美国生理学杂志心脏循环生理学。2011年7月；301（1）：H87–H97。
基质金属蛋白酶抑制剂多西环素减少自发性高血压大鼠脑缺血后血管重塑和损伤
密歇根州立大学药理学和毒理学系，密歇根州东兰辛
通讯作者。转载请求和其他通信地址：P.W.Pires，药理学和毒理学部，B346 Life Sciences Bldg.，Michigan State Univ.，East Lansing，MI 48824（电子邮件：在uapserip时的ude.usm). 2010年12月2日收到；2011年4月26日接受。
摘要
基质金属蛋白酶（MMPs）是一个参与细胞外基质转换的锌肽酶家族。有证据表明，MMP活性增加与慢性高血压阻力血管重塑有关。因此，我们假设多西环素（DOX）抑制MMP活性会减弱血管重塑。用DOX（50 mg·kg）治疗6周龄雄性自发性高血压大鼠（SHRSP）−1·天−1饮用水中）6周。未经治疗的SHRSP为对照组。上周通过遥测技术测量了血压。通过压力肌电图评估大脑中动脉（MCA）和肠系膜阻力动脉（MRA）的被动结构。Western blot检测主动脉中MMP-2的表达。所有结果均为平均值±SE。DOX导致平均动脉压略有增加（SHRSP，154±1；SHRSP+DOX，159±3 mmHg；P（P）< 0.001). 自SHRSP+DOX后，主动脉中活性MMP-2表达降低（0.21±0.06 vs.0.49±0.13任意单位；P（P）< 0.05). 在MCA中，在80 mmHg时，DOX治疗增加了管腔（273.2±4.7 vs.238.3±6.3μm；P（P）<0.05）和外径（321±5.3 vs.290±7.6μm；P（P）<0.05），并降低了壁腔比（0.09±0.002 vs.0.11±0.003；P（P）< 0.05). SHRSP+DOX组短暂性脑缺血（短暂性MCA闭塞）后的损伤减轻（20.7±4 vs.45.5±5%半球梗死；P（P）< 0.05). 在MRA中，DOX为90 mmHg时，壁厚减少（29±1 vs.22±1μm；P（P）<0.001）和壁腔比（0.08±0.004 vs.0.11±0.008；P（P）<0.05）而不改变管腔直径。这些结果表明MMPs参与了外周血管和脑血管的高血压血管重塑，DOX减少了脑缺血后的脑损伤。
关键词：血管重塑，大脑中动脉，高血压
缺血的一级预防中风作为高危人群管理策略的重要性日益增加。最近发表的临床试验(18)如ONTARGET和TRANSCEND，表明旨在减少心血管事件的治疗是预防首次发生心肌梗死、心力衰竭和中风的有价值的工具。在ONTARGET试验中，在观察到有益效果之前，系统血压没有降低。因此，缺血性中风风险的主要组成部分可能不是血压本身。血管适应增加的腔内压力可能会带来额外的风险。因此，预防高血压血管重塑可能是卒中一级预防的候选者。
脑缺血引起的损伤与大脑中动脉的高血压重塑程度有关（MCA；参考文献。13,14,38,42). 阻力血管系统的重塑包括导致管腔直径减小、壁厚和壁腔比增加的结构变化(2,17,23,36). 总之，这些改变可能导致血管自动调节和扩张能力受损。在脑血管系统中，这些损伤可能导致血流减少和缺血性损伤增加(13). 当人们认为减轻血管重塑是预防中风的主要策略时，重要的是要确定对脑血管系统有最大影响而对周围影响不大的药物，以避免降低血压或损害其控制。
血管重塑可由平滑肌细胞肥大或增生、细胞外基质（ECM）元素沉积或这两种因素的组合引起(17). 血管壁中的ECM周转部分受锌依赖性蛋白酶家族（称为基质金属蛋白酶（MMPs；参考文献。19,40). 其中，MMP-2和-9，也称为明胶酶A和B，负责基底膜元件（主要是IV型胶原和层粘连蛋白）的降解和I型胶原纤维（明胶）的消化(21,37). 在许多高血压模型中，血管中MMP-2活性增加，并与血管重塑相关(6,12,19). 多西环素（DOX）是一种四环素类抗生素和非特异性MMP抑制剂，被证明可以预防高血压双肾单夹模型的主动脉重塑(4,5). 然而，人们对DOX在高血压大鼠抵抗性血管系统中的作用以及这些作用与末端器官损伤的关系知之甚少。因此，我们假设DOX抑制MMPs可减轻自发性高血压大鼠（SHRSP）脑血管的高血压重构，脑血管结构的改善可减少脑缺血引起的损伤。
