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细胞死亡不同。2011年4月；18(4): 656–665.
2010年11月5日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cdd.2010.138
预防性维修识别码：PMC3131911项目
PMID：21052097

cIAP1和TAK1通过阻止RIP1/RIP3依赖性活性氧生成保护细胞免受TNF诱导的坏死

N Vanlangenakker公司，1,2 T Vanden Berghe公司，1,2 P波加特，1,2 B劳肯斯，三 K佐贝尔，4 K Deshayes公司，4 D武西奇，4 S富尔达，三 P范德纳贝勒，1,2,5,*和M J M贝特朗1,2,5
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补充资料

摘要

IAP家族的三个成员（X连锁凋亡抑制因子（XIAP）、细胞凋亡抑制蛋白-1/-2（cIAP1和cIAP2））是有效的凋亡抑制因子。最近的研究表明，与XIAP不同，cIAP1和cIAP2不是直接的caspase抑制剂，而是通过作为效应caspase和受体相互作用蛋白1（RIP1）的E3连接酶来阻止凋亡。cIAP介导的RIP1多泛素化使其与促生存激酶转化生长因子结合-β-激活激酶1（TAK1），阻止其激活caspase-8依赖性死亡，这是一个被去泛素酶CYLD逆转的过程。RIP1也是坏死的调节器，是一种半胱天冬酶非依赖型细胞死亡。在这里，我们表明，通过IAP拮抗剂BV6治疗耗尽IAP的细胞对肿瘤坏死因子（TNF）诱导的坏死非常敏感，但对抗Fas、聚（I:C）氧化应激诱导的坏死性死亡不敏感。RNAi对IAP的特异性靶向研究表明，cIAP1的阻遏是致敏的原因。同样，降低TAK1水平或抑制其激酶活性会使细胞对TNF诱导的坏死敏感，而抑制CYLD则有相反的效果。我们发现，这种对死亡的敏感性伴随着RIP1激酶活性的增强、RIP1通过死亡域和RIP3向Fas相关的Fas的招募增加（这允许坏死体的形成）以及RIP1酶依赖性活性氧物种（ROS）积累的增加。总之，我们的数据表明，cIAP1和TAK1通过阻止RIP1/RIP3依赖性ROS的产生，保护细胞免受TNF诱导的坏死。

关键词：TNFR1，坏死，小模拟，TAK1，cIAP1，坏死体

直到最近，与凋亡相比，坏死被定义为一种意外且不受控制的细胞死亡。这个定义现在已经过时了，因为积累的实验证据表明，坏死是一个由相当特定的生理和病理刺激激活的调节良好的过程。1坏死，或称程序性坏死，是一种与半胱氨酸蛋白酶无关的细胞死亡模式，在半胱氨酸酶未被激活或抑制的情况下普遍存在。2术语“坏死性下垂”仅限于由受体相互作用蛋白1（RIP1）激酶活性介导的调节性坏死细胞死亡，因此根据定义，它被坏死抑制素1（Nec-1）抑制。三，4然而，将细胞过程的定义局限于特定引发剂的激活可能是不合适的，因为不同的途径可能引发坏死过程。5坏死发生在器官移植过程中的缺血-再灌注损伤、心脏梗死、中风、神经变性疾病和病毒感染等疾病中。6目前对程序性坏死过程中参与和调节信号传导的蛋白质知之甚少。最近的报告已确定丝氨酸-苏氨酸RIP激酶家族的两个成员RIP1和RIP3是肿瘤坏死因子（TNF）介导的坏死过程的关键成分。7，8，9，10有趣的是，RIP1也参与了几个死亡受体触发的凋亡过程。11这表明，细胞凋亡和坏死最初被定义为相互排斥的细胞死亡过程，可能具有几个调节成分。

在调控凋亡过程的众多蛋白质中，凋亡抑制蛋白（IAP）家族的成员是凋亡细胞死亡的有力抑制剂。长期以来，人们一直认为它们的保护作用完全是由于它们能够结合和抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，但最近的研究结果对这一观点提出了挑战。结构-功能研究表明，在人类基因组中包含的八种IAP中，X-连锁凋亡抑制因子（XIAP）是唯一作为caspase直接抑制剂的IAP。12相反，凋亡蛋白-1和-2的细胞抑制剂（cIAP1和cIAP2）通过充当E3泛素连接酶（一种由其C末端环指结构域赋予的酶活性）来保护细胞免受凋亡。蛋白质泛素化正在成为一种关键的调控机制，其广泛的作用取决于泛素形成聚合物的能力：Lys48连接的泛素链通常以蛋白质为靶点进行蛋白酶体降解，而Lys63连接的链则充当信号复合物的对接位点。cIAP作为E3连接酶在细胞凋亡调节中的作用是复杂的，并且涉及Lys48和Lys63多泛素化。一方面，cIAP1介导caspase-3和-7的蛋白酶体降解13和NF-κB诱导激酶。14，15另一方面，cIAP介导的RIP1的Lys63多泛素化允许其与生存前激酶转化生长因子结合-β-活化激酶1（TAK1），阻止其激活由RIP1和caspase-8组成的促凋亡复合物。16因此，圆筒状瘤病（CYLD）是一种特异性水解Lys63连接的多泛素链的去泛素酶，可抵消cIAP对RIP1的促生存作用。17，18

