HIF在癌细胞中诱导人胚胎干细胞标记物

Oct4、Sox2、Nanog和Lin28在人肺腺癌细胞系中的过度表达

A549细胞首先在6孔板中感染带有不可降解形式HIF1α和HIF2α的逆转录病毒(23)或空载体对照，6天后被表达Oct4/Sox2和Nanog/Lin28的慢病毒感染（OSLN，26）。在4μg/ml聚brene（Sigma-Aldrich）存在下进行病毒转导。24h后，将细胞胰酶化，转移到10-cm培养皿中，并在DMEM/10%FBS中培养。感染后第12天，根据hESC样菌落形态挑选iPSC样菌落。挑选的菌落随后在hESC培养基中的辐照小鼠胚胎成纤维细胞上进行扩增和维持。然后使用黑色碱性磷酸酶底物试剂盒II（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）对其进行碱性磷酸酶（AP）活性染色。请参见补充信息有关异种移植形成的详细信息。

报告器构造

siRNA与质粒转染

siRNA转染如前所述执行(24)。

细胞被转染HIF1α、HIF2α的非降解形式(23)或使用Lipofectamine 2000进行空载体控制。转染后2～3天通过qPCR和Western blot证实HIFs过度表达。转染前24小时，将表达Oct4-GFP结构的细胞接种在培养皿中。细胞转染后48小时用4%PFA固定，并用1μg/ml的4′，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI，Sigma-Aldrich）孵育。通过共聚焦显微镜（SPE5，Leica）对GFP和DAPI的表达进行评分。

荧光素酶分析、硫酸氢钠测序、流式细胞术和免疫印迹分析

使用标准协议。有关详细信息，请参阅补充信息。

基因表达（mRNA和miRNA）分析

如前所述进行mRNA微阵列分析(22). 基因表达数据分析使用Rosetta Resolver基因表达分析软件（7.1版Rosetta Biosoftware，西雅图，华盛顿州）进行。使用定量引物延伸PCR检测miRNA水平(29)或miRNA微阵列。对于microRNA qPCR分析，通过与单链成熟miRNA生成的标准曲线进行比较，将Ct值转换为拷贝数，并表示为拷贝数/10 pg输入RNA（近似等于拷贝数/细胞）。

mRNA和miRNA-qRT-PCR

使用TriZol（Invitrogen）提取总RNA并用DNase处理（德克萨斯州奥斯汀Ambion）。使用纳米滴ND-1000分光光度计（Nanodrop Technologies，威明顿，DE）测定RNA丰度。在使用Omniscript RT试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）进行反转录反应后，在Applied Biosystems 7300实时PCR循环器上使用SybrGreen主混合物（加利福尼亚州卡尔斯巴德Applied生物系统）或TaqMan分析（Applied biosystem）进行定量PCR。所有数据均归一化为28S或βACTIN转录水平。使用的基因引物列于补充表六TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）用于miRNA qPCR，根据制造商的协议，使用RNU66 snoRNA作为加载控制。

患者样本的免疫组织化学

缺氧诱导肿瘤细胞系中干细胞miRNAs

我们还检测到低氧癌细胞株和未分化的人胚胎干细胞株之间的miRNA特征趋同。几种富含hESC的miRNAs(22,29)包括miR-302a-b、miR-106a-b、miR-92、miR-372、miR-19b、miR-130a、miR-30e-5p和miR-195，在低氧条件下生长的癌细胞系中发现显著上调(图1F;补充表四)这表明，当暴露于缺氧条件下时，癌细胞株会向干细胞样miRNA转移。进一步的qPCR分析证实了低氧诱导ME180细胞中miR-302b和miR-106a的上调(补充图4). 我们使用非降解（nd）HIF1α和ndHIF2α测试miR-302启动子是否对HIF有反应(23)以及与萤光素酶连接的miR-302启动子的报告子构建体。荧光素酶活性在ndHIF1α和ndHIF2α的存在下上调，表明miR-302启动子对ndHIF表达有反应(图1G)。

如前所述，miR-210在缺氧反应中也持续被诱导(图1F; 19–20). miR-210已被证明通过抑制MYC的拮抗剂MNT来增加MYC的活性(24)并通过抑制铁硫簇组装蛋白（ISCU）来调节代谢(19). 因此，HIF依赖性miR-210上调可能也有助于这些缺氧癌细胞的干样表型。

