异染色质是高等真核生物基因组中的一个神秘成分。异染色质中基因的缺乏和重复序列的丰富导致其被描述为功能惰性。然而，异染色质含有重要的单拷贝基因(Liu等人，1998年)和rDNA位点，基因组中转录率最高的基因（有关综述，请参阅威廉姆斯和罗宾斯1992). 此外，着丝粒——有丝分裂和减数分裂过程中动粒形成、纺锤体附着和检查点控制的位点——通常深埋在异染色质中。对多种生物的精细研究(戈代和皮皮内利1989;Bass等人，1997年)表明异染色质在染色体遗传中起着其他重要作用。例如，在雄性和雌性减数分裂期间，异染色质同源性是可靠同源配对和染色体分离所必需的果蝇属(McKee和Karpen 1990年;Dernburg等人，1996b;Karpen等人，1996年).
异染色质可以沉默常染色质中常见的基因表达，导致一种称为位置效应杂色（PEV）的现象。PEV表现为受影响基因座的镶嵌或杂色表达，这是由于其异常并置的近中心异染色质或端粒（有关综述，请参阅Wallrath 1998年). 杂色基因周围染色质结构的变化激发了这样一种假设，即PEV是由异色状态扩散到常染色质邻近区域引起的（有关综述，请参阅Wakimoto 1998年). 然而，当异色结合在染色体的核组织中产生大规模改变时，也会发生PEV。例如，一大块异染色质插入果蝇棕(体重)基因导致同源配对正常拷贝的定位错误体重含有中心异染色质的核区域的位点(Csink和Henikoff，1996年;Dernburg等人，1996a). 类似地，哺乳动物B淋巴细胞中淋巴相关基因的沉默与包含中心异染色质的间期细胞核区域中Ikaros蛋白的关联有关(Brown等人，1997年). 这些观察结果挑战了杂色基因表达只是由顺式-异色态的扩散，并证明核组织也有助于PEV(韦勒和瓦基莫托1995).
改变异染色质诱导的基因沉默的位点可能编码控制正常异染色素功能的染色体蛋白质。一百个或更多果蝇属预测基因会修饰PEV在trans中（PEV抑制器和增强剂，或Su（变量）s和E（变量）秒(路透社和沃尔夫1981;Sinclair等人1989). PEV的修饰物是否编码也有助于染色体遗传的蛋白质？沉默基因座与染色体遗传相关的最强数据来自裂变酵母葡萄裂殖酵母.三个基因(瑞士文6，Clr4、和风险1)最初从缓解沉默的突变中鉴定出的基因编码染色体遗传所必需的着丝粒相关蛋白(Allshire等人，1995年). 少量果蝇属PEV修饰物与染色体遗传功能有关(葡萄酒和海尼科夫1992;凯勒姆和阿尔伯茨1995;Fanti等人，1998年)包括异染色质蛋白1，该蛋白可促进胚胎中染色体的准确分离，并可防止二倍体细胞中的端粒融合(凯勒姆和阿尔伯茨1995;Fanti等人，1998年). 有趣的是，SUV39H1，一种人类同源的果蝇属SU（VAR）3-9和S.pombe公司CLR4蛋白结合人类中期染色体上的着丝粒区域。SUV39H1过表达分析和组蛋白甲基转移酶活性表明在组装异色结构中起作用(Melcher等人，2000年;Rea等人，2000年). 尽管如此，PEV修饰物和异染色质介导的遗传功能之间的联系在很大程度上仍未被探索；迄今为止，对于任何多细胞真核生物，还没有关于PEV修饰物与遗传关系的全面研究报告。
我们设计了一种筛选方法果蝇属PEV系统修饰物在染色体遗传中的作用。J21A型，一个大型收藏Dp（1；f）1187(第1187页)微小染色体缺失衍生物的总尺寸大大缩小，仅包含正常着丝粒功能所需的三分之二的DNA序列(Murphy和Karpen 1995年b;Sun等人，1997年). 以前的研究表明J21A型传播主要受遗传所需的许多基因突变的影响，而正常染色体的遗传不受影响。J21A型遗传对涉及遗传不同方面的基因剂量减少敏感，包括纺锤体成分、反作用力、凝聚、复制、姐妹染色单体凝聚力和整体染色体结构(Murphy和Karpen 1995a;Cook等人，1997年;Lopez等人，2000年;Dobie等人，2001年).J21A型已被用于筛查新突变对传播的显性影响，绕过了非整倍体诱导的致死性，而非整倍性诱导的致死是在筛查影响内源性染色体遗传的隐性突变时可能导致的(Dobie等人，2001年). 我们最近证明Su（变量）和E（变量）突变主要改变J21A型这表明很大一部分PEV修饰基因座会影响染色体遗传（H.Le、K.Donaldson、K.Cook和G.Karpen，预备）。这里我们描述了在这个屏幕上识别的一个基因座的克隆和特征，Su（变量）2-10。我们证明了这一点Su（变量）2-10是正确的染色体结构和染色体遗传所必需的。此外，我们提供的蛋白质定位数据和细胞学分析表明Su（变量）2-10通过在细胞核内建立和/或维持间期染色体组织，控制染色体结构和功能以及其他细胞任务。
结果
Su（var）2-10突变导致致敏小染色体传递显著减少
Su（变量）2-10在PEV修饰物对致敏物传播的显性效应先导筛选中，被确定为候选染色体遗传位点第1187页微小染色体衍生物，J21A型（H.Le、K.Donaldson、K.Cook和G.Karpen正在准备中）。J21A型与正常的全长微小染色体50%的单体传递相比，双亲到后代的单体传播减少（27%）(墨菲和卡彭1995b).Su（变量）2-101和Su（变量）2-102导致显性合子和母体减少J21A型变速箱。如表所示,Su（变量）2-10突变在J21A型传输时Su（变量）2-10突变是从父亲那里遗传的（表，左栏，无转基因，第3行和第5行）。什么时候？Su（变量）2-101或Su（变量）2-102是从杂合子母亲遗传来的，合子和母亲的缺陷结合起来可以减少J21A型传输水平分别为7%和8%（表，左栏，无转基因，第2行和第4行）。以前的统计分析确定J21A型<22%或>37%的传播率差异显著(第页 < 0.05）从正常的27%(Dobie等人，2001年). 这些数据表明Su（变量）2-10在母体RNA被利用的早期发育阶段需要，在需要合子转录的后期发育阶段也需要。令人惊讶的是，提高了Su（变量）2-10+使用转基因复制三份（表，右栏，含转基因，第1行）也减少了J21A型传播，表明细胞对Su（变量）2-10产品。
表1
J21A型微小染色体传播率Su（变量）2-10杂合女性
基因型
| −转基因一（%±SD）
| +转基因一（%±标准差）