材料和方法
动物和治疗。
实验中使用了6周龄的雄性SHRSP。大鼠分为两组：一组在饮用水中给予DOX 6周[SHRSP+DOX，50 mg·kg−1·天−1;n个=28:10用于压力肌电图，5用于遥测，5用于短暂性MCA闭塞（tMCAO），8用于永久性MCA阻塞（pMCAO。未经治疗的SHRSP为对照组(n个=28:12用于压力肌电图，5用于遥测，5用于tMCAO，6用于pMCAO）。12周龄血压正常的Wystar Kyoto（WKY）大鼠被随机分为两组：未经治疗的WKY(n个=4）和WKY+DOX(n个= 7). 它们被用于被动血管结构研究。这些被纳入研究，以验证SHRSP中的重塑，并评估DOX可能的血压依赖性影响。DOX剂量是根据先导试验的结果选择的，使用三种剂量：25、50和100 mg·kg−1·天−1在该研究中，我们观察到50 mg·kg−1·天−1对MMP-2的抑制作用最强；因此，我们使用这个剂量进行了所有进一步的实验。动物以12:12小时的光-暗周期饲养，可随意享用常规食物和水。每天新鲜制备DOX水。实验方案由密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会根据美国生理学会的“动物护理和使用指导原则”批准
血压测量。
在实验的最后一周，通过遥测测量SHRSP+DOX和未治疗的SHRSP的血压。将遥测仪的导管（TA11PAC40；Data Sciences International）通过股动脉插入远端主动脉，并将传送器体置于皮下。在开始记录血压之前，允许大鼠恢复1周。在治疗的最后一周，在24小时周期内每10分钟测量一次血压和心率(30). 使用白天和夜间的平均值计算每日血压，并报告一周的平均值。
MCA结构。
如前所述，使用压力肌电图评估MCA结构(42). 分离MCA并将其置于低温生理盐水（PSS；单位：mmol/l:141.9 NaCl，4.7 KCl，1.7 MgSO）中4，0.5乙二胺四乙酸，2.8氯化钙2，10.0 HEPES，1.2 KH2人事军官4和5.0葡萄糖）。MCA最靠近Willis环的第一个无分支部分安装在压力肌电图仪的两个玻璃微移液管上（丹麦奥胡斯丹麦Myo Technology）。在80 mmHg的腔内压力下，用温热氧合PSS冲洗血管，使血管平衡30 min。然后将压力增加到140 mmHg，持续10 min，然后降低到80 mmHg，以检查MCA的生存能力。产生<20%自发音调的血管被丢弃(9). 使用以下公式计算色调：%Tone=[1−（主动管腔直径/被动管腔直径）]*100。通过增加缓激肽（BK；10）的浓度来评估MCA的血管舒张能力−10到10−6M） 添加到浴中。然后将MCA冲洗至基线，并使用血管收缩剂5-羟基三胺（5-HT；10−9到10−5M） 被添加到浴缸中。然后将MCA冲洗至基线，通过将腔内压力从3毫米汞柱增加至180毫米汞柱（以20毫米汞柱为增量）来评估音调的产生。在进行测量之前，允许MCA在每个新压力下平衡5分钟。在含有2 mM EGTA的无钙PSS中，按照相同的压力增量，分析了MCA无源结构。在平衡5分钟后，测量每个压力下的流道直径、外径和壁厚。使用上述方法计算壁腔比、周向壁应力和壁应变(三). 根据单个血管的应力/应变曲线计算弹性模量（β系数），并将这些曲线拟合为指数模型(年=声发射βx)式中，β是曲线的斜率：β系数越高，容器越硬。
肠系膜阻力动脉结构。
根据MCA所述，在零流量和无钙条件下分析肠系膜阻力动脉（MRA）的被动结构，但压力以30 mmHg的增量从3升高到180 mmHg。
麦考。
