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美国国家科学院院刊。2011年6月28日；108(26): 10562–10567.
2011年6月13日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1107559108
PMCID公司：项目经理3127925
PMID：21670280

内质网应激增强肺纤维化重塑

威廉·劳森,a、，b、，1,2 东升成,a、，1 琥珀色L.Degrese,一 哈里克里什纳·坦约尔,一 瓦西里·波卢什金,一 徐小川,一 道恩·C·纽科姆,一 布列塔尼·琼斯,一 胡安罗丹,a、，c、，d日 柯克·B·莱恩,一 爱德华·E·莫里斯,e、，f、，克 迈克尔·F·比尔斯,e（电子） 菲奥娜·尤尔,小时和蒂莫西·S·布莱克威尔a、，b、，小时，我
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补充资料

摘要

家族性和散发性特发性肺纤维化患者的肺部存在内质网应激的证据。我们通过以下方法测试了内质网应激是否会导致或加剧肺纤维化(我)表面活性剂蛋白C（L188Q）突变形式的条件表达香港证监会)发现于家族性间质性肺炎和(ii（ii）)用蛋白错误折叠剂突尼斯霉素进行气管内治疗。我们开发了表达L188Q的转基因小鼠香港证监会仅在II型肺泡上皮中使用Tet-On系统。L188Q的表达香港证监会诱导的内质网应激，由重链Ig结合蛋白（BiP）表达增加和X-box结合蛋白1（XBP1）mRNA剪接确定，但在没有第二次纤维化刺激的情况下未发现肺纤维化。气管内博莱霉素后，L188Q香港证监会-与对照组相比，表达基因的小鼠出现了过度的肺纤维化并降低了静态肺顺应性。博莱霉素处理的L188Q香港证监会小鼠肺泡上皮细胞凋亡增加，肺中成纤维细胞数量增加。在补充模型中，气管内衣霉素治疗未能诱导肺重构，但导致博来霉素诱导的纤维化增加。这些数据支持内质网应激产生功能失调的上皮细胞表型，促进纤维化重塑的概念。ER应激途径可能是特发性肺纤维化的重要治疗靶点。

关键词：S100A4，未折叠蛋白反应

特发性肺纤维化（IPF）是特发性间质性肺炎（IIP）最常见和最严重的形式。IPF的特征是呼吸困难、运动耐受性降低，以及由于远端肺实质持续纤维化重塑而进展为呼吸衰竭(1). 尽管IPF的病因尚不清楚，但最近的家族性间质性肺炎（FIP）病例已开始揭示潜在的致病机制。FIP是IIP的一小部分，被定义为诊断为IIP的两个或多个生物学相关家庭成员(2,三). 在FIP中，85%的生物病理证实病例的病理学与普通间质性肺炎一致，病理学相当于IPF(2). 2002年，我们报道了一个在表面活性蛋白C的羧基末端区域发生杂合突变的FIP大家族(香港证监会) (4). 该外显子5+128 T→A颠倒导致谷氨酰胺在前体羧基末端区域的氨基酸188（L188Q）处取代亮氨酸-SFTPC前体蛋白（pro-SP-C）。前SP-C的这个区域被称为BRICHOS结构域，它对蛋白质折叠和加工至关重要。含有BRICHOS结构域的蛋白质的突变通过与翻译后蛋白质加工改变相关的机制与几种退行性和增殖性疾病相关(5).