|
|---|
| +/+ | 27±12 | 14 ± 9 |
| Su（变量）2-101/+ | 7 ± 5 | 10 ± 7 |
| Su（变量）2-101/+ b条 | 20 ± 10 | 30 ± 13 |
| Su（变量）2-102/+ | 8 ± 4 | 23 ± 8 |
| Su（变量）2-102/+ b条 | 16 ± 9 | 25 ± 14 |
Su（var）2-10对内源性染色体的遗传至关重要
来自缺陷定位和致命性拯救实验的数据表明，沿着Su（变量）2-101和Su（变量）2-102染色体。确定是否Su（变量）2-10是生存能力所必需的，我们研究了Su（变量）2-101/Su（变量）2-102和Su（变量）2-102/Su（变量）2-10Pex74a公司反式-杂合动物。[Su（变量）2-10Pex74a型是编码区域的删除；参见补充材料网址：www.genesdev.org]这些突变动物以晚期幼虫和早期蛹的形式死亡Su（变量）2-101/Su（变量）2-102幼虫有黑色素瘤（图。A） ●●●●。
中的染色体结构和功能缺陷Su（变量）2-10纯合子。(A类)黑色素瘤在纯合的三英寸幼虫中可见(正确的侧面），但不是杂合子幼虫(左边侧面）。(B类)唾液腺细胞核突变(正确的与野生型细胞核相比，（panel）明显更小，并且含有不规则的多线染色体(左边面板）。请注意，突变细胞核中没有条带。棒材，5μm。(C类–J型)DAPI染色的幼虫成神经细胞有丝分裂染色体制剂。顶部面板为中期(C类–F类)，底部面板处于后期(G公司–J型).C类和G公司是控件，其余是Su（var）2-10反式-杂合子（见材料和方法）。注意染色体异常凝集D类—F类以及异常的种族隔离(H（H）)，染色体片段(一、 箭头)和后期桥梁(J、 箭头)在突变细胞中。所有有丝分裂像的放大倍数为1250×。
是Su（变量）2-10对所有染色体的遗传都是必需的，或者这种效应是微染色体特异性的？死亡后期Su（var）2-10反式-杂合子使我们能够检测突变三龄幼虫的有丝分裂活性神经母细胞组织。表达绿色荧光蛋白的平衡染色体用于区分Su（变量）2-101/Su（变量）2-102来自兄弟姐妹的幼虫。染色体的结构和功能Su（变量）2-10突变体在男性和女性中都非常异常。观察到两种主要类型的染色体缺陷：中期异常浓缩的染色体（图。D–F）和后期染色体异常分离（图。G–J）。端粒融合，是另一种PEV修饰物突变体的特征，苏（var）2-5(Fanti等人，1998年)，在中未观察到Su（变量）2-10突变体。后期分离缺陷包括染色体断裂（箭头，图。一） 和桥接（箭头，图。J） 。有丝分裂缺陷的外显率对温度敏感（表)黑色素瘤突变幼虫的比例也随着温度的升高而增加（从25℃时的15%增加到28℃时的63%）。将正常凝集视为有丝分裂扩散中不同的姐妹染色单体的出现，我们发现在25°C下，对照组与突变成神经细胞相比，不适当凝集的中期略微增加，但具有统计学意义（分别为22%至35%；第页 < 0.002），但在28°C时有非常大的增加（18%对61%；第页 < 0.0001). 后期分离缺陷在Su（变量）2-10突变体(第页 < 0.0001），但未显示温度敏感性（25℃时为18%，28℃时为19%；表). 纯合子突变体显示的有丝分裂缺陷频率显著升高和隐性致死率表明Su（变量）2-10对所有染色体的正常遗传至关重要，而不仅仅是敏化的小染色体。
表2
| +/+
| Su（变量）2-101/Su（变量）2-102
|
|---|
25摄氏度
| 28摄氏度
| 25摄氏度
| 28摄氏度
|
|---|
| 有丝分裂指数 | 1.04 | 1.01 | 1.39 | 1.26 |
| 异常浓缩中期（%） | 22 | 18 | 35 | 61 |
| 异常后接（%） | 2 | 2 | 18 | 19 |
Su（var）2-10突变影响多烯染色体结构
许多果蝇属幼虫组织含有多烯细胞。这些间期细胞核在没有有丝分裂的情况下经历了多轮DNA复制，产生了适于高分辨率细胞学分析的大染色体。确定是否Su（变量）2-10控制染色体结构的一般方面，我们分析了来自对照组和Su（变量）2-102/Su（变量）2-10Pex74a公司三龄幼虫。对于Su（变量）2-101/Su（变量）2-102幼虫，尽管表型不太严重。突变的唾液腺体积缩小，正常多线染色体的一致带型被严重破坏。（图。B） ●●●●。对整个唾液腺细胞核的单个0.2μm光学切片的检查表明，多烯染色体通常是杂乱无章和异常浓缩的（右图，图。B） ●●●●。这些染色体结构缺陷不仅仅是由于细胞核尺寸减小造成的，因为较年轻野生型幼虫的细胞核大小相当，显示出正常的多烯染色体结构（数据未显示）。总之，Su（变量）2-10促进多线和二倍体细胞的染色体结构，并影响多线染色体的组织。
Su（var）2-10的分子表征
先前的研究绘制了Su（变量）2-10到2R染色体(Wustmann等人，1989年). 我们将致死表型缺陷映射到聚四氟乙烯区45A，并通过伯克利果蝇基因组计划（BDGP；Spradling等人，1999年). 一次插入，P（P）{PZ}1(2)0369703697，未能补足Su（变量）2-101和Su（变量）2-102致命性。精确切除P（P）{PZ}1(2)0369703697恢复了P插入的致死表型并补充了两者Su（变量）2-10致死性EMS等位基因。这些数据表明P（P）{PZ}1(2)0369703697是真正的等位基因Su（变量）2-10，我们称之为Su（变量）2-1003697.P型{PZ}1(2)0369703697插入到齐姆普(zi（字）数控手指控制，M（M）iz1，P（P）IAS3-like）转录单元(Mohr和Boswell 1999)，因其与已知蛋白质相似而得名（见下文），且不知道Su（变量）2-10.基于基因的Su（变量）2-10由于历史的优先性，这里将使用术语(路透社和沃尔夫1981). 我们确认了Su（变量）2-10通过检测不精确的P元件切除的结构和互补行为，通过识别编码区中的单碱基突变来编码该转录单元Su（变量）2-101和Su（变量）2-102以及通过转基因修复致死性、杂色和微小染色体传递缺陷（见表、材料和方法以及补充材料网址：www.genesdev.org).