诱导类hESC表达特征依赖于HIF

为了测试观察到的Oct4上调是否与HIF表达有关，我们使用Oct4-GFP构建物在U251和ME180细胞系中过度表达了ndHIF（27；图2C). 这些工程细胞在含有3个HIF结合位点的OCT4启动子区3.9-kb的控制下表达GFP(7). 首次通过Western blot分析和HIF-binding-repeat（6xHBR）-YFP传感器结构验证了ndHIF1α和ndHIF2α的表达和活性(图2A-B). 用ndHIF构建物转染U251-Oct4-GFP和ME180-Oct4-GFP后，GFP表达显著增加，表明ndHIF能够激活U251和ME180癌细胞系中的Oct4启动子(图2C;补充图5A–H). 由于ndHIF的表达，内源性hESC标记物的表达也显著增加(补充图5I)。

为了进一步测试HIF通路在hESC标记物表达中的功能，我们使用了缺乏VHL活性的786-O和RCC4肾癌细胞系，因此表达了组成活性HIF(23). 在常氧条件下，缺乏VHL功能的786和RCC4细胞与具有活性VHL的相应细胞系相比，内源性hESC标记物的表达显著增加(图2D;补充图6A–E)使用Oct4-GFP传感器，我们发现VHL缺陷细胞表达的GFP水平显著高于VHL功能恢复的细胞，表明由于缺乏VHL，稳定的HIF激活了Oct4启动子（增加30倍；图2E). ndHIFs过度表达后，在786+VHL细胞中观察到GFP阳性细胞增加24倍(图2E)表明这些细胞能够对稳定的HIF作出反应。这些数据表明，肾癌细胞系中hESC标记物的上调与VHL活性的缺乏有关。

通过用针对HIF1α、HIF2α（EPAS1）、HIFβ（ARNT）和荧光素酶（对照）的siRNA转染ME180和HCT116细胞，我们进一步测试了HIF对hESC标记上调的依赖性。通过qPCR或微阵列分析证实了siRNA的有效性和特异性(补充图7). 低氧诱导ME180和HCT116细胞中大多数hESC标记物的表达依赖于HIFβ、HIF1α和HIF2α(图2F–G). 在这些实验中没有观察到细胞死亡增加，可能是由于HIF击倒后缺氧潜伏期短所致(补充图7B). 此外，RCC4细胞中HIF1α的敲低上调了与凋亡无关的基因，如TAF9B、AREG和SGK3。低氧处理使RCC4+VHL细胞中的这些基因表达下调(补充图7D). 因此，观察到的干细胞标记物减少是HIF击倒的结果，而不是活力缺陷的结果。

总之，这些数据与以下结论一致：缺氧诱导的癌细胞hESC mRNA和miRNA特征是HIF依赖性的。

A549肺癌细胞系中Oct4、Sox2、Nanog、Lin28和HIF的过度表达

由于缺氧导致HIF依赖性的干细胞标记物上调，这足以诱导多能状态（iPSC；26，33；图1——2)，我们测试了我们手中的这些因素是否能够在癌细胞中诱导iPSC集落，以及这些细胞是否具有致瘤能力。我们将Oct4、Sox2、Nanog和Lin28引入人肺腺癌上皮细胞（A549；图3A). 有趣的是，在这些条件下，在A549细胞系中观察到iPSC样集落的速度比在正常的原代肺成纤维细胞系MRC5中更快(图3A–E; A549 10天，MRC5 20天）。此外，ndHIF的引入增加了A549癌细胞系中iPS样细胞诱导的效率（增加了7倍；图3F). A549产生的iPSC样克隆碱性磷酸酶（AP）染色阳性(图3G). A549 iPS-like细胞中内源性NANOG和OCT4水平低于正常H1 hESCs(图3H)OCT4的启动子仅部分未甲基化(图3I)这表明这些细胞虽然未分化，但并未完全重新编程。

在单独的窗口中打开

图3

肺癌细胞中OCT4、SOX2、NANOG、LIN28和HIFs的过度表达

（A）描述A549肺腺癌细胞产生iPS样细胞的实验流程图。（B–C）感染pBABE空载体对照（EV，B）的A549细胞和感染Oct4/Sox2、Lin28/Nanog（OSLN）、ndHIF1α和ndHIF2α（C）后12天获得的菌落的亮场图像。（D–E）从感染OSLN（D）和OSLN+ndHIFs（E）的A549中获得的饲养者上放大的拾取菌落的亮场图像。（F）HIF1过表达增强iPSC-like集落的诱导。慢病毒转导后第20天对菌落进行计数。（G）饲养动物上生长的A549（OSLN+HIFs）菌落的碱性磷酸酶染色。（H）与H1细胞相比，对A549（OSLN）和A549（OSLN+HIFs）克隆中内源性NANOG和OCT4 mRNA表达进行RT-qPCR分析。（一）OCT4启动子区甲基化分析。白色圆圈代表非甲基化；黑圈甲基化胞嘧啶磷酸胍（CpG）。数字表示未甲基化CpG的百分比。（J–K）A549（OSLN+HIFs）肿瘤呈现恶性特征。异种移植物A549（OSLN+HIFs）的代表性H&E染色切片显示高有丝分裂指数（J）和局部侵袭（K）。（左）注射A549（OSLN+HIFs）细胞产生的肿瘤呈现分化区域。石蜡包埋切片进行H&E（上面板）或Alcian blue-PAS（下面板）染色。酒吧右面板等于100μm。