在培养的肺泡上皮细胞（AECs）中，L188Q的表达香港证监会导致前体蛋白无法在内质网（ER）中正确折叠，导致内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）激活(4,6,7). 我们评估了携带L188Q突变的FIP患者的肺组织，发现肺泡上皮中ER应激标记物上调(6). 随后，我们研究了FIP患者和散发性IPF患者的肺组织香港证监会并注意到内质网应激标志物也以相同的模式存在于肺泡上皮中(6)其他调查人员证实了这一发现(8). 因此，ER应激和UPR激活似乎是IPF肺泡上皮的共同特征。这些发现提出了一些重要且尚未解决的问题，包括内质网应激是否导致或加剧纤维化，如果是，内质网胁迫如何调节上皮细胞的纤维化重塑。为了解决这些问题，我们通过使用Tet-On系统开发了一个转基因小鼠模型，其中突变体L188Q香港证监会可在成年小鼠的II型AECs中诱导表达。在该模型中，L188Q的表达式香港证监会Ⅱ型AEC导致内质网应激和UPR激活；然而，在没有第二种促纤维化刺激的情况下，没有发现纤维化。相反，在表达L188Q的小鼠中发现博莱霉素诱导的肺纤维化增强香港证监会以及用内质网应激诱导剂突尼斯霉素治疗的小鼠，与上皮细胞死亡增加和成纤维细胞积聚增加相关。我们的数据支持这样一种观点，即功能失调的II型AECs通过增加对损伤的敏感性促进肺纤维化，导致过度和失调的重塑。

结果

突变体L188Q的表达香港证监会在AEC中引发内质网应激。

我们在（tet-O）的控制下生成了一个表达式构造7含人启动子香港证监会（六个外显子和内含子），外显子5+128 T→在成熟肽中表达的外显子2中替换和插入11-aa myc标签。我们还创建了一个结构，其中老鼠香港证监会启动子驱动逆转录四环素反式激活子（rtTA）mSFTPC.rtTA。mSFTPC.rtTA和（tet-O）的联合转染7–188Q码香港证监会-myc导致多西环素（Dox）诱导A549细胞中突变前SP-C的表达(图S1A类). 接下来，我们纯化了mSFTPC.rtTA和（tet-O）7–188Q码香港证监会-myc结构体以及在小鼠体内表达四环素控制转录沉默子（tTS）的结构体香港证监会启动子（mSFTPC.tTS）防止转基因表达的基础泄漏(9) (图S1B类)并在C57BL/6J小鼠受精卵母细胞中同时进行三种DNA构建物的原核微注射。在大多数情况下，此策略会将构件串联集成到单个集成站点中(10). 我们确定了4位创始人（共52位潜在创始人），他们拥有所有三个架构(图S2A类). 转基因小鼠发育正常，看起来健康，繁殖良好，将所有三个转基因基因传递给后代。成年小鼠在饮用水中给予Dox，并从全肺组织中分离RNA。实时RT-PCR评估显示L188Q的诱导香港证监会表达不影响原-SP-C mRNA水平，并且比最高表达创始系内源性基因的表达低10倍(图S2B类). 此外，突变体L188Q香港证监会持续暴露于Dox达6个月(图S2C类). myc标记转基因的免疫组织化学（IHC）表明，突变的L188Q pro-SP-C表达仅局限于肺泡角落的细胞，与II型AECs的位置和外观一致(图S2D–F型). 在没有Dox治疗的情况下，未发现转基因表达。

对福尔马林固定、石蜡包埋的肺组织切片进行ER应激标记物重链Ig结合蛋白（BiP）和X盒结合蛋白1（XBP1）的免疫染色。BiP是一种蛋白质伴侣，有助于蛋白质折叠，并随着蛋白质积累和内质网应激而显著增加。XBP1是UPR基因表达的强大反式激活因子，调节多种细胞功能(11,12). 给药1周后，IHC发现L188QⅡ型AEC中BiP和XBP1均上调香港证监会老鼠(图1A类–D类). 此外，Dox治疗后全肺组织样本中BiP蛋白和mRNA表达增加(图1电子和F类). XBP1通常以全长非片段化mRNA表达。当蛋白质积累诱导内质网应激时，非片段化XBP mRNA经历肌醇需要酶1（IRE1）依赖性剪接，产生剪接XBP1亚型，允许翻译生物活性的XBP1蛋白。剪接亚型与总XBP1 mRNA的比值可作为IRE1介导的内质网应激反应的标记(13). Dox处理的L188Q香港证监会小鼠肺组织中XBP1剪接增加，表明内质网应激(图1G公司和H（H）). 总之，这些研究表明转基因在L188Q中的表达香港证监会小鼠引起局限于II型AEC的内质网应激。