观察到cIAP是细胞死亡的有力抑制因子，并且它们通过一种机制（不涉及直接caspase抑制，但需要调节RIP1泛素化状态）至少部分地介导这一功能，这表明cIAP和TAK1可能在坏死信号传导中发挥作用。在这项研究中，我们测试了这一想法，并确定cIAP1和TAK1是TNF诱导的程序性坏死的新调节因子。

结果

BV6治疗使细胞对TNF诱导的坏死敏感，但对抗Fas、聚（I:C）或过氧化氢诱导的坏死不敏感

一种广泛用于研究坏死细胞死亡的细胞系统是小鼠纤维肉瘤L929细胞系。在这些细胞中，仅用TNF刺激即可引起坏死，2Fas受体激动性抗体和泛酸酶抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp（OMe）-氟甲基酮（zVAD-fmk）的组合，19干扰素存在下的双链RNA（poly（I:C））-β（干扰素β),20或用过氧化氢（H）处理细胞2哦2).5作为研究cIAP在坏死细胞死亡中的潜在作用的第一种方法，我们使用了BV6，这是一种IAP拮抗剂，可诱导cIAP1和cIAP2的自泛素化和随后的蛋白酶体降解(图1a).15令人惊讶的是，我们发现BV6治疗对poly（I:C）+IFN诱导的坏死细胞死亡没有影响β、抗Fas+zVAD-fmk或H2哦2，但对肿瘤坏死因子诱导的坏死细胞高度敏感(图1b). 重要的是，单独接触BV6不会导致细胞死亡(图1b)甚至在极低剂量的TNF下也观察到对TNF的敏感性(图1c). 有趣的是，尽管用RIP1激酶抑制剂Nec-1治疗可以阻断TNF、poly（I:C）+IFN诱导的坏死β，和抗Fas+zVAD-fmk（补充图1A），BV6的IAP耗竭只能使细胞对TNF诱导的死亡敏感。如前所述，H2哦2-Nec-1不能阻断诱导的坏死。5为了测试TNF+BV6引起的细胞死亡增强是否纯粹是坏死的，而不是由于细胞凋亡的累积诱导，我们分析了胱天蛋白酶-3的处理，胱天蛋白酶-3是一种明确的细胞凋亡标志物。即使在高达83%的细胞死亡的条件下，也未检测到半胱氨酸蛋白酶-3的裂解。相反，在抗Fas治疗的对照组中观察到caspase-3处理(图1d). 为了确定BV6对TNF诱导的坏死的敏感性是仅限于L929细胞还是也适用于其他坏死模型系统，我们测试了BV6对于Fas相关死亡域（FADD）缺陷的Jurkat T细胞的作用。这些细胞中FADD的缺失使其对TNF诱导的凋亡产生抵抗，并导致系统坏死。正如在L929细胞中观察到的那样，BV6处理FADD缺陷Jurkat细胞导致cIAP1和cIAP2快速丢失，并使这些细胞对TNF诱导的坏死非常敏感(图1e). 综上所述，这些结果表明，BV6对TNF诱导的坏死具有特异性致敏作用，并且这种作用并不局限于L929细胞。

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BV6治疗使细胞对TNF诱导的坏死敏感，但对抗Fas、poly（I:C）或H诱导的坏死不敏感2哦2. (一)L929细胞用1μM BV6适用于指定的持续时间。细胞被裂解，cIAP1/2和XIAP被免疫印迹。(b)用干扰素预处理L929细胞β、zVAD-fmk或BV6存在下的介质，然后用上述触发器刺激指定时间。流式细胞术分析细胞死亡（%Sytox阳性）。数据是三个独立实验的代表。误差线表示标准偏差。(c（c）)L929细胞用BV6预处理并用一系列稀释的TNF刺激。20小时后，用MTT法测定细胞活力。误差线代表三倍的标准偏差。(d日)L929细胞用BV6预处理并用TNF刺激。制备细胞裂解物，并用western blot检测处理后的caspase-3。抗Fas刺激作为细胞凋亡的阳性对照。流式细胞术检测细胞死亡。(e（电子）)用BV6预处理FADD−/−Jurkat细胞并用TNF刺激24 h。用流式细胞术分析细胞死亡（PI阳性）。western blot检测cIAP1、cIAP2和XIAP水平。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01（曼·惠特尼U型-测试）