我们假设部分重新编程的癌细胞集落可能模拟原发性肿瘤缺氧区域发生的过程，从而显示出较高的肿瘤侵袭性。我们通过评估体内通过将这些部分重新编程的A549 iPSC样集落注射到免疫损伤小鼠的股骨肌肉中，其致瘤能力。注射A549（OSNL+HIFs）iPSC-like集落后10天，获得的异种移植瘤体积大且可触及，显示出快速生长。注射A549细胞或A549（HIF）的小鼠在10天时未观察到明显的肿瘤生长，而两周后触诊开始显示注射A549（HIF）的鼠出现小的生长。A549 iPSC样集落诱导肿瘤切片上的苏木精和伊红染色显示具有中央分化区域的高度侵袭性恶性实体肿瘤(补充图8)，有丝分裂指数高(图3J)、局部侵入(图3K)坏死和核异型性(补充图8). 在异种移植物的中心部分观察到的具有细胞质液滴的小细胞和立方体细胞对酸性和中性粘蛋白均呈阳性（品红色和蓝色AB-PAS染色，图3L)，证明存在一些分化的杯状细胞。根据部分去分化，AP-阳性A549 iPSC样集落产生侵袭性侵袭性肿瘤，而不是典型的畸胎瘤(补充图8)。

这些数据表明，人胚胎干细胞标志物在A549癌细胞中的表达会部分降低产生高度侵袭性肿瘤的细胞的分化。

前列腺肿瘤中HIF、NANOG和OCT4染色的重叠

我们研究了HIF1α、NANOG和OCT4蛋白在患者原发性前列腺肿瘤连续切片中的共同定位频率。皮肤、精原细胞瘤和人类胚胎干细胞被用作阳性对照以验证抗体(补充图9和数据未显示）。在前列腺癌标本09-066C（Gleason 4+3）中，16.5%的肿瘤区域HIF1α阳性，7.7%的肿瘤区域NANOG阳性(图4A、G、K;补充图10A). HIF1α和NANOG之间存在显著重叠：69%的NANOG阳性细胞也呈HIF1α阳性（P<0.05），而32%的HIF1α阴性细胞也呈NANOG阴性(图4A). 除了形态学外，先前识别的标记物CD107b、CD10和CD104也用于区分肿瘤和良性腺体(图4O、P,补充图10A;30). 在标本07-020C，Gleason 4+3中，HIF1α和NANOG之间的重叠也非常显著（91%的NANOG阳性细胞也为HIF1α阳性）(图4B、H-I、L-M;补充图10B). 此外，在同一前列腺肿瘤区域观察到两种干细胞标记物NANOG和OCT4（87%的NANOG阳性细胞也为OCT4阳性；图4B、L、Q). 在样本07-091LA中，Gleason 3+4，在2039个前列腺中，36.5%的前列腺HIF1α阳性，而20.8%的前列腺NANOG阳性(图4C、J、N). NANOG和HIF1α染色腺体之间存在高度显著的重叠，99%的NANOG阳性腺体对HIF1α也呈阳性（P<0.01），而57%的HIF1α阳性腺体也对NANOG呈阳性(图4C). 详细分析显示HIF、NANOG和OCT4染色重叠区域中阳性细胞的数量和位置高度相关(图4D–F). 我们对NANOG或OCT4阳性细胞百分比与HIF1α阳性细胞百分比进行了线性回归拟合优度检验，得到的R平方值范围为0.55-0.65。结果表明，NANOG染色与HIF1α和OCT4染色相关（R平方>0.5），尽管在组织切片的不同微观区域中看到的一些异常值和/或变化减弱了这种相关性(图4D–F). 这些结果与mRNA表达数据一致(图1A–C)，表明hESC mRNA的一个子集在缺氧癌细胞中表达，并且hESC关键调控因子NANOG和OCT4成员的蛋白表达与原发性前列腺肿瘤中的HIF表达相关。然而，这些数据也指出，并非每一个缺氧癌细胞都能上调NANOG和OCT4，这表明包括细胞病史和HIF水平在内的其他因素也可能起作用。