SU（VAR）2-10是PIAS/Miz1/ARIP3蛋白家族的成员
cDNA和EST分析表明Su（变量）2-10选择性剪接以产生至少六个不同的转录本，其在动物中的存在已被Northern分析证实（数据未显示）。概念翻译Su（变量）2-10转录产物产生至少四种预测蛋白产物（522 aa、537 aa、554 aa和593 aa）。SU（VAR）2-10亚型在514-氨基酸结构域上是相同的，但其COOH末端不同。未来对转录物5′端选择性剪接的研究可能会发现其他亚型。蛋白质模体搜索显示所有SU（VAR）2-10亚型中都存在两个域：NH末端的SAP域2从aa 2到36的末端，这是在不同核蛋白中发现的一个假定的DNA结合域(Aravind和Koonin 2000)和一个从aaa 325到367的锌指。SU（VAR）2-10蛋白质与多种蛋白质高度同源，包括活化STAT（PIAS）家族蛋白抑制剂的成员，似乎参与转录调控（见下文；Chung等人，1997年;Liu等人，1998年).
SU（VAR）2-10蛋白定位于核质中，不集中在浓缩的有丝分裂染色体上
为了测试SU（VAR）2-10蛋白是否定位于染色体，产生了识别所有SU（VAR）2-10-亚型的抗体。亲和纯化抗体识别野生型胚胎0–12小时细胞质提取物中～60 kD的三联体，以及来自同一发育阶段的核提取物中的至少四条带，其分子量接近预测亚型的大小（图。A） ●●●●。
SU（VAR）2-10在三龄幼虫神经母细胞和S中的定位2细胞。(A类)亲和纯化抗SU（VAR）2-10的Western分析。这些抗体在0–12小时胚胎的细胞质提取物（cyto）中识别出三条不同的带，在同一发育阶段的核提取物（nuc）中至少识别出四条带。(B类–G公司)间接免疫荧光显示SU（VAR）2-10在有丝分裂细胞中的定位。绿色代表SU（VAR）2-10蛋白质，以及蓝色DAPI染色DNA。(B类–D类)在幼虫成神经细胞中，SU（VAR）2-10在中期不定位于染色体(C类)或后期(D类)，并且仅在间期核中突出(B类)在那里它被组织在核外围和许多核内点。棒材，5μm。(E类–G公司)S2细胞间期和中期细胞核的体积图。(E类)仅DNA(F类)仅SU（VAR）2-10，以及(G公司)合并后的图像。SU（VAR）2-10抗体染色间期细胞核，但不集中于中期染色体(F、 G公司). 注意间期细胞中的线状定位模式(插入在里面F类). 棒材，10μm。
我们检测了SU（VAR）2-10在不同细胞类型中的分布，包括早期胚胎、幼虫成神经细胞、S2组织培养细胞和多分化幼虫唾液腺。亚细胞定位因细胞周期的不同阶段而不同。在所有细胞类型的间期，SU（VAR）2-10蛋白均为细胞质和核，在核周附近和核质中有集中染色。例如，SU（VAR）2-10蛋白定位于间期成神经细胞的核外周，也观察到不同的核质灶（图。B） ●●●●。令人惊讶的是，SU（VAR）2-10蛋白没有定位于早期胚胎（数据未显示）或幼虫成神经细胞二倍体细胞核中的浓缩中期或后期染色体（图。C、 D）。同样，S2细胞的染色在间期以点状模式出现，中期染色体没有显示明显的SU（VAR）2-10浓度（图。E–G）。有趣的是，在较高的放大倍数下，SU（VAR）2-10的点状相间局部化模式表现为一个线状网络（插图，图。F） 但无法确定网络是否与DNA重叠或接触。有丝分裂染色体上没有SU（VAR）2-10抗体染色不太可能是染色过程中的伪影，因为两种不同的固定方案对幼虫成神经细胞组织产生了相同的结果（见材料和方法）。
考虑到纯合子突变体中显著的低凝聚和后期分离缺陷，令人惊讶的是SU（VAR）2-10蛋白主要存在于间期细胞中，而不是在有丝分裂染色体上的特定位置。可能是我们的抗体不识别SU（VAR）2-10的染色体结合亚型，可能是检测不到数量的SU（VAR）2-110与染色体结合，也可能是SU（VAR）2-10蛋白仅与我们分析的组织中的染色体短暂相关。无论如何，间期细胞核中靠近核边缘的核质染色和浓度表明SU（VAR）2-10蛋白在间期发挥重要的细胞功能。
为了进一步研究SU（VAR）2-10蛋白的间期分布，我们检测了幼虫唾液腺中的定位，与二倍体细胞相比，多倍体化可以更好地显示间期染色体形态。在双杂交试验（E.Andrulis和J.Lis，pers.comm.）中结合SU（VAR）2-10的GAGA转录激活物抗体作为染色程序的对照。图显示了单个的、去卷积的光学切片，这些切片来自单个的整个悬置核。正如预期的那样，抗GAGA因子抗体沿着多线染色体结合不同的位点（图。A） ●●●●。在这些相同的细胞核中，SU（VAR）2-10染色出现在细胞质中，更集中地定位在核质中（图。B） ●●●●。SU（VAR）2-10染色通常在特定染色体区域未发现（图。C） ；然而，染色体染色较弱。SU（VAR）2-10蛋白主要占据染色体间空间，染色强度沿染色体边缘较高。