为了诱导脑缺血，我们使用了Longa等人开发的管腔内缝合模型(33)如我们实验室之前所述(38,41). 所有接受MCAO的动物在手术前48小时停用DOX，以避免DOX对脑缺血结果可能产生的任何急性影响（啮齿动物的DOX半衰期为～4小时；参考。15). 大鼠最初在诱导室中用异氟醚麻醉，并用2%异氟醚氧气维持麻醉；体温维持在37°C。在头部顶部切开一个切口，露出颅骨，通过扫描激光多普勒测量软脑膜血流，并连接激光多普勒血流探头，测量MCA供应区域（前角外侧5mm，后角1mm）的血流。中线切口暴露颈动脉。烧灼舌动脉和甲状腺动脉，缝合颈外动脉和翼腭动脉。将带有圆形端部的3-0尼龙单丝（Doccol，Redland，CA）插入颈总动脉。然后，单丝通过颈内动脉进入大脑中动脉，阻止血液流向大脑中动脉（MCA），并从威利斯环（Willis circle）分支。通过扫描激光多普勒和多普勒血流探头测量的血流下降来验证MCA闭塞。对一组动物进行pMCAO，24小时后，将大鼠麻醉并斩首，取出大脑，切成2 mm的切片，并用2%2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色以评估缺血损伤。当使用这项技术时，活组织区域将呈现粉红色，而非活组织区域不会变色。将大脑固定在2%多聚甲醛中，并拍摄脑切片的数字图像。梗死百分比由以下等式确定：%半球梗死=[（VC−VL）/VC]*100，其中VC是非缺血半球正常组织的体积，VL是缺血半球正常组的体积(48).
另一组大鼠遭受短暂缺血（tMCAO）。如上所述进行MCAO，缺血维持1小时，然后再灌注23小时。之后，取下大脑，按照上述方法测量缺血损伤。
软脑膜血流的扫描激光多普勒测量。
通过扫描激光多普勒（PeriScan PIM 3，Perimed，斯德哥尔摩，瑞典）测量软脑膜血流量。当大鼠处于麻醉状态时，颅骨被暴露并清洁。扫描激光多普勒定位在颅骨上方约18厘米处，并分析两个大脑半球的软脑膜血流。激光波长为670–690 nm，穿透深度为0.5–1 mm。每个时间点共进行了4次连续扫描。时间点如下：手术前、MCAO后立即、再灌注前后（对接受tMCAO的动物）以及安乐死前。使用LDPIwin 3.1软件（Perimed）测量每个半球的平均灌注。缺血性和非缺血性脑半球的脑膜血流量以缺血前脑膜血流量的百分比表示。
蛋白质印迹。
为了验证DOX对MMP的抑制作用，进行了MMP-2表达的蛋白质印迹分析。切除主动脉，清除血管周围脂肪组织和血液，并在液氮中进行snap冷冻。使用研钵和杵在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中均质组织。使用BCA蛋白质分析试剂盒（伊利诺伊州罗克福德的赛默科学公司）测量样品中的蛋白质浓度。含有～50μg蛋白质的等分样品在还原条件下在8%SDS-PAGE中溶解，并转移到PDVF膜上。然后在TBS中的4%无脂干乳中封闭膜进行非特异性结合2 h，并在4°C下与单克隆小鼠抗鼠MMP-2（Calbiochem/EMD Biosciences，加州拉霍亚）孵育过夜。清洗后，在室温下将膜与过氧化物酶偶联抗鼠剂（加利福尼亚州拉霍亚市Calbiochem/EMD Biosciences）孵育1小时，然后使用Amersham ECL Advance Western印迹检测试剂盒（英国白金汉郡GE Healthcare）进行开发。作为负荷控制，剥离膜并重新制备β-微管蛋白。使用ImageJ软件分析条带的强度，并以β-微管蛋白的比率表示。
明胶酶谱。
明胶酶谱法测定血浆MMP活性。简言之，在还原条件下，将含有~35μg蛋白质的血浆等分试样在8%SDS-PAGE中进行解析。然后将凝胶在2.5%Triton X-100中孵育，每次孵育三次，每次15分钟，以便蛋白质复性。然后用50 mmol/l Tris缓冲液（pH 7.4）清洗凝胶，并在37°C下用发酵图开发缓冲液（Bio-Rad，Hercules，CA）培养20 h。凝胶用0.5%库马西蓝染色30分钟，并去除污渍（30%甲醇、30%乙酸和40%水）。胶溶活性区域被确定为黑底白带。使用Odyssey红外成像系统（东北林肯Li-cor Biosciences）对凝胶进行扫描，以量化条带面积。