为了评估HIF1α、NANOG和OCT4表达与前列腺癌临床病理结果的相关性，我们采集了更多患者进行分析。由于我们分析的所有标本都来自最近发生的前列腺癌（<3年），并且后续的临床特征尚不可用，我们依赖Gleason评分（测量正常腺体结构的转移），这是前列腺癌最重要的预后因素，作为疾病结果的指征(31). 当我们仅分析Gleason 5腺体（大多数非结构腺体）时，我们观察到NANOG和OCT4的高表达（分别为56.2%和41.7%，图4R). 当分析中包括所有患病腺体时，这些值明显高于NANOG和OCT4的观察频率（Gleason 3、4和5加在一起；图4R). 我们还发现，HIF1α和NANOG在仅Gleason 5腺体中的共同表达（20.4%）显著高于整体病变腺体（12.3%）的水平。

总之，NANOG和OCT4在Gleason 5腺体中的高表达频率表明干细胞特异性因子在前列腺癌进展中的重要性，HIF1α和Nanog的共同表达增加支持了我们的假设，即HIF1α通过获得干细胞因子的表达在癌症进展中发挥作用。

低氧癌细胞和人胚胎干细胞的基因表达特征重叠在原发性肿瘤中丰富

我们的大规模图谱实验揭示了624个基因的共同集合，这些基因在缺氧的癌细胞系中的表达水平高于常氧的癌细胞系，在未分化的hESC细胞系中的表达水平高于分化的hESC细胞系。与其他hESC富集基因的比较显示，与已确定的候选群体有显著重叠(补充图1). 重要的是，一组31个基因显示所有3个hESC分析集和缺氧癌细胞系之间存在重叠，是HIF、OCT4、SOX2和/或NANOG的靶基因，并且在显示hESC表观遗传模式的Wilms肿瘤中富集(34). 先前的分析表明，许多前列腺肿瘤表达HIF(38,39). 此外，NANOG被证明对前列腺肿瘤的发展很重要(40). 我们目前的研究表明，HIF、NANOG和Oct4在原发性前列腺肿瘤中的表达存在显著重叠。此外，Nanog和Oct4表达的增加以及前列腺癌Gleason评分显示出显著的正相关。这些数据支持这样的假设，即稳定的HIF转录因子的作用之一是激活原发性肿瘤中的hESC标记物表达。

低氧诱导iPSC基因

我们发现HIF可以诱导癌细胞中iPSC基因的表达。最近的结果表明，缺氧有利于诱导iPSC（41；JM，BS，CW，HRB，未发表），但其机制尚不清楚。我们认为缺氧在诱导iPSC中很重要，因为HIF转录因子的作用。至少一种iPSC诱导物OCT4被证明是HIF转录因子的直接靶点(7). 需要进一步研究以了解其他已知iPSC诱导基因Nanog、Sox2、Myc和Klf4是否是HIF的直接靶点。虽然包括miR-302在内的其他人胚胎干细胞基因的启动子具有潜在的HIF结合位点，但尚不清楚它们是否直接受HIF调节，或者它们的表达是否依赖于OCT4。未来还将有兴趣揭示其他已知HIF靶点是否在诱导iPSC中发挥作用。

我们感谢Ruohola-Baker实验室的成员进行了有益的讨论。我们感谢Rosetta基因表达实验室处理微阵列实验。我们感谢邓梅（CHDD细胞形态学核心）和张小屯博士（威斯康星州泌尿科）对肿瘤标本的帮助。我们感谢Emily Liebsekind、Ausra Bendoraite、Daryl Humes和Stephanie Einsele提供的技术帮助。我们感谢Kaelin博士提供了pVHL-deficient 786-0和RCC4肾癌细胞，这些细胞转染了空载体或野生型VHL（甚高频）以及HCT116的Vogelstein博士Dicer公司低形态细胞系。我们感谢崔博士提供了Oct4-GFP构造。这项工作得到了脑瘤学会、Goldhirsh基金会和NIH的资助，分别为JR提供了NS047409、NS054276、CA112958和CA116659，AH获得了法国国家教育部/高等师范学院的资助，AJW获得了四川大学Robert Chang奖学金，CMAP获得Regione Autonoma della Sardegna，BS获得Jaconnette L.Tietze青年科学家奖，HRB获得R01GM083867-01 NIGMS，1P01GM081619-01 NIGMS和华盛顿大学干细胞与再生医学研究所（ISCRM）获得CW、CAB和HRB。