SU（VAR）2-10与GAGA因子在整个幼虫唾液腺细胞核中不重叠。间接免疫荧光显示SU（VAR）2-10和GAGA因子在第三季幼虫的整个唾液腺细胞核中的定位。在所有面板中，绿色是抗SU（VAR）2-10染色，红色抗GAGA染色，以及蓝色DAPI染色DNA。(A类–C类)来自解卷积图像z系列堆栈中单个0.2微米光学部分的图像。GAGA因子与多线染色体上的离散位点结合(A类)，与抗SU（VAR）2-10染色不重叠(C类). SU（VAR）2-10主要存在于核质的染色体间隙和核周边附近，对染色体染色较弱(B类). 棒材，15μm。(D类–F类)SU（VAR）2-10和GAGA因子在全唾液腺细胞核中的定位Su（变量）2-101/Su（变量）2-102突变幼虫。(D类)突变细胞核中的细胞核缩小，染色体形态异常，但GAGA因子仍能以带状模式和DNA结合。(E类)SU（VAR）2-10染色在细胞质和细胞核中均减少。棒材，10μm。
在整个唾液腺细胞核中Su（变量）2-101/Su（变量）2-102突变幼虫（图。D–F），观察到SU（VAR）2-10的细胞质水平显著降低，并且在细胞核中几乎没有发现任何抗SU（VA）2-10染色（图。E） ●●●●。虽然这些细胞核中的染色体形态和组织被破坏，但GAGA因子继续以带状模式与DNA结合（图。D） 。因此，尽管SU（VAR）2-10和GAGA因子可能在细胞周期的某些阶段相关，但这些结果表明Su（变量）2-10GAGA因子在间期结合DNA的功能并不是绝对必要的。
SU（VAR）2-10蛋白与压扁的多线染色体呈弱点状结合（图。). 染色体染色模式是可变的；尽管如此，还是标记了少量常染色带（箭头，图。A–C）和染色体2L的端粒区域（箭头，图。A、 B）和4（图。C） 持续染色。异色色中心也在这些压扁的制剂中染色（双箭头，图。A） ●●●●。这些染色模式可能代表SU（VAR）2-10结合的局部区域，只有通过提取和压榨去除高水平的细胞质和核质SU（VAR）2-10。第二个固定方案去除了大部分核质池，证实了SU（VAR）2-10蛋白显著的端粒定位（图。D、 E）。SU（VAR）2-10在端粒处没有与异染色质蛋白1（HP1）共定位（图。B、 C）；蛋白质在2L和4号染色体末端占据不同的亚结构域，HP1位于染色体的远端。
SU（VAR）2-10通常与压扁的多线染色体相关，并且在端粒处与HP1不共定位。间接免疫荧光显示SU（VAR）2-10(绿色)在压扁的多线染色体上（DAPI染色的DNA是蓝色在所有面板中）。(A类)SU（VAR）2-10以一般的点状模式与多线染色体结合。色心被标记(箭头)，还有一些常染色带(箭头)和2L染色体的尖端(B类)和4(C类)，条形输入A类，15微米。(B类)装箱区域的放大视图A类显示SU（VAR）2-10(绿色)不与HP1同位(红色)位于染色体2L的顶端(C类)HP1型(红色)染色中心和4号染色体以及SU（VAR）2-10密集染色(绿色)发现于4号染色体尖端附近。棒材，10μm。(D、 E类)SU（VAR）2-10蛋白明显定位于端粒。
SU（VAR）2-10染色与间期核周围层粘连蛋白密切相关
SU（VAR）2-10染色与神经母细胞和唾液腺相间细胞核周边的层粘连蛋白染色密切相关（图。). 在成神经细胞核中，蛋白质紧密地分布在核周围，核腔中有明显的SU（VAR）2-10染色斑点，而这些斑点与层粘连蛋白没有共同分布（图。C） ●●●●。在唾液腺细胞核中，SU（VAR）2-10的部分与核层粘连蛋白共定位，但共定位有时是可变的（参见图。B和F） 最有可能是由于围绕整个唾液腺的鞘层的抗体渗透性不同。在S2细胞中，SU（VAR）2-10在核周围的定位不太明显，SU。一） ●●●●。这些差异可能反映了各种SU（VAR）2-10亚型的组织特异性分布，需要进一步的实验来确定SU（VAR）2-10和层粘连蛋白是否结合，以及这些蛋白的结合是否对正常细胞功能是必要的。
SU（VAR）2-10和层粘连蛋白在间期成神经细胞和唾液腺细胞的核周围共定位。间接免疫荧光显示SU（VAR）2-10和核层粘连蛋白在第三代幼虫成神经细胞间期细胞中的同时定位(A类–C类)，整个唾液腺细胞核(D类–F类)和间期S2细胞(G公司–我). 在所有面板中，绿色是抗SU（VAR）2-10染色红色是抗层粘连染色。SU（VAR）2-10和层粘连蛋白在成神经细胞中紧密共定位(A类–C类)和唾液腺细胞(D类–F类)，但二者在S2细胞中不共存(G公司–我). 注意成神经细胞核内部的SU（VAR）2-10特异染色(A、 C类). (A类–C、 G公司–我)棒材，5μm。(D类–F类)棒材，15μm。
SU（VAR）2-10亚型独立于转录影响染色体凝集
与PIAS蛋白的同源性表明，SU（VAR）2-10亚型可能通过调节控制染色体结构和功能的其他基因的转录，间接影响染色体的结构和功能。为了解决转录中的潜在作用，SU（VAR）2-10在合胞体中的抑制果蝇属胚胎被比作一般的转录块。使用表达组蛋白–GFP融合蛋白的胚胎，用实时反褶积显微镜检查染色体分裂(克拉克森和圣1999).
