有限数量的转录因子对复杂生物过程的调节需要通过共价修饰和/或与多种不同的辅因子的结合来实现这些蛋白质活性的多样化和调节。通常,转录因子的活性可以通过蛋白质稳定性、亚细胞定位和转录激活或抑制潜能的变化来调节。尽管转录因子的核质分布代表了亚细胞定位调控的最新研究形式,但将转录因子靶向特定的亚核结构也可能影响其活性。间期核被组织成不同的结构域,包括染色体区域和染色质间空间,也称为核基质(有关综述,请参阅Cremer和Cremer 2001). 染色质间空间包含各种亚核结构和小体,可以通过形状、成分和在细胞过程中的作用来区分(Spector 1993年;拉蒙德和恩肖1998).
PML核体,也称为PML致癌域(POD)或ND10,是核基质相关的球形结构,直径为0.2至0.5μm,在大多数哺乳动物细胞中以不同的数量和大小出现(有关综述,请参阅Seeler和Dejean 1999年;Hatta和Fukamizu 2001;Zhong等人,2001年). POD的PML成分最初在急性早幼粒细胞白血病中检测到,其中PML基因转位到维甲酸受体-α基因座,产生显性负融合蛋白,诱导POD的解体(de The等人,1991年;Kakizuka等人,1991年). PML在POD形成中作用的其他证据来自于对来自PML公司−/−缺乏POD且细胞生长增加的小鼠(Wang等人,1998年). PML核体似乎是异质的,它们参与了基因表达的正调控和负调控。PML促进转录辅激活子CBP定位于核小体,在这种情况下,增强核受体的转录活性(Wang等人,1998年;Boisvert等人,2001年). 然而,PML也可以与多种共抑制因子和组蛋白去乙酰化酶相互作用,转录调控因子靶向PML核小体也可以导致其失活(Khan等人,2001年;Wu等人,2001年). Daxx和Sp1在POD中的隔离对抗这些转录因子的功能,通过Mad蛋白抑制转录也需要与PML相互作用(Vallian等人,1998年;Li等人,2000年;Khan等人2001). PML核小体的另一个主要成分Sp100蛋白与异染色质蛋白1(HP1)相互作用,在核小体和染色质之间建立联系(Lehming等人,1998年;Seeler等人,1998年). PML核体的动力学——在细胞周期、细胞外应激和病毒感染期间数量和组成发生变化——与PML与小泛素样修饰物1(SUMO1)蛋白的结合有关(有关综述,请参阅梅尔基奥尔2000;2001年年初;Muller等人,2001年). Sumoylated PML仅存在于POD中;将PML靶向成熟核体需要磺酰化,但PML与核基质的结合是不必要的(Muller等人,1998年;Lallemand-Breitenbach等人,2001年).
SUMO结合系统已被广泛研究,并显示出与泛素结合系统的相似性(有关综述,请参阅Herschko和Ciechanover 1998;梅尔基奥2000;2001年年初;Muller等人,2001年). 具体而言,SUMO通过由Aos1/Uba2异二聚体组成的E1酶以ATP依赖的方式激活(Johnson等人,1997年). 活化的SUMO被转移到SUMO结合酶Ubc9,然后附着到蛋白质底物的特异赖氨酸的ɛ氨基上(约翰逊和布洛贝尔1997). 尽管底物(如RanGAP1)的SUMO缀合只需要E1和E2酶,但与细胞提取物中的SUMOylization相比,这一过程效率低下(Saitoh等人,1998年;Azuma等人,2001年). 因此,SUMO与靶点的连接可能还涉及E3样蛋白,这些蛋白赋予靶点特异性,但尚未在SUMO修饰系统中鉴定。蛋白质与SUMO的结合也可以通过异肽酶的作用逆转,从而实现SUMO依赖过程的动态调节(有关综述,请参阅梅尔基奥2000).
淋巴样增强因子1(LEF1)是HMG结构域蛋白LEF1/TCF亚家族的成员,作为Wnt信号传导的结构转录因子和核介质(有关综述,请参阅Cadigan和Nusse 1997年;Eastman和Grosschedl 1999;Bienz和Clevers 2000). LEF1不能单独激活转录,但可以与其他因子协同激活转录。作为对Wnt信号的响应,β-catenin被稳定并与LEF1的N末端相互作用,从而激活Wnt应答基因的转录(Cadigan和Nusse 1997年;van de Wetering等人,1997年;Hsu等人,1998年). 在未经刺激的细胞中,LEF1可以与辅升压因子Groucho联合抑制Wnt应答基因(Levanon等人,1998年;Roose等人,1998年). 此外,LEF1可以与辅因子ALY相互作用,并与其他转录因子协同激活特定靶基因的增强子,如T细胞受体α增强子(不依赖Wnt信号)(Giese等人,1995年;Bruhn等人,1997年;Mayall等人,1997年).
尽管大多数辅因子通过特定的机制调节转录因子的活性,包括增强或抑制转录激活,但一些辅因子可以正向和负向调节转录因子的活性。活化STAT1蛋白抑制剂(PIAS1)已被确定为抑制STAT1转录激活潜能的辅因子(秒信号t吨传感器和一的激活器t吨转录)并增强核激素受体的转录活性(Liu等人,1998年;Kotaja等人,2000年;Gross等人,2001年). 在哺乳动物中,已鉴定出四种PIAS蛋白(PIAS1、3、x和y)(Chung等人,1997年;Liu等人,1998年). PIAS1和PIAS3分别抑制STAT1和STAT3的DNA结合(Chung等人,1997年;Liu等人,1998年). 相反,PIASy在不干扰DNA结合的情况下抑制STAT1和雄激素受体(Gross等人2001;Liu等人,2001年). 此外,PIAS蛋白在细胞因子信号转导中的作用是根据果蝇属这表明直系图dPIAS和stat92E在功能上相互作用,调节血细胞和眼睛发育(Betz等人,2001年). 通过对位置效应杂色抑制因子Su(var)2-10的鉴定和表征,推断出PIAS在染色体结构和功能调节中的另一个作用果蝇属太平洋岛屿协会(Hari等人,2001年). 然而,PIAS蛋白如何调节转录因子的活性和调节染色体结构尚不清楚。
在这里,我们确定PIASy是一种与LEF1特异性相互作用的蛋白质。我们发现PIASy通过LEF1拮抗Wnt诱导的依赖性和Wnt诱导转录激活。PIASy与LEF1的共表达导致LEF1和其他多种蛋白被SUMO修饰。此外,PIASy可以在体外系统中大大增强LEF1的sumoylation,表明PIASy作为SUMO E3连接酶发挥作用。我们表明,PIASy与核基质DNA结合,并将LEF1靶向与SUMO共定位并部分与PML核体共定位的核体。因此,PIASy介导的LEF1对亚核结构的隔离可能是抑制LEF1活性的基础。
结果
确定PIASy为LEF1的互动伙伴