胸主动脉胶原蛋白和弹性蛋白含量。
如前所述，使用苦味酸红和偏振光测量血管壁中的总胶原蛋白含量(28,29). 数据以胶原蛋白面积和壁面积之比表示。根据制造商的指南，使用弹性蛋白染色试剂盒（Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI）鉴定弹性蛋白纤维。数据以弹性蛋白纤维面积和壁面积之比表示。
统计。
所有结果均以平均值±SE表示。血管结构数据通过双向重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验进行分析。使用Student的t吨-测试。一个P（P）值≤0.05被认为是显著的。
化学品和用品。
除非另有说明，否则所有化学品和供应品均从西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）购买。
结果
一般调查结果。
最终体重以及心脏和肾脏重量总结于。各组大鼠的最终体重没有差异。与WKY大鼠±DOX相比，SHRSP的心身重量比（心脏肥厚的指标）增加(P（P）<0.001），DOX治疗可预防心肌肥厚(P（P）= 0.02). 与未经治疗的WKY大鼠相比，SHRSP大鼠的肾脏重量比增加；DOX没有减轻SHRSP的肾肥大，但在WKY大鼠+DOX中引起轻微肾肥大(P（P）< 0.001).
表1。
6周治疗结束时的最终体重、心体重比、肾体重比和血压值
| SHRSP公司 | SHRSP+DOX公司 | WKY大鼠 | WKY大鼠+DOX |
|---|
| 最终体重 | 261 ± 7 | 266 ± 4 | 265 ± 5 | 270 ± 6 |
| 心身重量比 | 0.50±0.02* | 0.44 ± 0.01*† | 0.32 ± 0.01 | 0.31 ± 0.01 |
| 肾-体重比 | 0.97±0.02* | 1.00 ± 0.02* | 0.67 ± 0.01 | 0.73 ± 0.01†‡ |
| 收缩压 | 184 ± 3 | 193 ± 3† | 不适用 | 不适用 |
| 舒张压 | 128 ± 2 | 135 ± 2† | 不适用 | 不适用 |
| 平均动脉压 | 156 ± 3 | 164 ± 2† | 不适用 | 不适用 |
| 心率 | 311 ± 5 | 321 ± 1† | 不适用 | 不适用 |
血压测量。
遥测测得的心率、收缩压、舒张压和平均动脉压如所示令人惊讶的是，DOX治疗使所有分析参数中的SHRSP都有小而显著的增加(P（P）< 0.01).
蛋白质印迹。
为了验证DOX治疗后MMP的抑制作用，我们使用SHRSP主动脉匀浆中MMP-2特异性抗体进行了Western blots。正如预期的那样，DOX治疗降低了活性MMP-2的浓度(P（P）=0.03），而不改变前MMP-2的浓度().
多西环素（DOX）治疗降低了SHRSP主动脉中活性基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达。含有50μg蛋白质的主动脉上清液的等分部分通过SDS-PAGE溶解，并转移到PVDF膜上进行Western blot分析。DOX治疗降低了自发性高血压大鼠（SHRSP；一个). 数据显示为MMP-2表达与β-微管蛋白表达的比率（负荷控制）。B类：斑点的代表性图像*P（P）<0.05，学生的t吨-测试。动物数量：SHRSP=4，SHRSP+DOX=4。
MCA反应性和色调生成。
在SHRSP中，DOX治疗未改变MCA收缩为5-HT和扩张为BK(,一个和B类). 在管腔内压力范围内未观察到肌源性张力生成的变化().