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突变体L188Q的表达香港证监会体内导致II型AEC的内质网应激。(A类和B类)WT肺切片中BiP的IHC(A类)和L188Q香港证监会(B类)小鼠，均用Dox治疗1周。(C类和D类)同一小鼠肺部XBP1的IHC。（放大倍数A–D：×400.）箭头指向免疫染色阳性细胞。(电子)WT和L188Q BiP全肺裂解物的Western blot分析香港证监会Dox治疗小鼠1周。β-肌动蛋白显示为负荷控制。(F类)Dox治疗1周的小鼠肺部BiP mRNA表达的实时定量RT-PCR结果，归一化为看家基因RPL19。(n个=每列4–5*P（P）列之间<0.001。）(G公司)RT-PCR凝胶显示L188Q肺中XBP1 mRNA的剪接变体香港证监会和用Dox治疗1周的WT小鼠。(H（H）)用密度计进行XBP1剪接分析。(n个=每列5个*P（P）列间<0.01。）图形数据表示为平均值±SEM。

在Dox治疗1周后，我们分离出原发性II型AECs，以确定myc标记的突变体pro-SP-C在L188Q的II型AEC中的贩运香港证监会小鼠，myc标记与BiP共定位的免疫荧光，BiP仅在ER中表达(图2A类–C类). 相反，myc的表达并没有与高尔基体中的giantin共定位(图2D类–F类). 因此，突变体L188Q似乎香港证监会主要定位于内质网，在高尔基体中几乎不存在，表明突变体原SP-C的加工受到损害。与这个想法一致，我们无法在原发性II型AEC的上清液或L188Q的气道中检测到成熟的myc标记SP-C香港证监会-表达小鼠。与使用L188Q小鼠的全肺组织II型AECs的研究一致香港证监会与WT小鼠的II型AECs相比，BiP蛋白和mRNA表达更高，XBP1剪接增加(图2G公司–J型). 在没有Dox治疗的情况下，L188Q的II型AECs中BiP和XBP1剪接的表达香港证监会小鼠与WT细胞相似，证实了我们模型中内质网应激的诱导性。

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突变株L188Q pro-SP-C定位于从L188Q分离的II型AECs中的ER香港证监会体内Dox处理1周后的小鼠。(A–C)myc标记的双重免疫荧光（红色；A类)ER标记BiP（绿色；B类)合并成像显示强共定位（黄色；C类). 蓝色，DAPI。(D–F型)myc标记的双重免疫荧光（红色；D类)高尔基标记giantin（绿色；电子)合并成像显示最小共定位（黄色；F类). 蓝色，DAPI。（G） 从WT或L188Q分离的II型AECs中BiP的Western blot分析香港证监会Dox体内治疗小鼠1周。β-肌动蛋白显示为负荷控制。(H（H）)BiP mRNA表达的实时RT-PCR，归一化为看家基因RPL19。(n个=每列3个*P（P）柱间<0.05。）(我)RT-PCR凝胶显示II型AEC中XBP1的剪接变体。(J型)用密度计进行XBP1剪接分析。(n个=每列3个*P（P）柱间<0.05。）图形数据表示为平均值±SEM。

突变体L188Q的表达香港证监会加重肺纤维化。

我们治疗了L188Q香港证监会小鼠服用Dox达6个月，以确定内质网应激诱导是否足以导致肺重塑；然而，尽管转基因持续表达，这些小鼠的肺部组织学表现正常(图S3). 尽管L188Q香港证监会单独表达并不会导致肺纤维化，我们推断第二次刺激可能会导致L188Q的更大纤维化香港证监会易受II型AEC影响的小鼠。因此，我们转向气管内博莱霉素，这是实验性肺纤维化最常用的模型。突变体L188Q香港证监会小鼠和WT对照组在Dox开始，1周后接受低剂量i.t.博莱霉素（0.04单位）；3周后，L188Q肺纤维化加重香港证监会小鼠，通过评估毛染色切片确定(图3A类–C类). 此外，L188Q的总肺胶原蛋白更高香港证监会博莱霉素治疗后小鼠与WT小鼠的比较(图3D类). 在以前的研究中，我们使用S100A4作为肺部的成纤维细胞标记物(14–17). 因此，我们通过IHC评估了肺切片中S100A4的表达，并注意到L188Q中有更多S100A4阳性成纤维细胞香港证监会博莱霉素治疗后小鼠与WT对照组的比较(图S4A类和B类和图3电子). 类似地，L188Q香港证监会博莱霉素治疗后，小鼠肺实质中α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性的肌成纤维细胞数量高于WT对照组(图S4C类和D类和图3F类).