LEF1/TCF蛋白通过与正辅因子(如β-catenin和ALY)和负辅因子(例如Groucho)相关联而使其功能特性多样化(有关综述,请参阅伊斯曼和格罗舍尔,1999年;Bienz和Clevers 2000). 为了进一步了解LEF1功能的调控机制,我们寻找了LEF1的其他相互作用伙伴。为此,我们用LEF-LexA融合蛋白进行了酵母双杂交筛选,其中LEF1的HMG结构域被LexA的DNA结合结构域取代(Bruhn等人,1997年). 其中一个与LEF-LexA特异性相互作用的阳性克隆用于筛选用于分离全长cDNA克隆的前B细胞文库。全长克隆(最初称为60-7z)的测序表明,编码的蛋白质与活化STAT家族蛋白抑制剂PIASy的一个成员相同(Liu等人,1998年). 为了证实LEF1和PIASy之间相互作用的特异性,我们用固定化GST-PIASyN97蛋白进行了GST下拉实验,其中最初分离的编码N末端97残基的cDNA克隆被融合到GST cDNA。通过体外翻译对全长LEF1和LEF1的各种N端和C端截断进行放射性标记,并根据全长LEF1的结合情况确定其与固定化GST-PIASyN97的关联(图。A、 B)。删除LEF1的98个N末端残基适度增强了与PIASyN97的相互作用,进一步删除LEF1残基243不会干扰结合。然而,LEF1残基340的C末端截断使结合减少了四倍,HMG结构域的进一步删除实际上消除了与PIASyN97的相互作用。因此,LEF1 HMG结构域内的304至340氨基酸对于体外与PIASy的N末端结合至关重要。
PIASy在体内外与LEF1相关。(A类)PIASy和LEF1的线路示意图。PIASy包含一个假定的染色质结合SAP结构域、一个C2HC3环结构域(RING)和一个C末端富含丝氨酸和酸性结构域(Ser/Ac)。在酵母双杂交筛选中,PIASy(PIASyN97)的氨基酸1至97足以与LEF1相互作用。LEF1包含一个β-连环蛋白相互作用域(βBD)、一个上下文相关激活域(CAD)和一个高迁移率基团DNA-结合域(HMG)。线图下方的数字表示各个蛋白质结构域的氨基酸位置。PIASy和LEF1中的核定位信号由黑匣子表示。通过磷成像仪分析定量了N端或C端截断的LEF1蛋白与固定化GST-PIASyN97结合的能力,并以与全长LEF1结合的百分比表示。(B)LEF1和PIASy的体外联合。N端或C端截短的LEF1蛋白在体外在[35S] -蛋氨酸,通过SDS-PAGE进行解析,并通过荧光检测。(左侧)输入LEF1蛋白质的10%。数字表示蛋白质标记的分子量,单位为千道尔顿。(赖特)LEF1蛋白与固定化GST-PIASyN97结合。体外翻译的LEF1蛋白未与固定化GST结合(数据未显示)。(C)LEF1和PIASy的体内关联。N端或C端截断的LEF1和T7表位标记的PIASy蛋白在293T细胞中瞬时表达。用抗T7单克隆抗体免疫沉淀等量的总细胞蛋白。通过抗LEF1免疫印迹检测共免疫沉淀LEF1蛋白(正确的). 箭头表示LEF1蛋白;星号,18-kD较大,LEF1的修改形式。在所有通道中,30 kD的显著蛋白质是IgG(正确的). LEF1或T7-PIASy蛋白在总细胞裂解物中的表达分别通过抗LEF1或抗T7免疫印迹测定(左边). PIASyΔN93在PIASy中含有1至93个氨基酸的缺失,其迁移速度比全长PIASy快(左下角). (D类)LEF1的共价修饰。用抗LEF1免疫印迹法检测总细胞裂解物中的LEF1蛋白。箭头表示LEF1;星号,一个18kD大的LEF1的修饰形式。
我们还通过共免疫沉淀转染293T细胞中的蛋白来检测LEF1和PIASy之间的相互作用。为此,我们将全长LEF1和截短型LEF1与针对融合到PIASy N末端的T7表位的抗体进行免疫沉淀(图。C) ●●●●。用抗LEF1抗血清进行免疫印迹分析,检测共免疫沉淀的LEF1蛋白。从表达PIASy的转染细胞中高效共免疫沉淀全长LEF1和缺失N端166氨基酸(ΔN166)的截断突变株(图。C) ●●●●。与GST下拉实验相反,进一步将LEF1的N末端残基缺失为氨基酸243,虽然程度不大,但始终减少了与体内PIASy的相互作用(图。,参见B和C)。我们还能够在与抗-HA抗体的相互共免疫沉淀中检测到T7-PIASy和LEF1-HA之间的关联(数据未显示)。
删除PIASy的N末端93个残基,这足以在酵母双杂交筛选中与LEF-LexA融合蛋白相互作用,显著降低了共免疫沉淀LEF1蛋白的数量(图。C类;数据未显示)。这一结果表明,PIASy的N端结构域对于与LEF1的相互作用是必要的和充分的。与GST下拉实验类似,C末端残基的缺失损害了LEF1与抗-T7-PIASy抗体的联合免疫沉淀(图。C) ●●●●。因此,LEF1与PIASy的相互作用涉及PIASy N末端和LEF1中的至少两个域,其中包括氨基酸304和340之间的主要相互作用域和氨基酸166和243之间的次要相互作用域。
在共免疫沉淀实验中,我们一致检测到LEF1的缓慢迁移形式,对应于LEF1相对分子质量增加~18 kD(用星号表示)。在与LEF1和PIASy表达结构共同转染的细胞的总细胞裂解物的免疫印迹中也检测到LEF1的这种缓慢迁移形式,但不是仅从表达LEF1的细胞中检测到(图。D) 。因此,LEF1慢迁移型的出现是PIASy表达的结果,而不是与PIASy共免疫沉淀的结果。
PIASy-associated LEF1被SUMO共轭修饰
在表达LEF1和PIASy的细胞中出现18kD更大、迁移较慢的LEF1形式,这引发了一个问题,即这些蛋白质的共表达是否通过与泛素或与小的泛素样修饰物SUMO结合而导致LEF1的共价修饰。为此,我们用抗泛素、抗SUMO1或抗SUMO2/3抗血清探测了T7-PIASy–共免疫沉淀蛋白的三个平行印迹,并随后用抗LEF1抗血清重制了这些印迹。共免疫沉淀的LEF1蛋白不与抗泛素抗血清或抗SUMO1抗体反应,但LEF1的慢迁移形式与抗SUMO2/3抗血清反应(图。A;数据未显示)。抗SUMO2/3免疫印迹还显示,许多SUMO修饰蛋白是从转染T7-PIASy表达结构的细胞裂解液中共同免疫沉淀的。在更严格条件下的平行免疫沉淀实验中,我们无法检测到任何SUMO2/3修饰的蛋白质,这表明这些蛋白质代表PIASy相关蛋白,而不是SUMO修饰的PIASy形式(数据未显示)。用抗LEF1抗血清或抗T7抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹分析,发现转染细胞中LEF1和PIASy的表达水平相似(图。A、 下部面板)。
LEF1在体内被SUMO修饰。(A类)PIASy与SUMO改进的LEF1合作。LEF1和T7-PIASy在293T细胞中瞬时表达。用抗T7单克隆抗体免疫沉淀等量的总细胞蛋白。通过抗SUMO2/3免疫印迹检测共免疫沉淀内源性SUMO结合蛋白(左上角). 剥离抗SUMO2/3免疫印迹,并用抗LEF1抗体重复(右上角). 右边的数字表示蛋白质标记的分子量,单位为千道尔顿。通过抗LEF1测定LEF1或T7-PIASy蛋白在总细胞裂解物中的表达(中间的)或抗T7(底部)免疫印迹。(B)LEF1在体内被SUMO修饰。LEF1、T7-PIASy和Flag表位标记的SUMO1或SUMO2在293T细胞中瞬时表达。用抗T7 mAb免疫沉淀等量的总细胞蛋白。通过抗LEF1免疫印迹检测共免疫沉淀LEF1蛋白(顶部面板)。LEF1或T7-PIASy蛋白在总细胞裂解物中的表达通过抗LEF1测定(中间的)或抗T7(底部)免疫印迹。(C)LEF1、Flag表位标记的SUMO1或SUMO2和T7-PIASy在293T细胞中瞬时表达。用抗LEF1免疫印迹法检测RIPA缓冲细胞裂解液中的LEF1蛋白(顶部). 用抗T7免疫印迹法测定总细胞裂解物中T7-PIASy蛋白的表达(底部).