cIAP1缺失使L929细胞对TNF诱导的坏死敏感

为了排除BV6通过非靶向效应增强TNF诱导的坏死的可能性，我们接下来使用基于RNAi的方法研究了L929细胞中cIAP1、cIAP2和XIAP的特异性抑制作用。事实上，尽管BV6治疗不会改变XIAP水平，但最近的研究表明，BV6与XIAP的结合可能会取消其功能。21我们使用RIAP1（一种同时检测cIAP1和cIAP2的抗体）通过免疫印迹测试了cIAP和cIAP敲除的效率。22cIAP1 RNAi完全抑制了RIAP1检测到的信号，但cIAP2 RNAi没有改变它(图2a)这表明L929细胞中cIAP2蛋白水平低于免疫印迹检测限。因此，我们通过RT-PCR证实了cIAP2的抑制作用(图2b). 值得注意的是，我们发现cIAP1的抑制大大增加了TNF诱导的坏死细胞死亡，而cIAP2或XIAP的抑制没有影响(图2c). 这些数据清楚地表明，cIAP1在TNF诱导的L929细胞坏死中起到保护作用，并证实BV6的作用是由于cIAP2功能的丧失。

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cIAP1的缺失使L929细胞对TNF诱导的坏死敏感。(一)使用RNAi抑制cIAP1、cIAP2和XIAP的蛋白水平。western blot检测敲除效率。cIAP2的检测低于检测限。(b)用RT-PCR检测cIAP2的mRNA水平。巨噬细胞cDNA作为阳性对照。(c（c）)用TNF（10 000 IU/ml）刺激cIAP1、cIAP2或XIAP水平被抑制的L929细胞2、4或6小时。用流式细胞术分析细胞死亡（%Sytox阳性）。结果代表了至少三个独立实验。误差线表示标准偏差。***P（P）<0.001（曼·惠特尼U型-测试）

cIAP1阻遏诱导RIP1激酶活性

丝氨酸-苏氨酸RIP激酶家族的两个成员RIP1和RIP3是TNF诱导坏死过程的关键组成部分，根据最近的研究，这需要活性RIP1激酶三，9形成RIP1–RIP3–FADD坏死体复合体。7，8，10为了将cIAP1定位在TNF坏死途径中，我们用BV6和Nec-1单独或联合处理L929细胞，然后用致死剂量的TNF攻击它们4小时。Nec-1完全保护细胞免受TNF诱导的坏死，无论是否存在BV6(图3a). 即使在TNF刺激24小时后也观察到这种抑制作用（补充图1B）。在平行实验中，我们发现通过基于RNAi的方法耗尽RIP3也可以消除BV6对TNF诱导的死亡的敏感性，这使cIAP1上游或处于TNF坏死途径中RIP1和RIP3的水平(图3b). 接下来，通过观察细胞外信号调节激酶（ERK），23我们研究了cIAP1是否会影响RIP1激酶活性。我们观察到，BV6处理显著增强了TNF诱导的ERK磷酸化，并且通过结合使用BV6和Nec-1，我们证实了这种作用是RIP1激酶依赖性的(图3c). 为了排除这些化学试剂的非靶向效应的可能性，我们通过特异性抑制cIAP1和RIP1，证实了cIAP1-对RIP1激酶介导的ERK磷酸化的影响(图3d). 为了测试RIP1依赖性ERK磷酸化是否在BV6对TNF诱导的坏死的致敏作用中发挥直接作用，我们比较了在不存在或存在U0126（ERK活化激酶（丝裂原活化蛋白激酶1/2）的化学抑制剂）的情况下的细胞死亡，但我们没有观察到显著差异（补充图2）。通过观察RIP1磷酸化本身，也可以观察到cIAP1阻遏对RIP1激酶活性的影响。事实上，我们发现BV6预处理在TNF刺激后导致RIP1活动度改变(图3e).λ-免疫沉淀RIP1的磷酸酶处理证实这些修饰是由于磷酸化(图3f)与BV6和Nec-1联合治疗表明，在BV6存在的情况下，TNF诱导的RIP1磷酸化需要RIP1激酶活性(图3g). 我们得出结论，cIAP1缺失可诱导RIP1激酶活性，这是TNF诱导的坏死体形成所必需的。8，10