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表达突变L188Q的小鼠香港证监会静脉注射博莱霉素后肺纤维化加重。(A类和B类)Dox治疗的WT小鼠和L188Q的经Trichrome染色的肺切片香港证监会小鼠腹腔注射0.04单位博莱霉素后3周。（放大倍率：×100。）(C类)WT和L188Q三色染色肺切片的半定量纤维化评分香港证监会小鼠腹腔注射0.04单位博莱霉素后3周。(n个=每组5人*P（P）与其他组相比<0.05。）结果代表了三个单独的实验。(D类)在静脉注射0.04单位博莱霉素或生理盐水后3周，根据羟脯氨酸微孔板法测定右下叶（RLL）的总肺胶原蛋白含量。(n个=生理盐水组4-6个，博莱霉素组10-个*P（P）与其他组相比<0.05。）(电子)WT和L188Q免疫染色肺切片上S100A4+肺成纤维细胞的半定量评分香港证监会小鼠腹腔注射博莱霉素后3周。(n个=每组5人*P（P）与其他组相比<0.05。）(F类)WT和L188Q免疫染色肺切片上αSMA+肺成纤维细胞的半定量评分香港证监会小鼠腹腔注射博莱霉素后3周。(n个=每组5人*P（P）与其他组相比<0.05。）(G公司)WT和L188Q的静态肺顺应性香港证监会-在i.t.博莱霉素作用3周后用Dox处理的表达小鼠。(n个=生理盐水组3个，博莱霉素组5-8个*P（P）博莱霉素治疗组之间<0.05；#P（P）<0.001，与相应的盐处理组相比。）(H（H）)WT和L188Q的气道阻力香港证监会-在i.t.博莱霉素作用3周后用Dox处理的表达小鼠。图形数据表示为平均值±SEM。

此外，我们想确定在L188Q中博莱霉素治疗后3周的肺力学是否不同香港证监会老鼠。我们发现WT小鼠和L188Q小鼠的静态肺顺应性均降低香港证监会用博莱霉素治疗的小鼠与其相应的盐处理对照组进行比较。在博来霉素治疗组中，L188Q的静态肺顺应性进一步降低香港证监会小鼠与WT对照组的比较(图3G公司). 在没有博莱霉素的情况下，两组的静态肺顺应性没有差异。

虽然我们的发现表明L188Q具有促纤维化作用香港证监会表达，我们想知道转基因表达的影响是否受到相对较低的突变率的限制香港证监会表达与内源性基因比较。因此，我们跨越了188Q香港证监会老鼠和老鼠使用人类香港证监会启动子（hSFTPC.rtTA）(18)希望增加突变L188Q pro-SP-C的表达。突变体pro-SP-C的Dox诱导mRNA表达确实增加了约三倍(图S5A类)，但小鼠没有发生自发性纤维化，博莱霉素治疗后的肺纤维化在突变型L188Q之间没有差异香港证监会携带或不携带hSFTPC.rtTA的小鼠(图S5B类). 这些研究表明，转基因表达水平不是决定L188Q表型的限制因素香港证监会-表达小鼠。