为了进一步证明PIASy存在下LEF1的SUMO修饰,我们转染了编码LEF1或T7-PIASy的基因结构,以及编码标记SUMO1或标记SUMO2的结构。与抗T7抗体共免疫沉淀的LEF1蛋白的免疫印迹分析允许检测18-kD更大、迁移速度较慢的LEF1形式(图。B、 车道3)。在Flag-SUMO2存在的情况下,检测到两种缓慢迁移的LEF1形式(图。B、 车道5)。LEF1最大型分子量的相对增加与SUMO2中添加Flag表位相一致。LEF1的这种缓慢迁移形式在标记SUMO1存在时不太丰富(图。B、 通道4),这可能反映了在我们的共免疫沉淀条件下,与SUMO1结合的LEF1相对于SUMO2的效率较低和/或提取效率较低。为了区分这两种可能性,我们检测了在RIPA缓冲液中收获的总细胞裂解物中不存在或存在Flag-SUMO1或Flag-SUMO2的情况下LEF1的sumoyalization状态(图。C) ●●●●。在这些严格的条件下,我们可以检测到内源性SUMO和外源性表达的Flag-SUMO1和Flag-SSUMO2修饰的LEF1。有趣的是,T7-PIASy的表达增强了具有内源性SUMO的LEF1的SUMO修饰(参见第2和第5条车道)和具有Flag-SUMO2的LEF1(参见第4和第7条车道),但并没有增强具有Flag_SUMO1的LEF1 SUMO修改(参见第3和第6条车道)。综上所述,这些结果表明PIASy优先增强SUMO2对LEF1的修饰。
对与T7-PIASy抗体共免疫沉淀的蛋白质进行的抗SUMO2/3免疫印迹分析表明,PIASy参与了许多蛋白质的sumoylation。为了确认PIASy在体内蛋白质合成中的一般作用,并检查PIASy中结构基序的功能,我们将PIASy的野生型或突变型与Flag-SUMO1或Flag-SSUMO2共表达。由于RING基序被认为是泛素E3连接酶的一个重要功能决定簇(Jackson等人,2000年;Joazeiro和Weissman 2000),我们检测了PIASy环结构域中Cys 330、335、340和His 337突变的影响。此外,我们在PIASy的富含丝氨酸和酸性结构域中突变了Ser 470–474,该结构域与PM-Sc175蛋白中的SUMO相互作用基序相似(Minty等人,2000年). 总细胞裂解物的免疫印迹分析表明,野生型PIASy的过度表达增加了与单独转染Flag-SUMO构建物的细胞相关的Flag-SSUMO结合蛋白的积累(图。A、 参见2、3和5、6车道)。RING结构域中Cys/His残基的突变显著降低了内源性蛋白质的sumoylation(第7、8道),而Ser突变仅产生适度影响(第9、10道)。用抗T7抗体进行的免疫印迹分析证实了野生型和突变型PIASy蛋白的类似表达(图。A、 下面板)。
PIASy增强体内SUMO结合。(A类)野生型PIASy增强,而突变的PIASy蛋白消除SUMO结合。野生型、环突变体或Ser突变体T7-PIASy蛋白在293T细胞中与Flag-SUMO1或Flag-SSUMO2共表达。RING突变体包含RING结构域中半胱氨酸330、335和340的丝氨酸取代和组氨酸337的丙氨酸取代。Ser突变体包含Ser/Ac结构域中丝氨酸470到474的丙氨酸替换。通过反标记免疫印迹检测来自总样本缓冲细胞裂解物的标记-SUMO修饰蛋白(顶部). 右边的数字表示蛋白质标记的分子量,单位为千道尔顿。用抗T7免疫印迹法测定总细胞裂解物中T7-PIASy蛋白的表达(底部). (B)突变PIASy和LEF1蛋白的特征。野生型或突变型LEF1和T7-PIASy蛋白在293T细胞中瞬时表达。用抗T7单克隆抗体免疫沉淀等量的总细胞蛋白。通过抗LEF1免疫印迹检测共免疫沉淀LEF1蛋白(顶部). LEF1 M2/K267R蛋白质包含赖氨酸25、天冬氨酸26和谷氨酸27的丙氨酸替代物(Hsu等人,1998年)以及两个一致的SUMO基序内赖氨酸267的精氨酸替代物。LEF1或T7-PIASy蛋白在总细胞裂解物中的表达通过抗LEF1测定(中间的)或抗T7(底部)免疫印迹。
最后,我们试图鉴定LEF1中与SUMO蛋白结合的赖氨酸残基。我们搜索了SUMO共有修饰位点(ψKXE,其中ψ是一个大的疏水残基,K是SUMO偶联的赖氨酸;罗德里格斯等人,2001年;Sampson等人,2001年)在LEF1中,在赖氨酸残基25(FKDE)和267(VKQE)处确定了两个假定位点。我们在两种赖氨酸(M2/K267R)中都产生了突变,并检测了它们在PIASy存在下对LEF1的sumoylation的影响。未检测到与SUMO修饰的LEF1相对应的LEF1慢迁移形式,这表明突变序列代表了真正的sumoylation位点(图。B、 参见车道2和5)。仅K267R突变降低了共免疫沉淀SUMO-LEF1的量,但没有消除,这表明LEF1中的两个位点都可以与SUMO结合(数据未显示)。PIASy中RING结构域的突变取消了LEF1的SUMO修饰,并略微减少了与LEF1的关联(图。B、 车道3;数据未显示)。相反,Ser突变并没有消除SUMO修饰或与LEF1的关联(图。B、 车道4)。通过总细胞裂解物的免疫印迹分析测定LEF1和PIASy表达的相对水平(图。B、 下部面板)。综上所述,这些实验表明,PIASy的表达导致多种蛋白质(包括LEF1)的广泛SUMO结合。此外,实验表明,RING域是SUMO共轭所需的一个重要结构行列式。
PIASy在体外重建系统中刺激LEF1的SUMO偶联
PIASy对蛋白质酰化的刺激作用提出了PIASy是否直接参与这一过程的问题。SUMO与靶蛋白的结合与泛素系统有许多相似之处,尽管还没有发现SUMO修饰蛋白的E3连接酶。为了检测LEF1是否可以在E1和E2酶单独存在下进行酰化,或者PIASy是否促进这一过程,我们使用了一个含有纯化蛋白质的体外重组系统。将重组LEF1与SUMO1、E1酶Aos1/Uba2、E2酶Ubc9和ATP孵育后,LEF1未发生显著的SUMO结合(图。A、 车道2,14)。然而,添加沉淀的T7-PIASy免疫复合物或细菌表达的GST-PIASy允许SUMO1与LEF1的有效和多重结合(图。A、 车道3、15、16)。SUMO1的结合依赖于所有其他成分,并且未与RING结构域发生突变的PIASy蛋白检测到(图。A、 车道4)。通过免疫印迹分析和抗SUMO1抗体,LEF1的慢迁移形式被鉴定为SUMO1结合物(数据未显示)。PIASy还增强了SUMO2与重组LEF1的体外结合(图。A、 车道12)。在银染凝胶上检查T7-PIASy免疫复合物的纯度,表明T7-PIASy蛋白是免疫复合物中的主要蛋白,无法检测到其他铜纯化蛋白的化学计量水平(图。B) ●●●●。综上所述,这些数据表明PIASy可以作为LEF1的SUMO E3连接酶。因此,SUMO修饰的酶需求与泛素修饰过程的酶需求相似。