DOX治疗没有改变大脑中动脉（MCA）对5-羟基三胺（5-HT；一个)缓激肽（BK；B类)并且不会改变MCA对腔内压力增加的肌源性反应(C类). MCA维持在80 mmHg的腔内压力，并以累积的方式向浴中添加药物。每次给药时，让血管平衡10分钟，以达到稳定状态。评估肌源性张力(C类)，腔内压力以20毫米汞柱的增量从3毫米汞柱增加到180毫米汞柱，在测量之前，让血管在每种压力下平衡5分钟。数值为平均值±标准偏差。数据通过双向重复测量方差分析进行分析。
MCA被动结构。
在无钙和零流量条件下测量了MCA的被动结构。与正常血压的WKY大鼠（DOX治疗或不治疗）相比，SHRSP的MCA中观察到重塑，表现为外径和管腔直径减小，壁厚和壁腔比增加(,一个–D类). DOX治疗减轻了SHRSP的MCA重塑，如外径和管腔直径的增加所示(,一个和B类)以及外部和内腔横截面积（CSA；,一个和B类). DOX治疗也降低了壁腔比()在分析的腔内压力范围内。SHRSP+DOX和WKY大鼠在腔内压力>60 mmHg时的MCA应激高于±DOX，血管应变无任何统计差异(,C类和D类). 有趣的是，在血管扩张性方面没有观察到差异()和刚度（β系数：8.8±1.6 vs.8.01±0.5，SHRSP vs.SHRSP+DOX；). DOX没有改变WKY大鼠的MCA被动结构。
DOX治疗减轻SHRSP患者MCA的高血压重塑(一个)和管腔直径(B类)SHRSP+DOX组增加，与Wystar Kyoto（WKY）大鼠±DOX组无差异。与WKY大鼠±DOX相比，SHRSP±DOX组的壁厚增加(C类). DOX治疗改善了壁腔比，即使壁厚没有减少(D类). 在零流量和无钙条件下，使用压力肌电图对空心MCA进行测量。数值为平均值±SE。数据通过双向重复测量方差分析进行分析*P（P）< 0.001.
DOX治疗可减轻MCA的高血压重塑。外部(一个)和流明(B类)与未经治疗的SHRSP相比，SHRSP+DOX组MCA的横截面积（CSA）显著增加，与WKY大鼠±DOX组无差异。WKY大鼠±DOX的腔内压力高于SHRSP+DOX和未经治疗的SHRSP（腔内压力>60 mmHg）(C类). SHRSP+DOX显示出比未治疗的SHRSP更高的腔内压力(C类). 实验组之间的应变没有差异(D类). 在无流量和零钙条件下，使用压力肌电图从MCA获得测量值。数值为平均值±SE*P（P）<0.001，通过双向重复测量方差分析。
DOX处理未改变MCA的膨胀性和刚度。SHRSP中的MCA比WKY大鼠的MCA具有更低的膨胀性，DOX治疗不会改变任何菌株的膨胀性(一个). 与血压正常的WKY大鼠相比，高血压动物的MCA弹性模量（β系数）没有增加(B类; 动物数量：SHRSP=12，SHRSP+DOX=9，WKY大鼠=4，WKY+DOX=7）。在零流量和无钙条件下，使用压力肌电图对空心MCA进行测量。数值为平均值±SE。
MRA被动结构。
在SHRSP中，与血压正常的WKY大鼠±DOX相比，MRA重塑观察到壁厚、壁CSA和壁腔比增加(,一个–C类（分别为）外部（在90 mmHg:320±10 vs.311±20μm，SHRSP vs.WKY大鼠）和管腔直径（在90 mm Hg:263±10 vs 280±20μm，SHRSPvs.WK大鼠）无变化。DOX治疗阻止了壁厚和壁CSA的增加，从而导致SHRSP的壁腔比降低(,一个–C类）。然而，与MCA一样，在血管扩张性（90 mmHg:73±5 vs.83±7，SHRSP vs.SHRSP+DOX）或刚度（β系数：5.53±0.46 vs.5.62±0.44，SHRSPvs.SHRS P+DOX）方面没有观察到差异。DOX没有改变血压正常的WKY大鼠的MRA结构。
慢性高血压会导致肠系膜阻力动脉（MRA）壁肥厚，DOX治疗可以阻止这种情况的发生。MRA壁厚(一个)，壁CSA(B类)，以及壁腔比(C类)与WKY大鼠±DOX相比，未经治疗的SHRSP增加。虽然SHRSP+DOX组的壁厚和壁CSA高于WKY大鼠±DOX组，但DOX治疗减弱了SHRSP组壁质量的增加。在零流量和无钙条件下，使用压力肌电图对空心MCA进行测量。数值为平均值±SE*P（P）<0.001，双向重复测量方差分析。
脑缺血。
pMCAO后SHRSP的DOX治疗没有改变梗死面积（57.6±4.1 vs.57.4±3.7%半球梗死，SHRSP vs.SHRSP+DOX；). 此外，DOX治疗不会改变缺血后和缺血后24小时的软脑膜平均血流(). 有趣的是，DOX治疗减少了SHRSP中tMCAO引起的脑损伤，SHRSP+DOX使大脑梗死面积减少50%（45.5±4.7 vs.20.7±3.8%半球梗死，SHRSP vs.SHRSP+DOX；P（P）< 0.05). 缺血半球再灌注23小时后，梗死的减少伴随着软脑膜血流量的增加(). 在缺血半球分析的任何其他时间点，DOX治疗均未改变伯爵血流量(). 此外，在分析的任何时间点，SHRSP和SHRSP+DOX在非缺血半球的血流无差异().