L188Q的表达香港证监会博莱霉素治疗后增加AEC凋亡。

因为高水平的内质网应激与上皮细胞凋亡增加有关(6,7,19)，我们想确定L188Q中的ER应力香港证监会小鼠AEC凋亡增加。在缺乏博莱霉素的情况下，在Dox治疗的L188Q中，TUNEL+AEC罕见香港证监会与WT同窝鼠相比，和的小鼠数量相似。我们之前已经证明，肺中TUNEL+上皮细胞的数量在静脉注射博莱霉素后1周达到峰值(17). 此时，L188Q的肺切片香港证监会与WT对照组相比，小鼠的TUNEL+AECs数量更多(图4A类–C类)，表明AEC凋亡增加。该发现表明L188Q中的AEC香港证监会小鼠更容易受到博莱霉素诱导的损伤。此外，活性caspase-3在L188Q的肺部表达增加香港证监会小鼠与WT对照组的比较(图4D类和电子)，表明在该模型中，caspase依赖性细胞死亡途径在内质网应激的存在下被选择性激活。内质网应激通过激活小鼠内质网结合的caspase-12（人类的caspase-4）与细胞凋亡有关(20,21). 通过全肺裂解物的Western blot分析，我们发现在L188Q中caspase-12表达增加香港证监会博莱霉素治疗后1周的小鼠与WT对照组的比较(图4F类和G公司). 通过CCAAT/增强子结合蛋白同源转录因子（CHOP）的表达介导的细胞凋亡也与内质网应激有关(22)，但我们没有发现模型中CHOP表达增加。

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表达L188Q的小鼠SPTPC公司静脉注射博莱霉素后AEC死亡更严重。(A类和B类)WT经TUNEL染色的肺切片(A类)和L188Q香港证监会(B类)小鼠腹腔注射博莱霉素后1周。箭头指向具有代表性的TUNEL+单元。（放大倍率：×600。）(C类)WT和L188Q肺切片TUNEL+AECs的半定量评估香港证监会小鼠腹腔注射博莱霉素后1周。(n个=每组8-11人*P（P）组间<0.05。）(D类和电子)蛋白质印迹分析(D类)和密度测定(电子)使用博莱霉素处理的WT和L188Q的全肺裂解物检测caspase-3香港证监会老鼠。β-肌动蛋白作为负荷对照。图形数据表示活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和总半胱氨酸蛋白酶-3的带密度之比（WT归一化为1）。(n个=每组5人*P（P）与WT相比<0.05）(F类和G公司)蛋白质印迹分析(F类)和密度测定(G公司)从肺裂解物中提取caspase-12。图形数据表示针对β-肌动蛋白调整的caspase-12的带密度（WT归一化为值1）。(n个=每组5人*P（P）与WT相比<0.05。）图形数据表示为平均值±SEM。

有趣的是，我们发现博莱霉素治疗后1周，野生型小鼠肺中BiP mRNA表达和XBP1剪接增加(图S6). 此外，BiP在L188Q肺中的表达进一步增加香港证监会尽管XBP1剪接没有改变，但除Dox外，用博莱霉素治疗的小鼠。总之，这些发现表明博来霉素本身在肺部诱导内质网应激，可能对该模型的病理性肺重塑有贡献。

接下来，我们询问L188Q是否香港证监会博莱霉素治疗后，小鼠的肺部炎症发生了改变。博莱霉素治疗后1周，L188Q香港证监会在支气管肺泡灌洗中，WT小鼠的总细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞相似(图5A类). 为了进一步评估肺部的炎症信号，我们跨越了L188Q香港证监会小鼠转为NF-κB/GFP/荧光素酶（NGL）报告小鼠。NGL报告小鼠表达荧光素酶作为NF-κB活化的功能，提供炎症途径活化的替代读数(23). 仅Dox，WT/NGL和L188Q均不适用香港证监会/NGL小鼠的荧光素酶表达高于基线水平，两组之间的值相似。博来霉素治疗后，两组中萤光素酶的表达增加相似(图5B类和图S7). 此外，WT/NGL和L188Q之间的全肺荧光素酶水平相似香港证监会/单用Dox 14天后的NGL小鼠（23.4±22.5 vs.22.5±11.7相对光单位/μg/μL）和Dox+博莱霉素14天后的小鼠（285.7±53.4 vs.297.3±58.7相对光单位每μg/微升）。因此，我们在L188Q中没有发现博莱霉素诱导的炎症差异的证据香港证监会-表达小鼠。