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cIAP1阻遏诱导RIP1激酶活性。(一)L929细胞用10μM Nec-1和1μM BV6刺激2h，TNF刺激4h(b)L929中的RIP3水平通过使用RNAi而降低。72小时后，用BV6预处理细胞并用TNF刺激6小时。结果至少代表了三个独立的实验。误差线表示标准偏差。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01（曼恩-惠特尼U型-测试）。(c（c）)在Nec-1存在或不存在的情况下，用BV6预处理L929细胞。接下来，用TNF刺激细胞并裂解。western blot检测ERK活化（磷酸化ERK）。(d日)在L929细胞中使用RNAi抑制cIAP1和RIP1水平。其次，在TNF刺激后检测ERK磷酸化。western blot检测敲除效率。(e（电子）)L929细胞用BV6预处理并用TNF刺激。(（f）)在TNF刺激后，RIP1被免疫沉淀，样品用λ-磷酸酶。(克)L929细胞用BV6和Nec-1预处理，然后用TNF刺激。用western blot观察RIP1蛋白水平

cIAP1和TAK1调节坏死体复合体的形成

先前对肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）信号转导的研究表明，cIAP介导的RIP1的Lys63泛素化通过诱导含TAK1的促生存复合物的形成，防止RIP1激活caspase-8死亡复合物，从而保护细胞免受凋亡。16因此，CYLD，一种Lys63特异性去泛素酶，被证明通过刺激RIP1–caspase-8死亡复合物的形成来增强TNF诱导的凋亡。18最近的研究还表明，TNFR1介导的坏死需要形成包含RIP1、RIP3和FADD的细胞溶质坏死体复合物。7，8，10为了研究cIAP1和TAK1是否通过阻止这种死亡复合物的形成来保护细胞免受TNFR1诱导的坏死性死亡，我们首先测试了TAK1抑制L929细胞的作用。如所示图4aTAK1 RNAi使细胞对TNF诱导的坏死具有强烈的敏感性，重要的是，当Nec-1阻断RIP1激酶活性时，这种作用被消除。为了测试TAK1的保护作用是否需要其激酶活性，我们用TAK1激酶抑制剂5Z-7-氧代烯醇（5Z-7）的衍生物预处理L929细胞。与TAK1缺失一样，使用5Z-7对L929细胞强烈致敏TNF诱导的坏死，Nec-1也能阻止这种效应(图4b). 在平行实验中，我们发现降低CYLD水平可以保护L929细胞免受TNF诱导的坏死(图4c). 接下来，我们分析了用BV6耗尽cIAP1以及用5Z-7抑制TAK1激酶活性如何影响坏死体复合体的形成。如所示图4d和e在TNF刺激后，这两种治疗都导致RIP1向RIP3和FADD的募集增加。正如Cho之前报告的那样等。，10我们发现RIP3与FADD的本构结合。总之，我们的数据表明，cIAP1和TAK1通过阻止RIP1–RIP3–FADD坏死体的形成，保护细胞免受TNF诱导的坏死。

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cIAP1和TAK1调节坏死体复合体的形成。(一)使用RNAi抑制L929中的TAK1水平。72小时后，用Nec-1预处理细胞并用TNF触发。(b)用Nec-1（10）预处理L929细胞μM） 和TAK1激酶抑制剂5Z-7（1μM） 1小时，然后用TNF（10 000 IU/ml）刺激2小时(c（c）)如上所述，L929细胞中的CYLD水平降低，然后用TNF刺激4或6小时。通过流式细胞术分析细胞死亡（Sytox阳性率%）。通过蛋白质印迹检查敲除效率。结果代表了至少三个独立实验。误差线表示标准偏差。*P（P）<0.05;***P（P）<0.001（曼·惠特尼U型-测试）。(d日和e（电子）)L929细胞用BV6或5Z-7预处理，然后用TNF刺激。对FADD进行免疫沉淀和免疫印迹

cIAP1或TAK1耗竭增加TNF诱导的RIP1/RIP3依赖性ROS生成

RIP1/RIP3介导的细胞死亡被认为依赖于活性氧（ROS）的产生。7，24，25为了确定cIAP1-depleted L929细胞对TNF诱导的坏死细胞死亡的敏感性是否涉及ROS的生成或替代死亡机制的激活，我们监测了ROS的产生。如所示图5a和bTNF诱导的RIP1/RIP3依赖性死亡伴随着适度的细胞内ROS生成，这是通过用二氢罗丹明123（DHR123）培养细胞来测量的。有趣的是，我们发现BV6治疗在TNF刺激下诱导了快速大量的ROS生成；当Nec-1或RIP3水平抑制细胞死亡时，这种活性氧的生成被大大抑制(图5a和b). 与BV6治疗一样，RNAi降低cIAP1或TAK1水平也显著增加了ROS生成，以应对TNF，而抑制CYLD水平则阻止了ROS的生成(图5c和d). 正如预期的那样，XIAP敲除对TNF依赖的ROS诱导没有影响。为了测试在cIAP1缺失的L929细胞中观察到的ROS生成增加是否与TNF诱导的坏死致敏有关，我们比较了单独使用BV6或与抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）联合使用时L929的细胞死亡。BHA处理大大降低了BV6对TNF诱导的坏死的敏感性，这表明在cIAP1-depleted L929细胞中监测到的ROS生成峰值是导致细胞死亡增加的原因(图5e).