PIASy在体外作为LEF1的SUMO E3连接酶发挥作用。(A类)PIASy刺激LEF1的SUMO结合。如图所示,重组LEF1(25 ng)在缺乏或存在5 mM ATP、60 ng重组SUMO1或SUMO2、150 ng重组E1(Aos1/Uba2异二聚体)、10 ng重组E2(Ubc9)和4μL免疫复合物(IC)(纯化野生型(wt)、环突变体或模拟转染的T7-PIASy)的情况下,在30°C下培养60分钟。(车道14–16)如图所示,使用细菌表达的野生型GST-PIASy(300或1000 ng)代替IC纯化的T7-PIASy。通过添加样品缓冲液终止反应。通过SDS-PAGE分辨LEF1和SUMO修饰的LEF1,并通过抗LEF1免疫印迹检测。车道内SUMO改良LEF115和16迁移速度慢于车道三和12因为电泳条件不同。(B)用SDS-PAGE分析IC纯化的T7-PIASy蛋白,并用银染法检测其纯度和相对丰度。(C)SUMO修饰的LEF1结合DNA。重组LEF1在ATP、E1、E2、SUMO1和野生型PIASy(SUMO1-LEF1)的存在下如上文所述进行酰化,或者在没有E1酶(ΔE1)的相同条件下进行处理,因此LEF1没有被酰化。LEF1琥珀酰化的程度是通过使用等量的ΔE1和琥珀酰化反应的抗LEF1免疫印迹测定的(D类,输入)。未修饰LEF1(25 ng)或sumoylated LEF1(25ng)与wt或突变(mut)LEF1位点结合的能力通过电泳迁移率变化分析确定。(D类)SUMO修饰的LEF1与β-catenin结合。等量未经修饰或SUMO修饰的LEF1结合固定化His的能力6-β-catenin通过体外联合试验进行分析。输入、未绑定和他的6通过抗LEF1免疫印迹检测–β-catenin结合的LEF1。重组LEF1蛋白不能单独与镍珠结合(数据未显示)。
在LEF1中,发现了两个SUMO共轭的共有位点,一个位于β-catenin相互作用域的25位,另一个位于HMG域上游的267位。为了检测LEF1的SUMO修饰是否会改变DNA结合能力和/或与β-连环蛋白的结合,我们在体外产生了SUMO1修饰的LEF1,并用放射性标记的LEF1结合位点进行了电泳迁移率偏移测定。LEF1和SUMO1修饰的LEF1检测到类似的DNA结合(图。C) ●●●●。此外,我们将LEF1和SUMO1修饰的LEF1用于固定化His-taggedβ-catenin的下拉实验,并通过抗LEF1抗血清的免疫印迹分析显示结合的LEF1蛋白。LEF1和SUMO-LEF1与β-catenin相关,效率相似(图。D) 。总之,这些实验表明PIASy作为LEF1的SUMO E3连接酶发挥作用,并且LEF1的SUMO修饰不会改变其与DNA和β-连环蛋白的相互作用。
PIASy抑制LEF1活性
LEF1作为转录调节因子的功能可以通过与其他辅因子的结合而被正向或负向调节。作为对Wnt信号的响应,LEF1与β-catenin的关联导致转录激活显著增加(van de Wetering等人,1997年;Hsu等人,1998年). LEF1和PIASy在转染的293T细胞中的共表达缺乏明显水平的内源性LEF1,没有导致任何可检测到的LEF激活7-含有多个LEF1结合位点的磷脂酶报告子结构(数据未显示)。然而,PIASy以剂量依赖性的方式显著降低LEF1和β-catenin对报告结构的转录激活,但并没有降低缺乏LEF1结合位点的报告结构的基础活性(图。A;数据未显示)。同样,PIASy通过另一个LEF1/TCF家族成员TCF1和β-catenin(数据未显示)有效拮抗报告基因的激活。我们还观察了PIASy的抑制作用,在报告结构中,天然Twin启动子与荧光素酶基因相连(图。B类;Nishita等人,2000年). 在缺少LEF1结合位点的突变Twin启动子中未观察到PIASy介导的抑制作用(图。B) ●●●●。为了确定在缺乏β-catenin的情况下,PIASy是否拮抗LEF1的激活电位,我们使用了TCRα-fos-CAT报告子结构,该结构由LEF1与Ets1和AML1联合刺激(图。C) ●●●●。PIASy抑制TCRα增强子的活性,表明PIASy拮抗LEF1对Wnt依赖性和Wnt非依赖性的激活。我们还证实,在用LEF转染Jurkat T细胞时,PIASy抑制内源性LEF1的活性7-fos-Luc报告子结构和β-catenin(图。D) 。有趣的是,PIASy的一种突变形式,其中RING基序发生了突变,使转录激活增加了2倍,这表明这种突变产生了一种显性阴性的PIASy形式(图。D) 。此外,RING突变体激活LEF1依赖性转录激活的能力表明内源性PIASy可能正常抑制LEF1活性。与野生型PIASy相比,PIASy富含Ser的结构域的突变只是适度降低了抑制程度(图。D) 。最后,我们检测了LEF1中两个SUMO结合位点对PIASy介导的抑制的贡献。PIASy抑制LEF1 M2/K267R转录激活电位的效率几乎与野生型LEF1一样(图。E) ●●●●。因此,PIASy对LEF1活性的抑制需要PIASy的RING结构域,但不需要LEF1中的两个一致的sumoylation位点。
PIASy抑制LEF1活性。(A类)PIASy抑制多重LEF1报告者的LEF1活性。用1μg LEF1荧光素酶报告体转染293T细胞,该报告体包含多重聚LEF1结合位点,以及编码β-半乳糖苷酶(25 ng;用于正常化)、LEF1(30 ng)、β-连环蛋白(1μg)或增加T7-PIASy(0.1、0.3或1μg,如图所示。在本实验和随后的实验中,荧光素酶或CAT活性水平针对β-半乳糖苷酶活性进行了标准化,并表示为相对于单独转染报告构建物的细胞的荧光素素酶或CAT活性水平的折叠激活。所有转染实验均至少进行了三次,并显示了代表性实验的结果。(B)PIASy抑制LEF1依赖性Twn报告基因活性。将2μg Twn荧光素酶报告基因构建物转染NMuMG上皮细胞,该报告基因构建体包含野生型(Twn-Luc)或突变型(ΔLEF-Twn-Loc)LEF1结合位点以及编码β-半乳糖苷酶(0.5μg;用于正常化)、LEF1(0.5μg)、β-连环蛋白(5μg)或PIASy(1μg)的表达构建物,如图所示。(C)PIASy抑制TCRα增强子活性。如图所示,用0.25μg TCRα-CAT报告子构建物和编码β-半乳糖苷酶(50 ng;用于正常化)、LEF1(100 ng)、Ets1和AML1(各250 ng)或T7-PIASy(0.3或1μg)的表达构建物转染293T细胞。(D类)野生型PIASy抑制内源性LEF1活性。用1μg含有多聚化LEF1结合位点的LEF1萤光素酶报告构建体以及编码β-半乳糖苷酶(0.5μg;用于标准化)、β-连环蛋白(5μg)或增加量的野生型T7-PIASy(1或3μg)、RING突变的T7-PIASy(1或3μg)的表达构建体转染Jurkat细胞,或Ser-mutated T7-PIASy(1或3μg),如图所示。(E类)LEF1中SUMO共识位点的突变并不能消除PIASy介导的LEF1活性抑制。将1μg LEF1荧光素酶报告体转染293T细胞,该报告体包含多重聚LEF1结合位点,以及编码β-半乳糖苷酶(25 ng;用于正常化)、野生型或突变型M2/K267R LEF1(30 ng)、β-连环蛋白(1μg)或增加量的T7-PIASy(0.1、0.3或1μg。
