microRNA-29a在肝星状细胞Farnesoid X受体抗纤维化作用中的作用^S⃞

动物和HSC隔离。

退休雄性Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6小鼠来自Charles River Laboratories（马萨诸塞州威明顿）。外汇储备（−/−）小鼠(Sinal等人，2000年)从杰克逊实验室（马萨诸塞州巴尔港）购买，并在匹兹堡大学（宾夕法尼亚州匹兹堡）中央动物设施饲养。如前所述，通过原位蛋白酶/胶原酶灌注和密度梯度离心分离HSC(Thirunavukkarasu等人，2005年). 原代细胞纯度大于95%。细胞在含有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基中的标准组织培养塑料皿上生长。HSC活化后培养7天。所有研究均符合实验动物的护理和使用指南(实验动物资源研究所，1996年).

LX-2是一种永生化人类肝星状细胞系，由Scott L.Friedman博士（纽约州纽约市西奈山医学院）提供(Xu等人，2005年). 细胞保存在含有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基中。

实时聚合酶链反应。

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA，并使用SuperScript III逆转录酶（Invit罗gen）合成第一链cDNA。通过使用基于SYBR的绿色检测和ABI 7300实时PCR系统（Applied Biosystems），对大鼠、小鼠和人纤维瘤相关基因和miR-29前体进行实时聚合酶链反应（PCR）分析(Li等人，2008年). 转录物丰度标准化为β-葡萄糖醛酸酶表达，表示为校准样品的倍数增加。

为了检测成熟miRNA，根据制造商的协议，使用miScript逆转录酶试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）将总RNA逆转录成cDNA。在定量PCR机器（Applied Biosystems）上，使用miScript SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）和miRNA-specific引物（QIAGE）对cDNA样本（2μl）进行实时PCR，总体积为25μl。补充表1和表2中显示了所有反转录（RT）-PCR分析的引物序列。

Western Blot分析。

如前所述进行蛋白质提取和Western blot分析(Li等人，2008年). FXR抗体和胶原1A1（COL1A1）抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯）。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和增强化学发光试剂盒购自GE Healthcare（英国白金汉郡Chalfont St.Giles）。

质粒构建。

人类5′-侧翼序列1.98kb片段miR-29利用引物5-′cgacgcgtgtggtaaggaggaggag-3′和5′-cgacgctgtgctgactgatgaggaa-3′从人类基因组DNA中扩增出一个基因，并克隆到pGL3-basic载体（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）的MluI中。类似地，通过克隆一个5′-侧翼序列1.87 kb的片段，产生了一个缺失假定IR-1（miR-29a/IR-1）结合位点的突变结构体miR-29利用引物5′-cgacgcgtctggtgttcgcgcttcac-3′和5′-cga cggtgctgactgagagaaaa-3′扩增出一个基因。含有三个拷贝的miR-29a/IR-1序列的TK-Luc构建体是通过退火寡核苷酸5′-agcttccggaggtcacacacccgaggtcaccgcgttg-3′和5′-caacgaggtctcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtcgaggtctc-消化的TK-Luc。用于miR-29a，3′-UTR片段的功能分析，该片段包含miR-29a结合序列或不包含第1列，胶原蛋白3A1(COL3A1系列)和弹性蛋白-1(ELN1型)使用相应的正向和反向引物从人类基因组DNA中对基因进行PCR扩增（补充表1）。然后将PCR产物亚克隆到pMIR-REPORT萤火虫荧光素酶报告载体（Ambion，Austin，TX）中终止密码子下游的SacI-MluI位点。

转染试验。

正常猴肾成纤维细胞（CV-1系）在48周的培养板中生长到60-70%的汇合处。在存在或不存在pCMX-vpFXR或pCMX-FXR的情况下，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和pGL3-miR-29a瞬时转染细胞。添加pCMX以确保每个孔中的DNA数量相同。通过共转染pCMV-βgal质粒监测转染效率。20小时后，用GW4064或DMSO载体处理细胞。在GW4064处理24小时后制备细胞提取物，按照前面所述进行荧光素酶和β-半乳糖苷酶分析(He等人，2006年)荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性标准化。转染实验至少进行了三次，在每种情况下，实验一式三份。数据表示为报告基因单独的折叠诱导。

在另一项研究中，在miR-29a模拟物或非特异性对照miRNA模拟物存在下，用pMIR-COL1A1-3′-UTR、pMIR-COL3A1-3′-UTRs或pMIR-ELN1-3′-UTR转染CV-1细胞。转染24小时后，按照上述方法对报告人的表达进行类似的检测。

电泳迁移率变化分析。

通过体外转录/翻译（Tn个T系统；Promega）与pCMX-FXR和pCMX-RXR质粒。DNA探针miR-29a/IR-1（5′-gaagaggtcacacct公司ctgg-3′）来源于人类miR-29a启动子的一个区域，该区域包含一个假定的FXR反应元件（粗体）。它被标记为[γ-³²P] 用DNA聚合酶Klenow片段检测ATP。DNA结合反应如下：将等分的体外翻译混合物培养在含有2μg聚（dI-dC）（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）和6至20×10^三DNA探针在室温下cpm 20 min。对于超移分析，添加0.2μg兔抗FXR IgG，并将样品再培养10 min。然后将结合混合物涂敷在5%聚丙烯酰胺凝胶（0.5×Tris硼酸盐-EDTA缓冲液）上进行电泳。干燥凝胶并在−80°C下暴露以进行放射自显影。