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cIAP1和TAK1耗竭增加TNF诱导的RIP1/RIP3依赖性ROS生成。(一)L929细胞用BV6和Nec-1预处理，然后用TNF（10 000 IU/ml）刺激。(b)用RNAi降低L929细胞中RIP3水平72小时，然后用BV6和TNF处理。蛋白质水平(c（c）)cIAP1或XIAP和(d日)使用RNAi降低TAK1或CYLD，然后刺激TNF。(e（电子）)用BV6和100预处理L929细胞μM底部钻具组合。(（f）)p22phox（由徐华使用RNAi抑制基因）和Ndufb8水平，然后使用BV6治疗和TNF刺激。通过western blot或RT-PCR检测敲除效率。流式细胞术同时分析细胞死亡（%Sytox阳性）和ROS生成（ΔMFI（DHR123））。结果代表了至少两个独立的实验。误差条表示标准偏差

TNF-介导的活性氧产生可能来自NADPH氧化酶复合物26或线粒体。5，25由于BHA不仅是一种广泛的活性氧清除剂，而且还是一种胞浆磷脂酶A2抑制剂，27我们通过比较它们的特异性抑制作用来研究每种来源的致死贡献。最近的一项研究报告称，ROS的生成需要核黄素激酶（RFK）和NADPH氧化酶Nox1和Nox2向TNFR1的募集。26，28我们发现，RNAi对NADPH氧化酶复合物组分（RFK、Nox1和p22phox）的特异性抑制并不影响TNF或TNF+BV6诱导的死亡，但对NADH脱氢酶（泛醌）1β亚复合物8（NDUFB8）（线粒体复合物I亚基）的抑制使其强烈减弱(图5f和数据未显示）。因此，我们的结果表明，在缺乏cIAP1的情况下，TNF诱导的L929细胞坏死需要RIP1/3介导的线粒体ROS产生。我们还发现，cIAP1的缺失大大增强了TNF诱导的ROS生成，而没有诱导RIP1或RIP3向线粒体移位；这表明涉及其他细胞质中间产物（补充图3）。总之，我们的结果表明，cIAP1和TAK1通过抑制RIP1激酶依赖性诱导ROS生成和细胞死亡，保护L929细胞免受TNF诱导的坏死。

讨论

RIP1激酶抑制剂Nec-1的鉴定使研究人员能够揭示在越来越多的病理条件下坏死细胞死亡的参与。三，4事实上，RIP1激酶活性在大多数凋亡状态下是不必要的，但对于激活一种最近被称为坏死的调节型坏死至关重要。4，29如果没有体内激酶活性RIP1的遗传模型，Nec-1的使用已成为研究RIP1激酶功能的最佳工具。迄今为止，坏死细胞死亡与神经元毒性、缺血性脑损伤、心肌梗死、化疗诱导的细胞死亡以及病毒感染有关。1，10RIP1参与凋亡和坏死途径的发现表明，这些最初被定义为相互排斥的细胞死亡过程可能具有类似的调节机制。18IAP家族成员通过抑制caspases和调节RIP1泛素化状态保护细胞免受凋亡。12，13，16，30，31此外，IAP与一些依赖RIP1的凋亡触发因子有关（如TNFR1、Fas或toll样受体3（TLR3）的刺激）14，15，16，18，32，33，34在某些条件下也会导致坏死细胞死亡。我们发现IAP拮抗剂BV6能显著提高L929细胞对TNF诱导的坏死细胞死亡的敏感性，但对poly（I:C）+IFN诱导的坏死不敏感β、抗Fas+zVAD-fmk或H2哦2我们使用RNAi方法证实了这些结果，并确定cIAP1是TNF诱导坏死的主要调节因子。除了H2哦2所有上述坏死触发因子都需要完整的RIP1激酶活性（被Nec-1抑制）。5，9，20因此，我们的结果显示cIAP1仅参与L929细胞中RIP1依赖性坏死通路的一个子集。