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突变体L188Q香港证监会注射博来霉素（Bleo）后，表达不会增强肺部炎症。(A类)WT和L188Q支气管肺泡灌洗（BAL）中的细胞总数和差异香港证监会小鼠腹腔注射博莱霉素后1周。(n个=每组5-6个）。(B类)胸部生物发光成像作为WT和L188Q肺部NF-κB活化的指示物香港证监会小鼠与NGL小鼠杂交。基线光子计数代表Dox治疗14天的小鼠。随后，用博莱霉素治疗小鼠，并在第3天和第7天成像。在腹腔注射荧光素（1 mg）后进行光子计数。(n个=每组4个。）图形数据表示为平均值±SEM。

通霉素诱导内质网应激增强博莱霉素诱导的肺纤维化。

虽然我们的数据表明ER压力是L188Q的潜在过程香港证监会表达有助于肺纤维化，我们试图确定其他方式诱导的内质网应激是否会导致类似表型。在内质网应激诱导剂中，衣霉素是一种通过阻断诱导内质网紧张的抗生素N个-连接蛋白糖基化，是最常用的(24). 我们给WT（C57BL/6J背景）小鼠静脉注射衣霉素（20μg/mL，100μL，20%二甲基亚砜，PBS稀释）。2天后采集的肺切片上的IHC显示，衣霉素治疗后AECs中BiP和XBP1的诱导最为显著(图S8A–D). Tunicamycin还诱导全肺样本中BiP蛋白和mRNA的表达以及XBP1 mRNA的剪接(图S8E–H（E–H）). 与L188Q相同香港证监会在单次剂量的衣霉素给药3周后或每周两次的衣霉素给药3周后，没有肺纤维化或结构变化的证据。然后我们测试了衣霉素与博莱霉素的联合治疗。WT小鼠接受i.t.衣霉素（或溶媒对照），48小时后接受i.t.博来霉素（0.04单位）。注射博莱霉素后2周，衣霉素+博莱霉素组的肺纤维化程度明显高于载体+博莱霉素组(图6A类–D类). 因此，膜霉素诱导的内质网应激导致与L188Q相似的纤维化前表型香港证监会模型，有力支持内质网应激促进肺纤维化的观点。

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膜霉素（TM）增强博莱霉素（Bleo）诱导的肺纤维化。(A类和B类)单次静脉注射载体（DMSO；A类)或衣霉素(B类)博莱霉素前48h。（放大倍率：×100。）(C类)在i.t.博莱霉素后2周，将暴露于载药+博莱霉素（载药+Bleo）和衣霉素+博莱霉素（TM+Bleo）的小鼠经毛染色的肺切片进行半定量纤维化评分。(n个=每组5-6人*P（P）组间<0.05。）(D类)经静脉注射生理盐水或博莱霉素后，暴露于媒剂或衣霉素的小鼠整个右肺的总胶原蛋白含量。(n个=生理盐水组5个，博莱霉素组7-10个*P（P）与其他组相比<0.05。）图形数据表示为平均值±SEM。

讨论

IPF肺活检评估揭示了纤维化区域AEC内质网应激的证据(6,8)，但内质网应激对疾病发病机制的作用程度尚不明确。尽管香港证监会突变相关间质性肺病在广泛的IPF中很少见(25)，对这种突变进行建模可以作为更好地理解IPF和内质网应激作用的范例。通过这些研究，我们发现突变体L188Q的表达香港证监会导致体内II型AEC中的内质网应激，导致易受博莱霉素影响的II型AECs人群。带有L188Q的表达式香港证监会以及由此产生的内质网应激，博莱霉素治疗后AECs更容易凋亡，观察到更多的肺成纤维细胞，这些发现可以解释突变型L188Q的纤维化增强香港证监会老鼠。此外，给药衣霉素时观察到类似的表型，这一事实提供了一个证实模型，即肺泡上皮中的内质网应激使该细胞群容易受到更大的损伤，从而导致纤维化加剧。