DOX治疗并没有减少永久性MCA闭塞（pMCAO）后的脑损伤。接受pMCAO治疗的SHRSP大脑的2,3,5-三苯基四氮唑（TTC）染色显示DOX治疗后梗死面积没有差异(一个; 动物数量：SHRSP=6，SHRSP+DOX=8）。数据表示为大脑半球梗死百分比（%HI）。扫描激光多普勒测量的软脑膜血流(B类)DOX治疗也没有改变。软脑膜血流数据显示为缺血前血流百分比。数值为平均值±SE。C类：脑缺血后24小时血浆样品的代表性明胶酶谱。SHRSP和SHRSP+DOX之间的前MMP-2和活性MMP-2活性没有差异。在这些动物的血浆中未观察到MMP-9活性。
DOX治疗减少了短暂性MCA闭塞（tMCAO）后的脑损伤，改善了SHRSP的软脑膜血流量。SHRSP接受tMCAO后的脑TTC染色显示SHRSP+DOX的梗死面积减小(一个; 动物数量：SHRSP=5，SHRSP+DOX=5）。顶部：未经治疗的SHRSP和SHRSP+DOX梗死的代表性图像。白色区域是缺血损伤的组织，而黑色区域是有活力的组织。底部：脑梗死以%半球梗死（%HI）表示。通过扫描激光多普勒测量，再灌注23小时后，梗死减少伴随着缺血半球软脑膜血流量的增加(B类). DOX治疗未改变非缺血半球的软脑膜血流量(C类). 软脑膜血流数据显示为缺血前软脑膜血流量百分比。数值为平均值±SE*P（P）<0.05，学生的t吨-测试。D类：未经治疗的SHRSP再灌注23小时后的典型扫描激光多普勒图像(左边)和SHRSP+DOX(正确的). 在这两幅图像中，左半球是缺血半球，画出的线对应于感兴趣的区域(1：非缺血半球；2：缺血半球）。在缺血半球，较暗的区域对应最低的血流。E类：脑缺血24小时后血浆样品的典型明胶酶谱。SHRSP和SHRSP+DOX之间的前MMP-2和活性MMP-2活性没有差异。在这些动物的血浆中未观察到MMP-9活性。
明胶酶谱。
pMCAO动物血浆中MMP-2前体和活性形式的活性()或tMCAO()未被DOX改变。令人惊讶的是，在这些动物的血浆中没有检测到MMP-9活性。
胸主动脉胶原蛋白和弹性蛋白含量。
DOX治疗未改变胸主动脉中的胶原含量（0.064±0.008 vs.0.060±0.008面积胶原/壁面积，SHRSP vs.SHRSP+DOX）。同样，DOX治疗并未改变弹性蛋白含量（0.21±0.01 vs.0.22±0.1，弹性蛋白/壁面积，SHRSP vs.SHRSP+DOX）。因此，DOX治疗不会影响胶原蛋白与弹性蛋白的比率（0.31±0.05 vs.0.29±0.10，SHRSP vs.SHRSP+DOX）。
讨论
缺血性中风是美国成年人残疾的主要原因。只有4.5%的中风患者可以使用FDA批准的缺血性中风药物治疗。由于中风治疗的可用选择很少，为了降低中风风险，确定以初级预防为目的的治疗似乎是谨慎的。我们之前已经证明，改善MCA结构可以减少脑缺血造成的损伤(13,41,42). 在本报告中，我们发现慢性DOX治疗可减轻SHRSP中观察到的高血压血管重构。这与再灌注23 h后梗死半球软脑膜血流量增加和tMCAO后损伤减少有关。虽然四环素类抗生素作为中风的急性疗法正在临床试验中(16)，这是第一项显示慢性DOX治疗后对大脑和血管系统有有益保护作用的研究。重要的是，DOX对中风预后的有利影响不是由急性效应引起的，因为DOX在诱导脑缺血前48小时停用。