PIASy与核基质附着区DNA结合
参与与LEF1相互作用的PIASy的N末端结构域与核基质结合蛋白SAF-A具有序列相似性(Kipp等人,2000年). PIAS蛋白和SAF-A之间的同源区域被称为SAP域,并被提议用于介导与核基质附着区域(MARs;Aravind和Koonin 2000). 为了检测PIASy与核基质相关DNA的假定结合,我们使用纯化的GST-PIASyN97和包含野生型或突变MAR共识序列的放射性标记寡核苷酸进行了电泳迁移率变化分析(Bode等人,1992年). 用野生型MAR序列检测到结合,但用突变的MAR序列或LEF1结合位点寡核苷酸显著减少(图。A;数据未显示)。
PIASy与核基质附着区(MAR)DNA结合。(A类)PIASy-SAP结构域与MAR DNA结合。如图所示,通过电泳迁移率变化分析,检测了包含假定SAP结构域的GST-PIASyN97重组融合蛋白(0.1或0.3μg)与野生型(wt)或突变型(mut)MAR共识序列的结合能力。(B)PIASy的N末端SAP结构域是体内核基质结合所必需的。用编码wt T7-PIASy的表达载体瞬时转染COS7细胞,wt T7-2PIASy是一种突变的T7-PIASy蛋白,缺乏其N端93个氨基酸和SAP结构域,但含有用于核靶向的异源NLS(T7-PIASPy–Δ93-NLS)或标记为Bright的蛋白a。转染后48小时,细胞立即固定(上面的或在固定前进行核基质制备(降低面板)。用抗T7单克隆抗体间接免疫荧光法检测T7表位标记的PIASy蛋白。Bright是一种已知与MAR和核基质相关的蛋白质,用兔IgG进行间接免疫荧光检测。通过共焦显微镜收集图像。所示细胞代表70%以上的转染细胞。
为了证实PIASy的N末端在介导与核基质的关联中的作用,我们比较了野生型PIASy和缺乏包含SAP域的N末端93残基的PIASy突变形式在核基质制备中的保留。由于PIASy N末端的缺失损害了核定位(数据未显示),我们在突变蛋白中添加了一个异源核定位序列。在这些实验中,我们使用MAR结合蛋白Bright作为阳性对照(Zong等人,2000年). 正如预期的那样,Bright保留在核基质制备中(图。B) ●●●●。同样,在核基质制备中保留了PIASy,但没有保留ΔN93-PIASy-NLS,这表明PIASy的N末端介导了与MAR和核基质的关联。
PIASy将LEF1瞄准核机构
研究表明,SUMO蛋白定位于特定的亚核结构,即含有PML的核体(有关综述,请参阅2001年年初;Zhong等人,2001年). 这些结构包含PML、Sp100和其他几种蛋白质,与核基质相关(Dyck等人,1994年;Chang等人,1995年). 为了检测PIASy对LEF1亚核定位的影响,我们对转染COS7细胞进行了双色免疫荧光实验(图。). 共聚焦显微镜显示LEF1的整个细胞核染色,而PIASy主要定位于细胞核中的点状结构(图。A、 顶部面板)。LEF1和PIASy的共表达导致LEF1显著重新分布到与PIASy共定位的点状结构中,并且可以在细胞核中检测到不同数量的LEF1(图。A、 中间和底部面板)。为了检测PIASy是否与SUMO蛋白共定位,我们将PIASy与标记的SUMO1或SUMO2一起表达。观察到它们的核分布完全重叠,这与PIASy作为E3连接酶的作用一致(图。B、 第一面板;数据未显示)。我们还注意到PIASy和Flag-SUMO2或Flag-SSUMO1的表达增强了LEF1向核小体的再分配(图。B、 第二面板;数据未显示)。为了确定LEF1与PIASy的SUMO结合的作用,我们分析了LEF1在突变的RING域PIASy蛋白存在下的核分布。此外,我们在野生型PIASy存在的情况下,检测了缺乏一致SUMO结合位点的突变M2/K267R LEF1蛋白的定位。突变的PIASy蛋白没有将LEF1重新定位到核小体,而突变的LEF1蛋白在野生型PIASy存在的情况下有效地靶向核小体(图。B、 第三和第四面板)。总之,这些数据表明,RING结构域的完整性,而不是LEF1的sumoylation状态,对LEF1在核体内的隔离非常重要。
(A类)PIASy将LEF1重定标为核体。COS7细胞要么模拟转染,要么用编码LEF1或T7-PIASy的表达结构转染。用间接免疫荧光法检测指示蛋白的细胞内分布,并用共焦显微镜进行分析。分别用抗LEF1抗体和抗T7单克隆抗体检测LEF1和T7-PIASy的细胞内分布。仅LEF1在整个核内呈均匀分布(上面的,中间的但在T7-PIASy存在的点状核体中检测到(中间,下部面板)。大约20%的细胞在<20个核体中显示LEF1和T7-PIASy的共定位(中间的而超过50%的细胞显示LEF1和T7-PIASy在多个(>20)核体中共定位(降低面板)。(B)PIASy与SUMO修饰的蛋白质共定位。如图所示,用编码wt T7-PIASy、T7-PIASy RING mut、Flag-SUMO1、Flag_SUMO2、wt LEF1或mut LEF1 M2/K267R的表达结构转染COS7细胞。PIASy在上面的用抗PIASy抗体检测面板。用抗T7单克隆抗体检测其余面板中的T7-PIASy蛋白。用抗Flag单克隆抗体检测到Flag-SUMO1。在80%以上的共转染细胞中,T7-PIASy与Flag-SUMO1或Flag-SSUMO2在核体中有效共定位(顶部面板;数据未显示)。Flag-SUMO1或Flag-SUMO2与LEF1和T7-PIASy的共表达将LEF1的核体定位增强了约两倍(第二个面板;数据未显示)。T7-PIASy RING突变蛋白在整个细胞核中显示出均匀染色,并且无法将LEF1重新定位到核体(第三组)。在T7-PIASy和Flag-SUMO2的存在下,LEF1 M2/K267R突变蛋白有效地重新定位到核体(底部面板)。(C)PIASy与PML机构部分共定位。如图所示,将T7-PIASy、LEF1和表位标记的HA-Sp100转染到COS7细胞中。用抗T7单克隆抗体和抗MeK9分别检测组蛋白H3(异染色质标记)的T7-PIASy和二甲基赖氨酸9的细胞内分布(左边). 分别用抗LEF1和抗SC35单克隆抗体检测LEF1(与T7-PIASy共表达)和SC35的分布,SC35是剪接机制的组成部分(中心). 分别用抗LEF1抗体和抗HA单克隆抗体检测LEF1(与T7-PIASy共表达)和PML核体成分HA-Sp100的分布(正确的). LEF1在PML核体内仅与HA-Sp100呈部分重叠分布。