将亲和纯化的抗SU（VAR）2-10抗体注射到周期前的13个胚胎中，并在注射后拍摄两个分区。胚胎对SU（VAR）2-10抗体的浓度非常敏感。注射浓度为10 mg/mL的抗SU（VAR）2-10抗体产生了大量染色体凝集缺陷，最终导致前期/中期阻滞（中间面板，图。). 注射浓度为4 mg/mL的抗SU（VAR）2-10抗体的胚胎显示出主要的染色体分离缺陷，但没有冷凝缺陷（数据未显示）。重要的是，破坏早期胚胎中SU（VAR）2-10活性所产生的缺陷精确地模拟了Su（变量）2-10三龄幼虫的突变（见上文）。在未注射的对照胚胎或注射了来自抗体浓缩程序的补充BSA滤液的对照胚胎中，从未观察到冷凝缺陷（左面板，图。; 参见材料和方法）。
SU（VAR）2-10抗体破坏早期胚胎的染色体凝集和分离。注射抗SU（VAR）2-10抗体的胚胎的染色体凝集和分离被破坏(中间的面板），但不在注射BSA的胚胎中(左边面板）或α-鹅膏素(正确的面板），一种RNA聚合酶抑制剂。在注射后的第二个有丝分裂周期中，胚胎处于相同的时间点。时间（分钟）(t吨)为每个面板指示后注入。请注意t吨============================================================================BSA-和α-amanitin注射胚胎中的25条中期染色体在中期板处正确地凝聚和排列。这些核分裂并继续循环。在注射抗SU（VAR）2-10的胚胎的第二个注射后周期中，从未形成浓缩的中期染色体，有丝分裂周期在中期之前停止。
早期的转录谱果蝇属研究表明，这些缺陷不是由改变SU（VAR）2-10介导的转录激活引起的。在周期14之前，合子转录是不必要的(Merrill等人，1988年;Wieschaus and Sweeton 1988年)虽然在周期13之前可以看到一些合子RNA(扎洛卡1976)，这些周期的快速性可能会阻止功能转录物的产生(O'Farrell等人，1989年). 因为我们的抗体注射实验是在周期前-13的胚胎上进行的，所以合子转录的抑制不太可能是观察到的表型的原因。为了解决合子转录在生成Su（变量）2-10胚胎缺陷，我们检测了注射α-amanitin（一种有效的RNA聚合酶II抑制剂）的胚胎果蝇属胚胎(埃德加和舒比格1986). 如果SU（VAR）2-10抗体注射通过失败的转录激活导致浓缩和分离缺陷，我们预计一般的转录抑制将产生类似的缺陷。然而，注射amanitin在染色体凝聚或后期分离方面没有缺陷（右图。). 我们的结论是，在早期胚胎中抑制SU（VAR）2-10活性直接导致染色体结构和功能缺陷，而不是由于不能表达其他基因所致。尽管这些数据不排除SU（VAR）2-10在基因转录抑制中的潜在作用，该基因的错误表达导致观察到的表型，但鉴于早期胚胎中没有转录，这是不可能的。
Su（var）2-10突变细胞核中的间期染色体组织发生改变
SU（VAR）2-10蛋白定位和多效性突变表型表明，该基因座可能在染色体和核功能中发挥全局作用。为了直接检测SU（VAR）2-10在核组织中的作用，我们使用荧光原位杂交（FISH）监测了整个唾液腺细胞核中的端粒-端粒和端粒-纤层的关联。间期染色体通常以Rabl构型组织，着丝粒和端粒位于细胞核的两端(Dernburg 1995年). 荧光标记DNA探针特异性杂交到中心和端粒区域（图。A） 和三维分析表明，来自对照、三龄幼虫的完整细胞核中的染色体呈Rabl构型（图。C） ●●●●。野生型三龄幼虫端粒杂交信号之间的平均距离为5.5μm，近80%的细胞核产生了端粒距离：细胞核直径比<0.2（蓝色条，图。F） ●●●●。相比之下，来自一龄幼虫腺体的细胞核显示出端粒信号的显著分离，63%的细胞核显示出端粒距离：细胞核直径比>0.25（图。B类；绿色条，图。F、，第页 < 0.01). 这些结果表明，端粒在一龄发育阶段并没有紧密聚集，这意味着在幼虫发育的后期，端粒聚集在唾液腺细胞核中。
端粒-端粒和端粒-板层结合缺陷发生在Su（变量）2-10突变细胞。使用central进行FISH分析(绿色)和端粒(红色)展示了分析间期多烯细胞核染色体组织的探针。(A类)将幼虫唾液腺压扁的多烯染色体与DNA探针杂交，并用DAPI进行复染(蓝色)使DNA可视化。中心探针按预期结合异色染色中心，端粒探针结合染色体2L和3L Bar的尖端，15μm。端粒杂交信号在一龄幼虫唾液腺的完整细胞核中分离(B类)，但在第三恒星幼虫的细胞核中联系更紧密(C类). 端粒-端粒和端粒-板层结合在Su（变量）2-10突变细胞核(D类).蓝色代表核层粘连染色B类–D类棒材，10μm。(E类–G公司)代表野生型一龄幼虫端粒-端粒和端粒-叶片距离相对于细胞核直径的条形图(绿色条)和三英寸(蓝色条)幼虫，以及Su（变量）2-10突变幼虫(红色条). 两个样本t吨-测试证实，对照组和突变组之间的比率差异具有统计学意义（参见文本第页-值）。
