704J10291Q（德国柏林RZPD）中扩增启动子区域，使用包含Xho公司我和Hin公司dIII限制位点。使用限制后Xho公司我和Hin公司dIII，将PCR产物连接到pGL3-Basic载体（Promega）中，生成pGL3-Basic-p53BS。通过PCR扩增，分别使用引物对mutBS1-for/BS-rev和BS-for/mutBS3-rev（补充表1）生成含有假定p53共有结合位点1和3突变的载体。随后将PCR产物连接到pGL3-Basic中，得到pGL3-Basic-mutBS1和pGL3-Basic-mut BS3。使用快速改变突变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA，USA）对结合位点2进行突变。载体pGL3-Basic-p53BS用作模板，两个互补引物mutBS2-for和mutBS2-rev（补充表1）引入了所需的突变，从而产生pGL3-Basic-mutBS2。为了同时生成在所有三个结合位点上均含有突变的载体pGL3-Basic-mutp53BS，使用引物mutBS1-for和mutBS3-rev对模板pGL3-Basic-mutBS2进行PCR扩增。所有载体序列均经DNA测序证实。

蛋白质印迹分析

通过刮擦收集细胞，然后在冰镇PBS中清洗，并在含有1%Nonide P-40、20 mM HEPES（pH 7.9）、2 mM PMSF、350 mM NaCl、1 mM MgCl的缓冲液中溶解₂、0.5 mM EDTA、0.1 mM EGTA和0.5 mM DTT，并添加完整的蛋白酶抑制剂混合物（德国曼海姆罗氏公司）。使用BCA测定试剂盒（Thermo Fischer Scientific，德国波恩）和15μ将每条通道中的g蛋白质加载到标准SDS-PAGE凝胶上，并在200 V下分离。通过罐式印迹法将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上（Amersham Bioscience GmbH，Freiburg，Germany）。在含有4%BSA和0.05%吐温-20的PBS中封闭膜1小时，然后用4°C的封闭缓冲液中稀释的一级抗体隔夜培养。在封闭缓冲液中洗涤膜三次后，施加适当的第二抗体（1:5000）1小时。最后，在使用ECL试剂（Amersham Biosciences）观察蛋白质之前，在PBS和0.05%吐温-20中再洗涤膜2小时。

转染和病毒转导

细胞在转染前接种在密度为7.5×10的六孔板或培养皿中24小时⁴细胞/厘米²根据制造商的方案，使用Fugene 6（Roche）或jetPEI（PEQLAB，Erlangen，Germany）试剂进行转染。在收集之前，将转基因细胞培养不同的时间段。p14的制备^{农业研究基金}如前所述，进行p53和p73腺病毒和细胞转导。^33,34,35

荧光素酶报告基因分析

分别用pGL3-Basic报告质粒和p53、Δ133p53、DNp73、p73的表达载体转染细胞δ，或空向量。^36,37,38转染后48小时，通过刮取收集细胞并在LLB（25 mM甘氨酰甘氨酸（pH 7.8）、15 mM MgSO）中溶解₄、4 mM EGTA（pH 8.0）、1 mM DTT和1%Triton X-100）在冰上放置5分钟。离心后（5分钟，10000×克), 10 μ100份上清液中有1份进行了化验μl荧光素酶检测缓冲液（15 mM磷酸钾（pH 7.8）、25 mM甘氨酸、15 mM硫酸镁₄、4 mM EGTA、1 mM DTT和2 mM ATP）。³⁹注射100后测量光发射μl荧光素（0.3 mg/ml）。

电泳迁移率变化分析

p53寡核苷酸购自Santa Cruz Biotechnology（美国加利福尼亚州圣克鲁斯），代表BS1、BS2、BS3和mutBS3的寡核苷酸（补充表2）购自Sigma。在存在的条件下，通过Klenow反应对杂交寡核苷酸进行放射性标记[γ]-³²P-ATP。核提取物（10μg） 来自足叶乙甙（50μM、 48 h）-处理HCT116/wt或HCT116/p53^−/−细胞在室温下与放射性标记的寡核苷酸孵育30分钟。对于超位移分析，1μ将g相应抗体添加到样品中，然后在冰上额外培养30分钟。样品在8%的0.5×TBE聚丙烯酰胺凝胶上以160 V的电压分离，干燥，并通过X射线胶片曝光3-5小时拍摄自射线照片。

定量实时PCR

细胞以1×10的密度播种⁵细胞/厘米²24小时后，将培养基更换为含有或不含有足叶乙甙（50μM） ●●●●。在指定的时间段后，通过刮取收集细胞，并根据制造商的方案，使用来自德国希尔登（Hilden）的RNeasy迷你试剂盒分离总RNA。互补DNA从1μg总RNA，使用两步方案：首先，将RNA与50μM随机六聚体引物（德国Leon-Rot的Fermentas GmbH）和40 U RNase-Inhibitor（RiboLock RNase Inhibitor，Fermenta）在65°C下放置10分钟。然后，200 U逆转录酶（Revert Aid H Minus M-MuLV reverse，Fermentias），10 mM DTT，400μM dNTP，并添加水，使最终体积为25μl、 样品在42°C下孵育50分钟，然后在72°C下最终热灭活10分钟。qPCR在ABI7300仪器（Applied Biosystems，Darmstadt，Germany）中使用1×Maxima SYBR Green qPCR Mastermix（Fermentas）、300 nM有义/反义引物和80 ng cDNA进行。qPCR程序首先在95℃下进行初始变性步骤10分钟，然后在95℃条件下进行40次循环15秒，在60℃条件下持续1分钟。通过将样品加热两次至95℃条件15秒和60℃条件1分钟，进行熔融曲线分析min.阴性对照反应中含有水而非cDNA，并包含在每次运行中，以确保无污染。用于分析的底漆第21页（Hs_CDKN1A_1_SG），彪马（Hs_BBC3_1_SG），以及烘烤（Hs_BAK1_1_SG）表达购自Qiagen，引物用于bax（巴克斯）表达（正向：5′-CACGGCAGAATGCCTATGA-3′，反向：5′-CCCAATTGCACTCTCAA-3′）由K Lauber博士（杜宾根大学医院）善意提供。结果归一化为GAPDH，并通过ΔΔC进行分析_t吨方法与未经处理的对照样品进行褶皱诱导。

我们感谢伯特·沃格尔斯坦（Bert Vogelstein）、玛蒂娜·米勒-席林（Martina Müller-Schilling）、斯特凡·库比卡（Stefan Kubicka）和克里斯汀·劳伯（Kirsten Lauber）提供了宝贵的材料和有益的讨论。我们也感谢Mohamed Hassan对EMSA实验的支持。这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（SFB773、SFB685、GRK1302）和BMBF（AID-Net）的支持。