最后,我们通过比较LEF1或PIASy的染色模式与PML小体的Sp100成分、剪接因子SC35和甲基化组蛋白(异染色质的标志)的染色模式,检查了含有PIASy和LEF1的核体的身份。仅在Sp100中观察到LEF1和PIASy的广泛共定位(图。C) 这表明PIASy将LEF1靶向PML核体的一个子集。
讨论
PIASy作为SUMO E3连接酶发挥作用
SUMO结合系统与泛素结合系统有许多相似之处,包括SUMO被E1激活酶激活,SUMO转移到E2结合酶,E2结合酶可通过共识基序ψKXE直接与蛋白质底物相互作用(有关综述,请参阅Hershko和Ciechanover 1998;梅尔基奥2000;2001年年初;Muller等人,2001年). 然而,第三类蛋白质E3酶在泛素途径中实现的靶向特异性在SUMO修饰途径中尚不清楚。
三组数据支持PIASy作为SUMO E3连接酶的作用。首先,包含SAP域的PIASy的N末端区域与SUMO底物LEF1特异性相互作用。PIASy的这一区域还与与核基质附着区相关的DNA序列相互作用,并可能参与靶蛋白的亚核隔离。第二,野生型PIASy在体内刺激LEF1和多种其他蛋白的SUMO修饰,并在体外系统中极大地刺激LEF1与重组蛋白的SUMO偶联。PIASy中RING结构域的突变损害体内蛋白质底物的sumoylation,并且在体外存在RING突变PIASy蛋白时未检测到LEF1的SUMO结合,这与泛素E3连接酶主要类别中RING域的功能重要性一致(有关综述,请参阅Joazeiro和Weissman 2000;Jackson等人,2000年). 与泛素途径类似,PIASy的RING结构域可能参与与E2酶Ubc9的相互作用,也可能在底物识别中发挥作用。与这一概念一致,在严格的共免疫沉淀条件下,RING结构域的突变显著损害了与LEF1的关联,其中LEF1和野生型PIASy之间的相互作用被保留(数据未显示)。第三,PIASy与SUMO1和SUMO2在核体内广泛共存。这种定位随细胞周期和细胞类型而变化(数据未显示),与含有SUMO的PML核体的动态调节以及SUMO修饰的TEL蛋白在细胞周期中被调节组装到核体中一致(Everett等人,1999年;Chakrabarti等人,2000年).
LEF1的SUMO共轭与PIASy结合的作用
PIASy的表达导致LEF1的sumoylation和亚核隔离。尽管LEF1的SUMO结合的生理相关性尚不清楚,但有三项证据表明,LEF1的SUMO修饰增强了其与PIASy的关联,并将LEF1靶向核体。首先,与在总细胞裂解物中观察到的相比,在使用T7-PIASy的联合免疫沉淀试验中,SUMO结合的LEF1与未修饰的LEF1的比率显著增加。LEF1的Sumoo偶联对其与PIASy相互作用的影响令人想起Sp100与HP1之间的结合增强(Seeler等人,1998年,2001). 第二,SUMO1或SUMO2与LEF1和PIASy共表达增强了LEF1对核体的靶向性。第三,缺乏SUMO结合的RING突变PIASy蛋白无法在核体中隔离LEF1,并在转录激活分析中作为显性负蛋白发挥作用。这些结果表明SUMO修饰、核体隔离和转录抑制密切相关。虽然对LEF1 M2/K267R突变体的分析表明,LEF1的sumoylation可能不是其与PIASy及其亚核隔离相关的先决条件,但PIASy通路中另一个关键靶点的SUMO修饰可能需要抑制LEF1的转录,而不依赖于SUMO的修饰。或者,LEF1可能在额外的非敏感SUMO结合位点以低水平进行聚合,这在Western blot中不容易检测到,但可能足以进行亚核隔离和抑制LEF1活性。
除了少数例外,SUMO共轭的功能仍然相当模糊(有关审查,请参阅梅尔基奥2000;Muller等人,2001年). 与LEF1类似,p53蛋白被酰化,主要SUMO结合位点K386R的突变不影响p53依赖的反式激活、生长抑制或p53靶向核小体(Fogal等人,2000年;Kwek等人,2001年). 然而,p53与SUMO1和Ubc9或PML3共表达可增强p53向核小体的募集(Fogal等人,2000年). 因此,LEF1和p53在亚核结构中的募集可能是这些蛋白质调控的关键决定因素,sumoylation可能只是隔离的结果。
PIASy介导的LEF1靶向核体与LEF1活性的抑制密切相关。PIASy本身定位于核体和核基质中,这种定位取决于N末端SAP域的存在。PIASy存在时LEF1的亚核定位与PML核体的子集重叠。这些亚核结构非常异质,与转录抑制、转录激活和蛋白质降解有关(有关综述,请参阅Hatta和Fukamizu 2001). 在PIASy存在的情况下,LEF1的蛋白质半衰期没有显著变化(t1/2 = 13小时无PIASy与t1/2 = 10.2小时,使用PIASy;数据未显示)。因此,通过将LEF1靶向异染色质或将LEF1招募到含有共抑制剂的复合物中,LEF1的活性可能受到抑制。例如,将转录因子Ikaros靶向异染色质已被证明可以介导Ikaros-靶基因的抑制(Brown等人,1997年). 然而,含有LEF1和PIASy的核体并不与二甲基化组蛋白共定位,这是异染色质的标志(尼尔森等人,2001年). PML核小体中含有转录共抑制因子,如Smrt/N-CoR和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)。用曲古抑菌素A(HDAC抑制剂)治疗细胞(有关综述,请参阅Yoshida和Horinouchi 1999年),未对抗PIASy介导的LEF1活性抑制(数据未显示)。因此,不同于HDAC的PML成分可能解释了PIASy介导的LEF1活性抑制。所有PIAS家族成员都在SAP域中包含一个LXXLL签名基序,这是反式阻遏所必需的,可能被尚未识别的辅阻遏蛋白识别(Liu等人,2001年).