端粒聚集在Su（变量）2-101/Su（变量）2-102三龄幼虫（图。D） 。在73%的突变细胞核中观察到两个分离的端粒杂交信号，而野生型对照只有9%。端粒杂交信号之间的平均距离Su（变量）2-10突变体为11.6μm，70%的细胞核产生了端粒距离：细胞核直径比>0.25（红色条，图。G、，第页 < 0.001). 端粒聚集缺陷不是一龄期发育停滞的结果，因为Su（变量）2-10在这些实验中分析的突变核（30.96μm）与三龄对照核（29.84μm；也参考图中的大小。C、 D）。该分析还揭示了Su（变量）2-10突变细胞核在端粒和核膜之间有异常的联系（参见红色和蓝色条，图。H） ●●●●。平均而言，突变细胞核中的端粒杂交信号位于距核膜3.0μm处，26%的端粒位于核膜1μm内（红色条，图。H） ●●●●。相比之下，野生型对照组的平均端粒-层间距仅为1.7μm，72%的端粒位于核层的1μm范围内（蓝色条，图。H、，第页 < 0.01). 我们得出结论，端粒-端粒和端粒-板层的联系在Su（变量）2-10突变的多线核，证明SU（VAR）2-10在间期核的染色体组织中起作用。
唐纳森（Donaldson）和卡彭（Karpen）提出，从末端缺失的微小染色体（例如黄色的+中的基因γ878)与端粒染色质并列有关，后者反过来影响核组织和基因表达(Donaldson和Karpen 1997年).Su（变量）2-10突变主要抑制这种末端缺失相关的PEV（TDA-PEV；数据未显示），这与蛋白质的端粒定位以及突变对端粒聚集和叶片相互作用的影响有关。
讨论
显示的不同表型Su（变量）2-10突变体表明该基因在细胞中起着多重作用。胚胎和成神经细胞内的小染色体传递减少和内源性染色体后期运动缺陷表明了染色体遗传的作用。中期胚胎、成神经细胞和间期多烯细胞中的凝缩缺陷表明其参与染色体结构。杂色表型的抑制表明其在基因表达中发挥作用，与PIAS蛋白家族的同源性以及突变幼虫中黑色素瘤的存在表明SU（VAR）2-10在JAK-STAT信号转导途径中发挥作用。事实上，达内尔实验室最近进行的研究表明果蝇属太平洋岛屿协会Su（变量）2-10JAK-STAT通路的组成部分（A.Betz和J.E.Darnell，pers.comm.）。令人惊讶的是，SU（VAR）2-10蛋白不定位于有丝分裂染色体，而在间期细胞中定位于端粒、核膜和核腔。最后，端粒聚集和端粒-膜结合的缺陷以及对TDA-PEV的突变效应表明SU（VAR）2-10在端粒功能和核组织中起作用。致死性很可能是由这些缺陷的组合引起的，各种表型可能有一个共同的潜在原因，即染色体结构和核组织异常。
将SU（VAR）2-10同系物与SU（VAR）2-10函数联系起来
这些数据果蝇属研究可能阐明哺乳动物PIAS蛋白的作用模式。尽管PIAS1最初被描述为STAT1介导的基因激活抑制剂(Liu等人，1998年)最近的研究表明，PIAS蛋白并非仅在JAK-STAT通路中起作用；PIAS1还充当雄激素、糖皮质激素和孕激素受体的核受体协同调节器(Tan等人，2000年). 该蛋白如何与多个结合伙伴协调相互作用尚不清楚。同样，SU（VAR）2-10亚型可以与多种转录调控复合物协同作用（图。A） ；然而，转录中的作用并不排除染色体遗传中额外的、更直接的作用。在酿酒酵母，CPF1作为着丝粒结合蛋白和转录调节器(Mellor等人，1990年). 此外，人着丝粒蛋白C（CENP-C）与两种核仁转录因子UBF1和UBF2相互作用(普鲁塔和恩肖1996). 这些观察结果表明，转录调控和染色体遗传可以利用共同因素，并表明这些因素要么具有双重功能，要么这些过程通过一种共同的机制联系在一起（例如，下面讨论的染色体的核组织）。
SU（VAR）2-10功能的模型。在野生型间期细胞中，SU（VAR）2-10蛋白(绿球)存在于细胞质和细胞核中，在那里观察到的主要定位是靠近核边缘和染色体间隙(粉红色管子，染色体；蓝色管，异染色质；宽蓝色管，着丝粒）。(A类)SU（VAR）2-10亚型可能在多种转录调控复合物中发挥作用，与许多染色体结合转录因子相关(深蓝色和紫色椭圆)，并且每个关联可能控制不同的细胞反应（例如，活力、基因表达或染色体遗传）。(B类)SU（VAR）2-10协调间期细胞核中的染色体组织，确保正常生存能力、基因表达和染色体遗传。重要的是，这里提出的两个模型并不相互排斥。
一些观察结果与Su（变量）2-10功能完全基于转录调控。首先，在我们的抗体微量注射实验中，我们观察到了对染色体凝聚和分离的直接、转录依赖性影响。类似地，一个SU（VAR）2-10同源基因KChAP结合电压门控钾通道亚基并调节通道电流；然而，它上调电流的能力并不需要转录(Kuryshev等人，2000年). 第二，SU（VAR）2-10蛋白不与多烯染色体以带状模式结合，这与已知转录因子和辅因子（例如GAGA因子，一种转录激活剂）的定位有很大不同；和SMRTER(SMRT公司-相关的e（电子）cdysone公司第页受体相互作用因子），一种核受体协同调节因子(Tsai等人，1999年). 最后，我们的体内功能分析Su（变量）2-10提示PIAS同源物在转录以外的细胞过程中发挥作用，包括染色体结构、遗传和细胞核中染色体的组织。无论这些影响是直接还是间接的，SU（VAR）2-10和其他PIAS蛋白将信号转导与染色体行为联系起来的令人兴奋的可能性值得进一步分析。
SU（VAR）2-10与染色体的核组织