MMP活性由多种刺激在血管壁中触发。流动中的变化(1)并增加透壁压力(7)刺激血管中MMP-2和-9的活性。此外，血管活性化合物，尤其是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的成分，与MMP活性增加有关。血管紧张素II刺激大鼠胸主动脉中MMP-2和-9的表达，与压力无关(45)醛固酮诱导的高血压大鼠MMP-2基因表达增加(46). 我们已经证明肾素-血管紧张素-醛固酮系统是参与SHRSP中MCA重塑的重要因素(14,42). SHRSP醛固酮依赖性重塑的机制之一可能是MMP活性的上调。
许多研究表明，高血压动物的MCA经历了向内重塑，包括管腔直径减小(13,14,22,25,41). 这一过程在高血压大鼠发病早期就开始了(26). MCA结构中的这些变化可以作为一种适应性机制来保护血管免受应力增加的影响(20)和长时间的血管收缩(47)在血压升高期间观察到。与病因无关，壁成分的重排将最终导致内腔CSA的减少，可能伴有或不伴有壁肥大。在这种情况下，基质金属蛋白酶可能发挥重要作用，因为它们是血管壁内参与ECM转换的主要酶(21). 在SHRSP中，血压在6至12周龄之间呈指数上升(42). 在此期间，重塑过程非常活跃，因此这一时期对旨在减少血管重塑的干预措施具有吸引力。
在本研究中，我们发现DOX治疗SHRSP可减轻MCA重塑，表现为MCA外径和管腔直径增加，CSA外径和内腔增加，壁腔比降低。有趣的是，DOX处理并未改变血管硬度和扩张性，这表明所观察到的结构变化并非由于ECM成分的变化。尽管活性MMP-2表达降低，但DOX治疗并未改变主动脉中胶原和弹性纤维的含量，这一观察结果证实了这一点。我们认识到主动脉既不是阻力，也不是脑血管。然而，在本研究中，它们被用于测量血管结构研究所用相同动物的基质金属蛋白酶活性。DOX处理未降低MCA壁厚。这与我们之前使用盐皮质激素受体拮抗剂螺内酯的研究结果一致(42)和补充钾(41). SHRSP中MCA壁厚的增加是对内腔压力升高导致剪切应力增加的适应性反应。因此，在DOX治疗的SHRSP中，MCA仍能抵抗因血压轻微升高而增加的腔内剪切应力。重要的是，DOX治疗的动物均未显示任何脑内出血的迹象，这是SHRSP血压升高的重要后果。DOX对血压正常的WKY大鼠的MCA被动结构没有造成任何改变，这表明，当存在诸如腔内压力增加等刺激时，它可以减轻血管重塑。
有趣的是，MRA与MCA的重塑过程似乎不同，因为DOX对MRA管腔直径没有影响。重塑行为的这些差异背后的原因尚不清楚，但这些血管之间的结构差异可能是造成这种差异的原因，至少是部分原因。MCA没有外部弹性层(32)而MRA是这样的。此外，MRA被血管周围脂肪组织包围，而MCA则不是。血管周围脂肪组织与血管炎症和血管系统中活性氧的生成有关(34)，并且这两个过程都与重塑有关(24,49). 最后，血管床在调节系统血压中的生理作用也可能是造成这种差异的原因。肠系膜床接受15-20%的心输出量，因此对总外周阻力（TPR）和血压调节有很大贡献。因为管腔直径是TPR的主要决定因素(36)管腔直径缺乏增加可能是维持TPR以防止血压下降的结果。然而，为了评估这一点，我们需要研究这些血管的音调生成和反应性，而这在当前的研究中是不可能的。尽管如此，MRA中观察到的结果仍然是阳性的，因为我们没有观察到SHRSP+DOX中的血压降低。