PIAS蛋白在染色体结构和转录调控中的作用
最近,基因实验果蝇属为PIAS蛋白的作用提供了一些见解。这个果蝇属正交dPIAS已被确定为位置效应杂色的抑制因子Su(var)2-10,广泛的遗传分析表明,dPIAS参与调节多种核过程,包括染色体的凝聚和遗传、端粒的聚集及其与核膜的关联(Hari等人,2001年). dPIAS蛋白定位于点状核模式,在间期核中,也观察到与核膜的联系(Hari等人,2001年). dPIAS不与HP1和异色区共定位。因此,哺乳动物PIASy蛋白和dPIAS的核表达模式显示出许多相似之处。尽管解释突变表型的dPIAS的主要靶点尚不清楚,但dPIAS还通过与STAT蛋白的相互作用参与细胞因子信号的调节(Betz等人,2001年).
生化研究表明,PIAS蛋白与多种转录因子直接相互作用,包括STATs、雄激素受体和p53,并能对其活性进行正或负调节(Liu等人,1998年;Kotaja等人,2000年;Gross等人,2001年;Nelson等人,2001年). 特别是PIASy可拮抗STAT1、p53和雄激素受体的活性(Gross等人,2001年;Liu等人,2001年;Nelson等人,2001年). PIAS1与PIASy的不同之处在于它能够抑制STAT1的DNA结合并增强雄激素受体的转录激活(Kotaja等人,2000年;Gross等人,2001年;Liu等人,2001年). 因此,PIAS蛋白的转录效应是多种多样的,确定它们是否反映了PIAS蛋白或其相互作用伙伴的差异将是很重要的。
总之,我们的实验揭示了PIASy作为刺激LEF1 SUMO结合的核基质相关蛋白的功能。PIASy的一个关键功能似乎是将LEF1靶向核体并抑制LEF1活性。PIASy表达和活性的调节可能在细胞周期中受到调节,这将是一个很有前途的研究课题。此外,对假定的PIASy相关蛋白的鉴定和PIASy增强SUMO结合的额外靶点的鉴定将阐明PIAS蛋白的多种调节特性和PIAS突变的多效性表型。
材料和方法
酵母双杂交筛选、cDNA文库筛选和构建
LEF1与LexA DNA结合域的融合蛋白(Giese和Grosschedl 1993年)作为诱饵筛选酵母双杂交E10小鼠cDNA-VP16文库(Bruhn等人1997). 一个291 bp的双杂交克隆,克隆60,通过随机引物进行放射标记,并用于筛选小鼠胸腺细胞cDNA文库。对一个1.6kb的cDNA克隆60-7z进行测序,确定该克隆为小鼠PIASy。全长60-7z被亚克隆为Xho公司I型钝头插入Sma公司I位点产生CMV-T7-PIASy并进入Sma公司pGEX-2T(Pharmacia)的I站点生成GST-PIASy。GST-PIASyN97是通过将最初的60个双杂交克隆亚克隆到pGEX-3X(Pharmacia)中,作为一个Sma公司我/生态RI插件。T7-PIASyΔN93是通过60-7z的定点突变和将产生的突变体亚克隆为Sma公司我/Xho公司I型钝头插入Sma公司pEVRF3-T7的位置。T7-PIASyΔN93-NLS的构造类似,只是插入物被亚克隆到Sma公司pEVRF3-T7-NLS的I位点。T7-PIASy RING突变体和T7-PIASy Ser突变体是通过60-7z的定点突变和产生的突变cDNA的亚克隆构建的Xho公司I型钝器插入Sma公司pEVRF2-T7的I位点。编码全长和截短LEF1蛋白的质粒先前已有描述(Giese和Grosschedl 1993年;Bruhn等人,1997年). LEF1 K267R-HA是通过pBluescript-LEF1的定点突变和将产生的突变体作为千磅我/Xba公司我插入。LEF1M2层(Hsu等人,1998年)被克隆为英国标准普尔EI公司/X厘米我插入pCG-LEF1 K267R-HA以生成pCG-LEF1 M2/K267R。LEF公司7-磷脂酶和TCRα-fos-CAT报告质粒,以及RSV–β-半乳糖苷酶、CMV-AML1、CMV-Ets1、CMV–β-catenin、LEF1-His6和他的6–β-catenin表达质粒先前已有描述(Bruhn等人,1997年;Hsu等人,1998年). 从EST克隆DKFZp434DO717中PCR扩增人Uba2,并克隆到Nhe公司我和Bgl公司pET11d(Novagen)的II位点。从EST克隆DKFZp434J0913中PCR扩增人Aos1,并将其克隆到Nhe公司我和巴姆pET28a(Novagen)的HI位点。从EST克隆IMAGp998A061122中PCR扩增小鼠Ubc9,并克隆到Nde公司我和巴姆pET23a的HI位点。从全长cDNA中PCR扩增SUMO1(1-97)并克隆到Nde公司我和巴姆pET11a(Novagen)的HI位点。寡核苷酸序列可根据要求提供。所有克隆均经序列分析和蛋白表达证实。
蛋白质表达和纯化
这个35使用兔网织红细胞裂解物(Promega)从pBluescript KS+(Stratagene)体外翻译S-标记的全长和截短LEF1蛋白。对于细菌表达的蛋白质,纯化涉及IPTG诱导表达大肠杆菌BL21黄金(Stratagene)。缓冲液中各含有1μg/mL亮肽、胃蛋白酶抑制素和抑肽酶以及1 mM DTT(或β-巯基乙醇)。裂解缓冲液也含有0.1 mM PMSF。对于SUMO1纯化,用Q Sepharose(Sigma)对在50 mM Tris-Cl(pH 8.0)和50 mM NaCl中溶解的细菌进行预处理,并通过凝胶过滤进行纯化。为了纯化催化活性SUMO E1酶,His-As1和Uba2在细菌中共表达;在50 mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)、300 mM氯化钠和10 mM咪唑中溶解;并在ProBond树脂(Invitrogen)上纯化,然后进行分子筛(Superdex 200)和离子交换色谱(Mono Q,Pharmacia Biotech)。为了纯化Ubc9,将细菌在50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)和50mM NaCl中裂解,与SP Sepharose珠(Sigma)一起孵育,用50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)和300mM NaCl洗脱,并通过Superdex 200柱筛分。所有蛋白质在用于体外sumoylation分析之前,都要针对转运缓冲液进行透析(20 mM HEPES,pH值7.5,110 mM醋酸钾,2 mM醋酸镁和0.5 mM EGTA)。为了纯化GST-PIASyN97或全长GST-PIASy,细菌在10 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)、150 mM氯化钠、10 mM EDTA、2 mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物(胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制剂、安替丁、抑肽酶、bestatin和leupeptin各5μg/mL、0.25μg/mL胃蛋白酶抑制素和1 mM PMSF;Sigma)中进行裂解并按照制造商的说明用谷胱甘肽-淀粉珠纯化(法玛西亚)。为了净化他的6–β-catenin、细菌在20 mM HEPES(pH 7.5)、300 mM NaCl、0.2%TX-100、10%甘油、7 mMβ-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物中进行裂解,并根据制造商的方案(Qiagen)在Ni-NTA珠上纯化。根据制造商的方案(Bio-Rad),通过Bradford分析测定蛋白质浓度。