我们提出了一个简约模型来解释SU（VAR）2-10和可能的其他PIAS蛋白的行为。SU（VAR）2-10的主要作用可能是促进间期细胞核中的正常染色体组织，生成/维持正常基因表达和染色体遗传所需的染色质结构（图。B） ●●●●。间期细胞核中染色体的组织是一个协调的、非随机的过程。不同细胞类型（例如二倍体细胞与多烯细胞）的核结构的三个广泛层次通常是一致的。首先，染色体可以组织成Rabl构型，着丝粒位于细胞核的一端，端粒位于另一端（有关综述，请参阅Dernburg 1995年). 第二，染色体在细胞核内没有相互缠绕；相反，它们占据不同的领域(Hochstrasser等人，1986年;Bridger and Bickmore 1998年). 第三，离散的染色体区域与核膜紧密接触(Marshall等人，1996年). 各种染色体功能与核纤层有关。基因的核周定位酿酒酵母可以诱导转录沉默(Andrulis等人，1998年)中的、和果蝇属胚胎是染色体凝集起始的焦点，发生在核外周附近(Hiraoka等人，1989年). 此外，哺乳动物细胞和果蝇属胚胎倾向于聚集在细胞核外围和核仁周围（综述见Pluta等人，1995年). 因此，间期核组织缺陷可导致多种染色体异常，包括基因表达改变、前期染色体凝集缺陷和后期染色体异常分离。所有这些都是由Su（变量）2-10突变体。对核组织作用的最有力直接支持Su（变量）2-10来自端粒-端粒和端粒-板层相互作用的缺陷Su（变量）2-10突变细胞核。与这些过程中的作用一致，SU（VAR）2-10蛋白定位于端粒，并在间期集中于核外周。SAP结构域是人类支架附着因子SAF-A和SAF-B、Ku70 DNA修复蛋白和所有SU（VAR）2-10蛋白中的一个氨基酸基序，最近对其的描述进一步暗示了Su（变量）2-10确定间期染色体组织(Aravind和Koonin 2000). SU（VAR）2-10亚型的SAP结构域可能将特定的染色体区域连接到核膜；此外，PIAS家族成员的转录调控特性可能是间期染色体组织主要缺陷的次要后果。
在这里，我们已经从识别导致染色体传递表型的突变发展到了异染色质生物学和细胞核内染色体组织的分子进入。未来如何研究Su（变量）2-10调控染色体结构和功能包括识别其结合伙伴和解析不同亚型的功能。对SU（VAR）2-10蛋白所在的复合物进行分类将有助于确定其作用模式。更广泛地说，这些研究产生的数据将扩大对PIAS蛋白家族生物学功能以及间期染色体结构如何促进转录调控和染色体遗传的当前观点。
材料和方法
遗传技术
所有遗传杂交均在25°C下进行，并按照前面所述进行微染色体传递分析(库克等人，1997年). 这两个Su（变量）2-10Gunter Reuter善意地提供了EMS等位基因(Wustmann等人，1989年)，从布卢明顿和乌米亚获得了飞行线路果蝇属库存中心。精确和不精确的切除Su（变量）2-1003697P元素是通过向含有P元素的飞行系遗传引入转座子源并选择丢失玫瑰色的+眼睛颜色标记。在所有分析中，控制是我们的标准年1 ; 里506应变。
有丝分裂缺陷
有丝分裂染色体压片是根据Gatti等人（1994年），但未使用低渗孵育或秋水仙碱治疗。将突变体的有丝分裂图与年1 ; 里506控制幼虫。每个大脑至少有50个区域的有丝分裂图被评分，其中一个区域被定义为在蔡司Axiophot荧光显微镜上用1.25倍光学倍率放大100倍时可见的区域。突变大脑中罕见的非整倍体中期数字没有包括在缺陷的定量中。有丝分裂指数（M.I.）的计算方法是中期加后期数字的总和除以总得分字段数。
cDNA定位和转化拯救实验
基因组DNA侧翼的质粒拯救Su（变量）2-1003697插入产生5 kbXho公司用于探测胚胎cDNA文库的I片段（卡尔·萨梅尔的礼物）。六Su（变量）2-10分离出cDNA，并从BDGP数据库中鉴定出该位点的其他EST。5-kbXho公司我片段也用于筛选来自多烯区45A的BDGP P1克隆。15 kb生态将P1300中包含该位点的RI片段亚克隆到pYES转化载体（Pamela Geyer的礼物；巴顿等人，1992年). 种系转化为年1 ; 里506生成了一个X（X）-用于致死性和微小染色体传播拯救实验的染色体转基因。对该元件进行再活化，生成第三个染色体插入，用于分析PEV抑制表型的挽救。
Su（var）2-10等位基因分析
按顺序排列Su（变量）2-101和Su（变量）2-102，使用跨越编码区的引物进行单胚胎PCR。通过Salk Institute DNA测序设备，使用ABI377自动测序仪（Perkin Elmer）测定纯化的PCR产物的DNA序列，并使用测序软件包（Gene Codes）分析序列。序列来自Su（变量）不会改变微小染色体传递的染色体（H.Le、K.Donaldson、K.Cook和G.Karpen，预备）和年1 ; 里506用作对照。A T→A突变Su（变量）2-101在氨基酸327中产生亮氨酸到蛋氨酸的变化，在Su（变量）2-102在氨基酸260中产生色氨酸到STOP的变化。Su（变量）2-1003697根据互补、Southern blot和PCR分析，切除被定义为精确或不精确。在107次手术中，31次精确，76次不精确。四次不精确的切除，包括Su（变量）2-10Pex74a公司，未能补足Su（变量）2-101杀伤力，删除编码区中的3′。Su（变量）2-10Pex74a公司删除所有Su（变量）2-10编码顺序（参见补充材料网址：www.genesdev.org).