我们(13,14,42)和其他(39)表明MCA被动结构与脑缺血后的损伤程度相关。在MCA闭塞期间，侧支血管扩张，为缺血半球提供血液，以减少组织缺氧。在SHRSP中，侧支血管对缺血反应的扩张能力受损(11). 在遭受pMCAO的动物中，这种血管扩张机制是调节脑损伤程度的主要因素之一。在我们的实验中，DOX治疗对pMCAO后软脑膜吹气流量没有影响。重要的是，尽管MCA结构有所改善，但DOX治疗并未改变MCA中的音调生成和BK诱导的血管舒张。因此，当面临缺氧时，侧支血管仍可能表现出血管舒张功能受损，导致梗死面积不缩小。
有趣的是，DOX治疗减少了tMCAO后的脑损伤，并改善了再灌注23小时后缺血半球的软脑膜血流量。这种改善可以解释为DOX治疗的SHRSP的MCA管腔直径大大增加。在这种脑缺血模型中，60分钟后清除MCA的阻塞，允许血管再灌注。在再灌注期间，MCA产生音调的能力减弱(8,10)血管舒张功能增强(35). 总之，这些反应可能导致MCA的最大扩张。在这些条件下，血流可能主要由脑血管的管腔直径决定。事实上，SHRSP+DOX再灌注23 h后缺血半球的软脑膜血流量大于未治疗的SHRSP。有趣的是，无论有无DOX，再灌注23小时后软脑膜的血流量小于缺血前的血流量。这可能是侧支循环血管舒张功能受损的直接后果。其他因素，如低血压和微血管阻塞，也会减少血流量。目前的研究并没有放弃这些可能性。重要的是，MCA的闭塞在两组中是相似的，因为MCAO后即刻的软脑膜血流量在两组之间没有差异，并且我们通过激光多普勒观察到MCA区域的血流量下降相似。此外，两组之间的血浆MMP-2活性没有差异，这表明缺血24小时后MMP没有抑制作用。
对我们测量血流的一个警告是，它是通过一个完整的头骨测量的。因此，所报告的灌注单位是颅骨、软脑膜和皮质血流的组合。我们选择不进行开颅手术，以产生尽可能与生理相关的中风。使用的大鼠年龄为12周，头骨相对较薄；因此，他们的头骨没有必要变薄。此外，当用扫描激光多普勒分析时，几乎无法检测到缺血核心的原始灌注，这表明颅骨和硬脑膜的血流贡献最小。
其他机制可能解释了SHRSP+DOX中tMCAO后梗死的减少。DOX等四环素类抗生素具有重要的抗炎活性，这可能会减少缺血后的损伤(27). 尽管缺血时动物体内没有DOX，但抗炎作用可能会持续更长时间。另一个重要作用是保护血脑屏障（BBB）。MMPs与短暂缺血后血脑屏障破坏有关(31,43)再灌注后出血性转化(44). SHRSP+DOX中BBB分解减少的可能性值得进一步调查。
总之，本研究表明，尽管DOX治疗导致血压略有升高，但DOX治疗可减轻高血压血管重构。此外，它还减少了tMCAO造成的损害。需要进行进一步的研究来阐明这些影响的潜在机制。
缺血性中风是美国成年人致残的主要原因，也是第三大死亡原因。脑缺血患者的治疗选择很少。所有的治疗都包括用药物或机械方法清除血栓，而且它们具有内在风险。因此，旨在一级预防脑缺血的治疗可能成为管理高危患者的重要工具，例如血压失控的高血压患者。为此，制定减轻脑血管重塑的策略将是有价值的。在这种情况下，DOX可能有用，因为它是一种耐受性好且价格低廉的四环素抗生素，可以长期服用。
赠款
本研究由国家心脏、肺和血液研究所拨款HL-077385（给A.M.Dorrance）和美国心脏协会拨款0840122N（给A.M.Dorrence）资助。
披露
作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。
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