染色质免疫沉淀分析。

根据制造商的说明，使用ChIP分析试剂盒（Millipore Corporation，Billerica，MA）进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析。用1μM GW4064处理LX-2细胞24小时，制备可溶性染色质。染色质用针对FXR的抗体（2μg）免疫沉淀。使用覆盖miRNA-29a启动子中IR-1共有序列的引物对PCR扩增最终的DNA提取，如下所示：正向，5′-GTGGGGTAAGGAGGGAAG-3′；反义，5′-ACATTGCCTTCCCCAAAG-3′。

GW4064治疗导致大鼠和小鼠HSC miR-29a上调。

在证明GW4064抑制了几个ECM基因的mRNA表达后，我们继续探索潜在的相关机制。我们假设miRNA可能参与其中，因为一组ECM相关基因受到GW4064治疗的影响。使用多种算法筛选可能参与ECM调控的miRNA，包括MicroCosm靶点(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl)，目标扫描(http://www.targetscan.org/)和目标可达性交互概率（PITA；Lewis等人，2003年;Xin等人，2009年;Dong等人，2010年). miR-29家族的成员，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，被所有三个项目鉴定为ECM靶向miRNA的最佳候选者（补充表4）。作为研究miR-29a在GW4064介导效应中的潜在作用的第一步，我们检查了miR-29a的表达是否受GW4064的调节。图2A表明GW4064处理导致miR-29通过miR-29a前体的实时RT-PCR分析评估的基因。在LX-2细胞（永生化人肝星状细胞系）中也观察到GW4064对miR-29a表达的类似诱导(图2B） 和从野生型小鼠分离的HSC(图2C） ●●●●。然而，在制备的HSC中未观察到miR-29a的诱导作用外汇储备（−/−）小鼠(图2D） 这表明GW4064诱导miR-29a是由FXR介导的。有趣的是，GW4064治疗对大鼠和小鼠HSC中miR-29b或miR-29c的表达没有影响（补充图2）。通过对成熟miR-29a进行RT-PCR分析来检测miR-29a的表达时，也得到了类似的结果（数据未显示）。口服GW4064后，还观察到小鼠肝脏中miR-29a的诱导（补充图3）。

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图2。

GW4064治疗导致HSC中miR-29a表达上调。用GW4064或DMSO载体处理大鼠HSC（A）或LX2细胞（B）。治疗24小时后通过实时RT-PCR检测miR-29a的表达水平。GW4064对miR-29a表达的影响在从野生型小鼠（C）或外汇储备（−/−）小鼠（D）。n个= 3; *,P（P）<0.05（与DMSO相比）。

miR-29a负调控HSC中ECM的表达。

在证明GW4064诱导miR-29a后，我们检测了miR-29a-过表达对HSC中几个ECM基因表达的影响，以确定miR-29a.在GW4064/FXR-介导的抗纤维化作用中的作用。用miR-29a模拟物、对照序列或miR-29a抑制剂转染HSC，24小时后检测几个ECM基因的mRNA表达。如所示图3miR-29a模拟物在HSC中的过度表达导致所有六个ECM基因的mRNA表达受到显著抑制。与对照序列处理的细胞相比，用miR-29a抑制剂处理的HSC中观察到较高水平的ECM mRNA。这一结果可能是由于内源性miR-29a受到抑制，后者参与ECM表达基础水平的控制。miR-29a的作用似乎是靶序列特异性的，因为在广泛的浓度范围内，它对mRNA和蛋白质水平的FXR和SHP表达没有影响（补充图4和5）。miR-29a治疗对GW4064介导的SHP表达诱导也没有影响，这表明在miR-29a-治疗的HSC中FXR的功能得到了很好的保留（补充图6）。相反，miR-29a以剂量依赖的方式抑制了COL1A1在mRNA和蛋白质水平的表达（补充图4和5）。

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图3。

miR-29a的过度表达导致大鼠HSC中ECM基因的mRNA表达下调。用miR-29a模拟物、非特异性对照miRNA模拟物或miR-29a-抑制剂（6孔板中25 pmol/孔，10μl脂质体）转染HSC 24 h。然后通过实时RT-PCR测定几个ECM基因的mRNA表达水平。n个= 3; *,P（P）<0.05（与对照miRNA相比）。

为了确定miR-29a在ECM表达调控中的作用，我们检测了miR-29a对几个报告结构表达的影响，这些报告结构分别包含来自第1列,COL3A1系列、和ELN1型基因。根据TargetScan算法的分析，所有三个3′-UTR都包含假定的miR-29a靶序列。如所示图4A、 用miR-29a模拟物转染细胞可显著抑制带有完整COL1A1 3′-UTR的报告构建物的表达。对于缺少miR-29a靶序列的突变报告基因构建体，这种抑制作用完全丧失。这些结果表明，报告结构的COL1A1 3′-UTR中存在miRNA靶位点是miR-29a抑制的必要条件。在任何一种具有3′-UTR的构建物中观察到类似的结果COL3A1系列或ELN1型基因(图4、B和C）。

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图4。

miR-29a通过靶向其mRNA的3′-UTR调节ECM基因的表达。在miR-29a模拟物或非特异性对照miRNA模拟物存在的情况下，用荧光素酶构建物转染CV-1细胞，其中含有Col1A1-3′-UTR（a）、Col3A1-3′-UTR（B）或ELN-3′-UTR-（C）。在转染后24小时进行萤光素酶测定。面板中显示的数据表示三次分析的平均值（S.D.）。n个= 3; *,P（P）<0.05（与对照miRNA相比）。