体外琥珀酰化试验
为了纯化T7-PIASy蛋白的免疫复合物(IC),293T细胞要么模拟转染,要么转染编码野生型T7-PIASy或T7-PIASPy RING突变体的表达结构。转染后48小时,在WL缓冲液中收集细胞(50 mM Tris-Cl,pH 8.0,400 mM NaCl,0.5%NP-40,10%甘油,1 mM EDTA,1 mM DTT,蛋白酶抑制剂混合物,1 mM-NaF和0.4 mM甲氧钒酸钠)。将澄清的裂解产物(约4 mg总细胞蛋白)在缺乏NaCl的WL缓冲液中稀释五倍,并用5μg抗T7 mAb和200μL 50%蛋白g-Sepharose浆液免疫沉淀T7-PIASy蛋白,如所述(哈洛和莱恩1988). 用含有400 mM NaCl的WL缓冲液清洗IC 4次,用运输缓冲液清洗2次。沉淀物IC在等体积的运输缓冲液中重新悬浮。沉淀后的T7-PIASy IC的纯度和相对丰度通过SDS-PAGE、银染和抗T7免疫印迹测定。在添加0.05%吐温20、0.2 mg/mL六级卵清蛋白和1 mM抑肽酶、亮氨酸蛋白酶、胃蛋白酶抑制素、AEBSF和DTT(Sigma)的运输缓冲液中,以20μL的总体积进行重组蛋白的酰化试验。反应在30°C下培养1小时,并通过添加SDS样品缓冲液停止。将样品在7%聚丙烯酰胺凝胶上解析,并通过抗LEF1免疫印迹检测磺酰化的LEF1。重组蛋白的浓度如图图例所示。
细胞培养、瞬时转染和报告分析
293T和COS7细胞在添加青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG)和10%胎牛血清(FBS;Invitrogen Life Technologies)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。NMuMG细胞在添加PSG、10μg/mL胰岛素(Sigma)和10%FBS的DMEM中培养。Jurkat T细胞在添加了PSG、50μMβ-巯基乙醇(Sigma-)和10%FBS的RPMI 1640中培养。293T、COS7、,并在转染前12小时将NMuMG细胞接种到60mm组织培养板上,并用10μg质粒DNA通过磷酸钙法转染(Sambrook等人,1989年). 如前所述,Jurkat细胞转染通过电穿孔30μg质粒DNA进行(Hughes和Pober,1996年). 通过添加载体质粒DNA,每次转染实验中的总DNA浓度保持不变。在转染后36至48小时,在200μL报告裂解缓冲液中收集细胞,并根据制造商的说明进行荧光素酶分析(Promega)。CAT和β-半乳糖苷酶检测按所述进行(Starr等人,1996年).
体外关联分析、免疫沉淀和Western blot分析
体外GST-PIASyN97和His6–β-catenin下拉分析基本上如所述进行(Bruhn等人,1997年). 对于体外试验6–在下拉分析中使用前,对β-catenin关联分析、重组LEF1或SUMO-LEF1进行透析,以对抗10 mM Tris-Cl(pH 8.0)、50 mM NaCl、10%甘油、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物。为了进行共免疫沉淀实验,在共免疫沉淀缓冲液中收集细胞(20 mM Tris-Cl,pH 8.0,25 mM NaCl,1.5 mM MgCl2,1 mM EGTA,1%TX-100,10%甘油,1mM DTT,蛋白酶抑制剂混合物,1 mM-NaF和0.4 mM甲氧钒酸钠)。如前所述,预先分离等量的总蛋白,并用2μg抗T7单克隆抗体(Novagen)免疫沉淀(哈洛和莱恩1988). 对于靶蛋白的直接免疫沉淀,在RIPA缓冲液(pH 7.2的10mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、1%脱氧胆酸钠、1%Triton X-100、0.1%SDS、1mM DTT、蛋白酶抑制剂混合物、1mM NaF和0.4mM原钒酸钠)中收获细胞。根据制造商的说明(Amersham-Pharmacia),使用以下抗体和稀释液,采用ECL方法进行蛋白质印迹:兔抗LEF1抗血清,1:4000;抗T7单克隆抗体(Novagen),1:5000;和反标记M2单抗(Sigma),1:4000。
电泳迁移率变化分析
野生型MAR(5′-TCTTAATTTCTCATATT TAGAATTC-3′)或突变型MAR32P和凝胶在20%天然聚丙烯酰胺凝胶上纯化。LEF1寡核苷酸之前已经描述过(Hsu等人,1998年). DNA结合反应包含20 mM HEPES(pH 7.9)、50 mM NaCl、1 mM DTT、5 mM EDTA、5%甘油、2μg BSA、10 ng poly dI-dC、5000 cpm放射性标记探针以及图图例中所示的蛋白质量。电泳迁移率变化分析基本上如所述进行(Bruhn等人,1997年;Hsu等人,1998年).
间接免疫荧光、核基质制备和共焦显微镜
细胞在室温下用0.5%TX-100在细胞骨架缓冲液(pH 7.1、1 mM EGTA和3 mM MgCl下的10 mM PIPES)中渗透2 min2)用3.2%多聚甲醛在细胞骨架缓冲液中固定20min。间接免疫荧光基本上如所述进行(Zeng等人,1997). 为了生产抗PIASy抗血清,用GST-PIASyN97免疫兔子。使用的主要抗体和稀释液如下:兔抗LEF1,1:500;兔抗PIASy,1:200;抗T7单克隆抗体(Novagen),1:1000;抗Flag M2 mAb(西格玛),1:1000;抗HA单克隆抗体(罗氏),1:200;抗二甲基赖氨酸9 H3抗血清(尼尔森等人,2001年), 1:1000; 和抗SC35单克隆抗体(Zeng等人,1997年). 二级抗体为FITC-结合抗兔抗血清(Jackson Laboratories),1:500;和德克萨斯红结合抗鼠抗血清(Jackson Laboratories),1:1000。图像是在徕卡NT共焦显微镜上获得的。核基质制备基本上按照所述进行(Cai和Kohwi-Shigematsu 1999).