儿童和成人间质性肺病的多个病例与香港证监会突变(4,25–29)包括一个突变报告，该突变删除了外显子4及其37个aa(香港证监会Δ外显子4突变）(26)这里分析了L188Q突变(4). 这两种突变都已在体外进行了分析，表明这些突变前SP-C形式的表达导致内质网中的蛋白质积累、内质网应激、UPR激活，并通过激活内质网相关caspase-12/4增加细胞凋亡(6,7,19). 在对香港证监会体内突变，Bridges等人设计了一种表达突变基因的转基因小鼠香港证监会Δ外显子4在人类下面香港证监会启动子，在胚胎发生期间表达，导致内质网应激和宫内致死(30). 虽然我们的模型中转基因表达仅限于成年期，并绕过了对肺发育的影响问题，但很可能香港证监会Δ外显子4突变比L188Q突变更严重，因为具有这种突变的患者在儿童早期只会出现间质性肺疾病。

随着内质网中蛋白质的积累，UPR通路被激活，试图控制内质网应激并保护细胞(11). UPR有三条主要途径由三种ER跨膜蛋白控制：IRE1、激活转录因子6（ATF6）和PKR-like ER激酶（PERK）(11). 在没有内质网应力的情况下，由于BiP的结合，这些传感器保持在非活动状态。随着内质网应激，BiP被释放，作为折叠伴侣，允许激活每个传感器(31). IRE1激活使其固有的核酸内切酶活性将XBP1剪接到其活性状态，导致UPR介导的蛋白质降解酶的表达，如ER降解增强型α-甘露糖苷酶样蛋白（EDEM）和伴侣蛋白(12). ATF6激活导致蛋白折叠伴侣蛋白（如BiP）上调(32)以及XBP1的增加表达(12). PERK的激活导致磷酸化真核细胞起始因子2α（p-eIF2α）依赖性蛋白质翻译的整体衰减以及氧化还原和代谢蛋白的ATF4依赖性表达(33). 这三种UPR途径共同设计用于减轻内质网应激。然而，当内质网应激严重或持续时，UPR机制可导致细胞凋亡途径的激活(11). 内质网应激可通过CHOP/GADD153的诱导、caspase-12/4的激活和eIF2α的磷酸化触发细胞凋亡。在我们对L188Q的研究中香港证监会患有IPF的小鼠和人类(6)，我们尚未发现p-eIF2α增加。此外，我们没有发现CHOP上调。然而，我们确实注意到突变株L188Q经博莱霉素治疗后肺中caspase-12水平增加香港证监会小鼠与同窝对照组的比较。ER结合的caspase-12（及其人类同源物casapse-4）与ER应激诱导的凋亡有关(20,21). Mulugeta等人之前的研究详细说明了香港证监会包括L188Q，导致体外caspase-4介导的caspase-3激活和细胞凋亡(7)这一发现补充了我们体内模型的结果。AEC凋亡与人类IPF肺活检样本中的纤维化有关(34)在动物模型中(35)包括Sisson等人最近的一项研究，其中通过香港证监会启动子导致Ⅱ型AEC凋亡和肺纤维化(36). 因此，凋亡增加可能是L188Q过度纤维化的机制之一香港证监会老鼠。

在我们的模型中，L188Q的表达式香港证监会而用衣霉素治疗可诱导内质网应激，但不会导致纤维化重塑，这表明小鼠II型AECs能够管理UPR反应而无明显病理改变。相反，内质网应激可能会使II型AEC人群处于脆弱状态，在这种状态下，第二种刺激物（在本例中为博莱霉素）发挥显著作用，导致肺纤维化加剧。鉴于FIP患者，包括许多患有香港证监会突变，经常出现在成年期的间质性肺病中，可以推断可能需要“第二次打击”才能在高危个体中诱发临床疾病。在FIP（和零星IPF）中，相关的有害刺激可能是由环境暴露引起的，但目前尚不清楚该药剂的性质。迄今为止，只有吸烟史和肺部疱疹病毒抗原的存在与FIP的临床疾病相关。希望未来的L188Q研究香港证监会-表达经过相关环境刺激处理的小鼠或其他基因模型将有助于阐明可能导致肺纤维化的二次打击。