格泽里克等。32最近有报道称，cIAP的丢失使角质形成细胞系对FasL诱导的凋亡敏感。有趣的是，在这些细胞中，IAP拮抗剂的存在允许在胱天蛋白酶被抑制的条件下适度诱导坏死，而在缺乏IAP拮抗剂的情况下显然不会发生这种情况。该观察结果表明，cIAP的存在对FasL诱导的坏死具有负调节作用。同样，作者表明，缺乏IAP的小鼠胚胎成纤维细胞对FasL诱导的一种细胞死亡敏感，这种细胞死亡只能通过Nec-1和caspase抑制结合来阻断，表明坏死细胞死亡。在我们的L929细胞系统中，触发Fas可诱导凋亡，而BV6治疗不会引起凋亡（数据未显示）。当在zVAD-fmk存在下触发Fas时，L929细胞中观察到纯坏死细胞死亡，而且BV6治疗对细胞活力没有影响(图1). 这表明cIAP在Fas介导的凋亡或坏死细胞死亡中没有保护作用。我们的结果与Geserick的结果之间观察到的差异等。可以用细胞死亡诱导的差异时间动力学（2–3h）来解释对24–48小时，在L929细胞的情况下没有致敏的空间）或使用不同的触发物（FasL对激动性Fas受体抗体），不同IAP拮抗剂（化合物A对BV6）和不同的细胞类型。此外，MEF对Fas诱导的死亡反应不敏感；这只在敏化条件下才显示出来，例如添加环己酰亚胺或IAP抑制剂，再次显示出与L929模型系统的主要差异。然而，结合先前的研究，我们的结果表明RIP1的泛素化阻止了它激活死亡途径。cIAPs作为TNFR1下游RIP1的E3泛素连接酶的发现解释了为什么cIAPs缺失的细胞对TNF诱导的死亡极为敏感。当用TLR3或Fas激动剂刺激L929细胞时，BV6未诱导致敏，这可能表明其他E3泛素连接酶可能以细胞类型特异的方式对RIP1产生泛素依赖性保护作用。这个假设与Chang的最新发现一致等。，35世卫组织报道了pellino 1在TLR3信号传导中作为RIP1的E3泛素连接酶。

多泛素化蛋白质的命运在很大程度上取决于泛素连接的性质。一般来说，添加Lys48多泛素链可使蛋白酶体识别和降解，而Lys63泛素化已成为将信号从受体传递到细胞内激酶级联的关键调控事件。cIAP介导的RIP1的Lys63泛素化已被证明通过形成含有TAK1的促生存复合物来防止RIP1激活caspase-8依赖性死亡，从而保护细胞免受TNF诱导的凋亡。16因此，CYLD的Lys63特异性去泛素酶活性被认为可以通过恢复cIAP的作用来增强TNF诱导的凋亡。18在这里，我们使用Nec-1-和RIP3-特异性RNAi，将cIAP1和TAK1定位在上游或RIP1/3水平，发现抑制任一蛋白都会使L929细胞对TNF-诱导的坏死高度敏感，而降低CYLD水平则有相反的效果。我们检测TNF-诱导的RIP1泛素化的尝试失败，很可能是因为L929细胞中泛素化RIP1水平较低。然而，我们的结果表明，cIAP1通过RIP1的Lys63泛素化保护L929细胞免受TNF诱导的坏死。很容易推测，Lys63-泛素化RIP1允许形成含有TAK1的促生存复合物，抑制RIP1激酶活性。与此假设一致，我们发现当cIAP1表达受到抑制时，TNF诱导的RIP1激酶依赖性ERK磷酸化显著增加。与之前的结果一致，我们还发现阻断ERK磷酸化对BV6诱导的TNF诱导的坏死敏化没有明显的抑制作用。24有趣的是，我们发现在RIP1向RIP3和FADD募集的同时，预先摄入BV6的L929细胞导致了TNF-诱导的RIP1激酶依赖性磷酸化RIP1。需要进一步研究以确定BV6诱导的RIP1磷酸化位点，这可能与RIP1和RIP3复合物的形成以及坏死细胞死亡的诱导有关。

一些研究报告称，RIP1/RIP3调节的坏死是ROS介导的，我们证实了细胞死亡与RIP3或RIP1激酶依赖的ROS诱导之间的密切关系。因此，我们研究了cIAP1的缺失是否影响活性氧的产生。降低cIAP1浓度不会影响ROS的基础水平。然而，在TNF刺激下，ROS生成显著增加，这种作用被Nec-1和敲低RIP3所抑制。有趣的是，降低CYLD水平也抑制了ROS的诱导，这表明RIP1的泛素化状态决定了其诱导ROS的激酶依赖性能力。尽管有争议，RIP1诱导NF的能力-κB的激活依赖于其泛素化状态，Lys63-泛素链作为TAK1的招募和IKK复合物的激活的支架。36，37，38我们发现，抑制TAK1水平或抑制其激酶活性会使细胞对TNF诱导的坏死敏感，并导致ROS生成增加。因此，由于缺乏NF，cIAP1缺乏可能会增加TNF诱导的ROS的产生-κB激活。事实上，cIAP是RIP1的E316，39在TNF诱导的NF中起关键作用-κB激活，已知其可上调细胞的抗氧化能力。40然而，我们的结果否定了这种可能性。事实上，我们发现Nec-1可以防止BV6诱导的TNF依赖性致敏死亡，并减少ROS的生成，而不会恢复NF-κB容量（未显示数据）。这些数据与之前报告NF的研究一致-κB不能防止TNF诱导的坏死。41综合起来，我们的结果表明NF-κB抑制不足以解释大量TNF-依赖性ROS的产生，并表明cIAP1、TAK1和CYLD通过泛素化调节RIP1激酶活性，在调节ROS的生成中发挥直接作用。