生成SU（VAR）2-10抗体
PCR用于从Su（变量）2-10将其克隆到6xHis标记载体（pQE-30，Qiagen）中。标签被添加到这个230-aa片段的N末端。融合蛋白表达于大肠杆菌并在Ni-NTA柱上纯化。Ni-NTA柱与融合蛋白共扩增出三条额外的带；将含有融合蛋白的组分合并，并在Mono-Q和Mono-S柱上进一步纯化。所有四个波段都是从两列中协变而来的。用识别与所有四条带结合的6xHis标签的抗RGS HIS抗体（Qiagen）进行的蛋白质印迹表明，这些是来自6xHis/SU（VAR）2-10融合蛋白羧基端的降解产物。运行制备凝胶，并从这些凝胶中切下全长融合蛋白，用于培养豚鼠抗体（Covance）。
西方分析
使用6xHis/SU（VAR）2-10融合蛋白从Western blots中亲和纯化SU（VAR）2-10-抗体。通过12.5%的SDS-PAGE凝胶电泳0–12小时胚胎（加州大学圣地亚哥分校J.Kadonaga实验室的礼物）的10μL纯化细胞质和核提取物，并使用Bio-Rad电泳转移细胞转移到PVDF膜。用1:100稀释的亲和纯化抗SU（VAR）2-10抗体和1:5000稀释的辣根过氧化物酶结合山羊抗几内亚猪二级抗体（Chemicon）检测印迹。使用ECL Western印迹检测试剂（Amersham Pharmacia Biotech）观察条带。
细胞学分析
使用配备普林斯顿仪器冷却CCD摄像机的蔡司Axiophot荧光显微镜分析有丝分裂图像。使用IP Lab Spectrum Imaging Software（Scanalytics）拍摄图像，并使用Adobe Photoshop进行整理。为了进行抗体染色实验，按照Theurkauf（1994）.两种方案用于制备和染色挤压后的成神经细胞组织(安德鲁和斯科特1994;Fanti等人，1998年). S2细胞（Invitrogen）维护和染色程序见鼓风机和卡彭（2001）.整个唾液腺被染色，如Goldberg等人（1998年）除DNA在1-μg/mL DAPI中染色5 min外。制备压扁的多烯染色体并进行染色，如Platero等人（1995年）或安德鲁和斯科特（1994）一级抗体稀释液如下：亲和纯化豚鼠抗SU（VAR）2-10，1:10；单克隆抗层粘连蛋白，1:10；单克隆抗HP1，1:10；和亲和纯化的兔抗GAGA因子，1:100。山羊抗豚鼠-FITC、山羊抗鼠Cy3（Chemicon）和驴抗兔Cy5（Jackson ImmunoResearch Laboratories）二次制剂按1:100稀释使用。单克隆抗体由T47（加州大学圣地亚哥分校S.Wasserman提供）和T40（加州大学旧金山分校J.Sedat提供）组成。单克隆抗HP1为C1A9，由B.Wakimoto（美国华盛顿州）提供。亲和纯化兔抗GAGA因子来自J.Lis（康奈尔大学）实验室。使用DeltaVision光学切片显微镜捕获唾液腺缺陷和蛋白质定位图像，并使用DeltaVision softWoRx软件包（Applied Precision）进行解卷和建模。
核组织FISH分析
第2L号和第3L号染色体的端粒探针是通过基因组PCR从第2L号染色体的Taq小卫星内的457bp亚端粒重复序列中产生的(Walter等人，1995年). 使用单一品牌的AACAC 40-mer寡核苷酸作为染色体2R特异性中心异染色质的探针(Dernburg等人，1996a). 如中所述，对端粒和中心探针进行荧光标记Dernburg等人（1996a）分别使用Cy3-dUTP（Amersham Pharmacia Biotech）和FITC-dUTP（Enzo Diagnostics）。如上所述，分离并固定幼虫唾液腺作为整个腺体，并按照中所述进行FISH德恩堡（1999年），每个探针使用100 ng。在FISH程序后，用上述抗层粘连抗体对腺体进行染色。
早期胚胎注射抗体
按照说明进行微量注射(Francis-Lang等人，1999年;夏普等人，2000年)，除了使用DeltaVision光学切片显微镜（应用精度）拍摄分割。组蛋白-GFP转基因果蝇由R.Saint开发(克拉克森和圣1999)由B.Sullivan（加州大学圣克鲁斯分校）提供。使用Microcon YM-10离心过滤装置（Millipore Corporation）将亲和纯化的抗SU（VAR）2-10抗体浓缩在1×PBS/50%甘油中。将BSA从该浓缩程序添加到滤液中，最终浓度为10 mg/mL，并将该溶液作为对照注入。Coommassie凝胶验证了抗体注射溶液和补充BSA的对照品的纯度。在1×PBS/50%甘油中以500μg/mL的速度注射α-鹅膏蛋白。
统计分析
采用卡方检验比较对照组与突变神经母细胞中有丝分裂缺陷的百分比。两个样本t吨-进行测试以确定对照组和突变组端粒-端粒和端粒-板层相互作用之间观察到的差异的统计意义。假设方差相等和不相等，对平均值进行比较。两种方法产生的结果相同第页-所有检查病例的值。