总之，我们的研究表明，在实验模型中，AEC中的内质网应激会使肺更容易受到损伤和纤维化。这些发现提供了机制信息，支持内质网应激在疾病发病机制中的重要作用，内质网紧张在IPF患者的肺部表现突出。内质网应激和下游UPR通路可能成为这一毁灭性肺病未来干预的治疗靶点。

材料和方法

转基因小鼠。

生成转基因突变体L188Q香港证监会范德比尔特转基因/ES共享资源设施共注入了三种结构体(图S1): (我)（tet-O）7–188Q码香港证监会-我的名字(ii（ii）)mSFTPC.rtTA和(三)mSFTPC.tTS公司(37). 从Jackson实验室获得在人SFTPC启动子（hSFTPC.rtTA）下表达rtTA的转基因小鼠。NGL小鼠在驱动GFP/荧光素酶构建的HSV最小胸腺嘧啶激酶启动子上游具有一致的NF-κB结合位点，已在前面进行了描述(23). 所有小鼠均为C57BL/6J背景，在8-10周龄时进入实验。所有小鼠实验均由范德比尔特动物保护和使用机构委员会批准。

动物模型和药物管理。

如前所述，通过插管向小鼠体内注射博莱霉素（0.04单位）（贝德福德实验室）(17). 如前所述，采集肺部进行组织学检查、冷冻组织、支气管肺泡灌洗或细胞分离(14–17). 188平方米香港证监会小鼠和对照组在正常水上随意维持，直到需要转基因激活。然后，在无菌水（2 g/dL，外加2%蔗糖）中给小鼠注射Dox（Sigma-Aldrich）。

将管霉素（Sigma）溶解在DMSO中，并在PBS中稀释的20%DMSO中将其稀释至20μg/mL，然后通过i.t.插管将100μL溶液输送至小鼠。将体积相近的20%二甲基亚砜稀释在PBS中用作载药对照。

肺样本处理和分析。

如前所述制备福尔马林固定肺切片(14–16). 国际控股公司(14,15)，免疫荧光(16,17)、隧道(15,17)支气管肺泡灌洗和细胞计数(15,17)如前所述执行。使用标准技术（详见SI材料和方法).

细胞培养/分离。

按照制造商的说明，使用效应基因转染试剂盒（Qiagen）将质粒转染到A549细胞中。将细胞与转染复合物在正常生长条件下孵育4小时，然后向培养基中加入0.5–1.0μg/mL Dox。24小时后，收集细胞进行Western blot分析。如前所述，隔离II型AEC(14,16).

体内生物发光和荧光素酶测量。

在i.p.注射荧光素（100μL生理盐水中的1 mg）后进行活体生物发光成像，并如前所述测定全肺组织荧光素酶水平(23).

气道阻力和顺应性测量。

为了进行气道阻力和顺应性测量，用静脉注射戊巴比妥麻醉小鼠，用20号金属短管适配器插管气管。将每只小鼠置于小型动物呼吸机flexiVent（SCIREQ）上，每分钟呼吸150次，潮气量为10 mL/kg体重。气道阻力（H的厘米2O/mL/s）和静态肺顺应性（使用2秒的呼吸暂停）（H的mL/cm2O） 由制造商的软件确定。

半定量评分和胶原蛋白含量。

肺纤维化评分(15,17)，成纤维细胞(15)和TUNEL染色(9)羟脯氨酸法测定胶原蛋白含量(38)如前所述执行。

统计学。

使用InStat（GraphPad软件）进行统计分析。用单因素方差分析评估各组之间的差异，用Student’st吨测试。结果显示为平均值±SEM。P（P）值<0.05被认为是显著的。

详细方法见SI材料和方法.

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢Linda A.Gleaves和Frank B.McMahon在组织学核心实验室的工作，以及Vanderbilt转基因/ES共享资源设施对L188Q生成的帮助香港证监会老鼠。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/lookup/supl/doi:10.1073/pnas.1107559108/-/DC补充.

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院