总之，这项工作补充并扩展了He最近发表的一篇文章中的数据等。他发现IAP拮抗剂（smac mimetic）和zVAD-fmk联合治疗的细胞中TNF-依赖性坏死细胞死亡增加。我们发现坏死细胞和凋亡细胞的死亡有一些共同的调节成分和机制。我们还描述了cIAP1和TAK1通过调节RIP1激酶依赖的ROS生成，保护细胞免受TNF诱导的坏死的新功能。

材料和方法

细胞系

L929sAhFas细胞是通过表达人Fas公司小鼠纤维肉瘤细胞系L929的TNF敏感衍生物L929sA细胞中的基因。2这些细胞被称为L929细胞，在添加了10%胎牛血清、青霉素（100 IU/ml）、链霉素（0.1 mg/ml）和谷氨酰胺（0.03%）的杜尔贝科改良Eagle's培养基中培养。FADD缺陷的人Jurkat克隆是J Blenis博士的礼物，在添加10%胎牛血清、1 mM-谷氨酰胺、25 mM HEPES缓冲液、50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。

抗体、细胞因子和试剂

我们实验室生产和纯化的重组人TNF的同质性至少为99%，其比生物活性为3×107 IU/mg，用于刺激L929细胞。用人类TNF刺激FADD−/−Jurkat细胞（德国柏林Biochrom AG）。抗人Fas抗体（克隆2R2；Cell Diagnostica，Munster，Germany）和poly（I:C）（合成dsRNA）（Amersham Pharmacia Biotech，Rainham，UK）的使用浓度分别为125 ng/ml和3.5 ng/mlμ分别为g/ml。重组小鼠干扰素β，生产于大肠杆菌并在我们的实验室中纯化，以1000 IU/ml的浓度使用。半胱天冬酶肽抑制剂zVAD-fmk（瑞士布本多夫巴切姆）在10μM.BHA、U0126、3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）和H2哦230%（均来自美国密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich）分别在100μM、 20个μM、 500个μg/ml和2 mM.Nec-1（Calbiochem，San Diego，CA，USA）在10μM.IAP拮抗剂BV6在1μM（Genentech Inc.，美国加利福尼亚州南旧金山）。5Z-7的衍生物NP-009245用于1μM（德国波茨坦AnalytCon Discovery GmbH）。Sytox Red Dead Cell Stain，DHR123（分子探针-Invitrogen，Eugene，OR，USA）和碘化丙啶（Sigma Aldrich，Steinheim，Germany）分别在5 nM，1μM、 和3μM.以下抗体用于L929细胞：抗cIAP1和cIAP2抗体（RIAP1抗体，22加拿大渥太华大学RG Korneluk博士赠送的礼物，抗XIAP单克隆抗体（MBL国际，马萨诸塞州沃本，美国），抗-β-微管蛋白（HRP）（英国剑桥Abcam），抗-β-肌动蛋白（克隆C4；MP Biomedicals Europe N.V.，Illkirch，France）、抗全长和加工小鼠caspase-3的抗体（自制兔多克隆抗体）、抗NDUFB8（MS105）（Bio-Connect B.V.，TE Huissen，荷兰）、抗p44/42 MAPK（ERK1/2）、抗磷酸-p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）、抗TAK1（M-579）、抗CYLD（CYLD1（E-10））（均来自美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司）、抗RIP1（610459；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USAc（c）（BD Pharmingen，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。在FADD−/−Jurkat细胞中，我们使用抗cIAP1和抗cIAP2（Santa Cruz Biotechnology、抗XIAP单克隆抗体（BD Pharmingen）和抗-β-肌动蛋白抗体（BD Biosciences）。

免疫沉淀

L929细胞在NP-40缓冲液（150 mM NaCl，1%NP-40，10%甘油，10 mM Tris（pH 8））中溶解，该缓冲液含有完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（编号11873580001）和磷酸酶抑制剂鸡尾草片（PhosSTOP，编号04906837001）（均来自比利时维沃德罗氏诊断公司）。使用抗FADD（M-19，sc-6036）（Santa Cruz Biotechnology）免疫沉淀FADD，并使用抗FADD 12E7（从澳大利亚墨尔本威海斯特拉瑟博士处获得）揭示FADD。

细胞存活、细胞死亡和活性氧生成的分析

使用Cellquest软件在双激光（488和635nm）FACSCalibur上或使用FACSDiva软件（均来自BD Biosciences）在三激光（405、488和635nm）LSR-II上通过流式细胞术分析细胞死亡和ROS产生。用干扰素预处理L929细胞β18小时，BV6 2小时，zVAD-fmk、Nec-1、5Z-7、BHA或U0126 1小时。TNF（10 000 IU/ml），h2哦2（2mM）、聚（I:C）（3.5μg/ml），或在指定的时间段内添加抗Fas（125 ng/ml）。通过测量Sytox红或PI发射荧光来确定细胞死亡或质膜完整性的丧失。通过测量DHR123到R123的转化率来测定细胞活性氧的产生。只有活细胞（Sytox阴性）被选通以分析ROS生成。ROS生成值表示为ΔMFI（DHR123）（DHR123-荧光强度中值减去背景值）。所有实验至少进行两次，一式三次。根据标准方案，通过MTT分析测定细胞存活率。

RNAi介导的敲除

根据制造商的方案，使用靶向cIAP1、cIAP2、XIAP、RIP3、TAK1、CYLD、Cyba或NDUFB8的20 nM siRNA在六孔板中转染L929细胞。作为阴性对照，我们使用siCONTROL非靶向siRNA（ON-TARGET加SMART池siRNA；Dharmacon，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）。干扰素（Polyplus-transformation SA，Illkirch，France）用作转染试剂。72小时后，用TNF刺激L929细胞，并如上所述测定细胞死亡。通过western blot或RT-PCR检测敲除效率。

逆转录聚合酶链反应

使用RNeasy Plus Mini Kit（荷兰Venlo，Qiagen）从L929细胞制备RNA。从2开始μg RNA，cDNA使用SuperScript逆转录酶III试剂盒（Invitrogen，Eugene，OR，USA）合成。PCR使用GoTaq Green Mastermix（Promega，Fitchburg，WI，USA）进行。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并通过SYBR Safe DNA凝胶染色（分子探针-Invitrogen）进行可视化。

线粒体分级分析

根据制造商的方案（线粒体/细胞质分馏试剂盒；BioVision，加利福尼亚州山景城，美国）对L929细胞的细胞质和线粒体部分进行富集。对于每个条件，5×107使用L929细胞。

致谢

我们感谢Wim Declercq教授和Saskia Lippens博士的批判性反馈和讨论，感谢A Bredan博士的编辑。我们非常感谢RG Korneluk博士发送RIAP1抗体。TV和MB获得了FWO的博士后奖学金，PB由VIB支付，NV获得了根特大学BOF的博士前奖学金。BL是一名硕士生，在西蒙·富尔达教授和彼得·范德纳贝勒教授的实验室工作。Vandenabeele小组的研究得到了VIB、根特大学、法兰德斯研究基金会（FWO-Vlaanderen）（3G.0218.06和G.0226.09）、联邦研究计划IAP 6/18、欧洲研究计划FP6 ApopTrain（MRTN-CT-035624）和FP7 Apo-Sys 200767以及UGent MRP倡议的group-ID财团的支持。PV持有来自佛兰德斯政府的Methusalem赠款（BOF09/01M00709）。Fulda小组的研究得到了德国Forschungsgemeinschaft、联邦研究计划IAP 6/18、欧洲研究计划FP6 ApopTrain（MRTN-CT-035624）和FP7 Apo-Sys 200767的支持。

词汇表

5Z-7型5Z-7-氧代烯醇
底部钻具组合丁基羟基茴香醚
cIAP1/2细胞凋亡抑制蛋白s-1/-2
气缸柱状色变
123达令吉二氢罗丹明123
ERK公司细胞外信号调节激酶
FADD公司Fas通过死亡域关联
H（H）2哦2过氧化氢
干扰素β干扰素-β
MEK1/2型丝裂原活化蛋白激酶1/2
NDUFB8型NADH脱氢酶（泛醌）1β亚复合物8
Nec-1号机组坏死抑制素-1
1号NADPH氧化酶1
RFK公司核黄素激酶
安息受体相互作用蛋白
ROS公司活性氧物种
TAK1（拍摄1）转化生长因子-β-活化激酶1
TLR3级toll样受体3
TNF公司肿瘤坏死因子
肿瘤坏死因子受体1肿瘤坏死因子受体1
XIAP公司X-连锁凋亡抑制剂
zVAD-fmk公司苄氧羰基-Val-Ala-Asp（OMe）-氟甲基酮

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

细胞死亡和分化网站上的论文附有补充信息(http://www.nature.com/cdd)

编辑：M Deshmukh

补充材料

补充图1-3

补充图形图例

工具书类

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文章来自细胞死亡与分化由以下人员提供自然出版集团