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基因发育。2001年6月1日；15(11): 1383–1392.
数字对象标识：10.1101/gad.901101
预防性维修识别码：PMC312704项目
PMID：11390358

TSC1类和TSC2系统肿瘤抑制剂拮抗细胞生长中的胰岛素信号

新生高1和多加·潘1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

结节性硬化症是一种人类疾病，由TSC1类或TSC2系统抑癌基因。以前的研究果蝇TSC2同源物表明TSC公司维持DNA含量的基因TSC2系统导致多倍体和细胞大小增加。我们在果蝇属同系物TSC1类基因。我们发现TSC1和TSC2在共同的途径中形成一个复合物并发挥作用，以控制细胞生长。与以前的研究不同，我们的工作表明TSC1类–或TSC2系统–细胞为二倍体。我们发现，惊人的是TSC1类或TSC2系统足以挽救功能丧失的胰岛素受体突变体的致命性。进一步的遗传分析表明TSC公司基因作用于一条平行的途径，该途径汇聚于胰岛素途径下游阿克特综合起来，我们的研究确定了TSC公司肿瘤抑制因子作为新的胰岛素信号负调控因子。

关键词：细胞大小、肿瘤抑制因子、胰岛素信号、Akt

在后生动物的发育过程中，细胞内因子和细胞外因子必须协同作用，以确定不同细胞类型的特征大小（有关综述，请参阅苏和奥法雷尔1998;斯托克和哈芬2000). 影响细胞大小的一个内在因素是DNA含量，细胞大小与不同物种的倍性相关(苏和奥法雷尔1998). 另一方面，长期以来人们一直认识到，激素、生长因子和营养等细胞外因子在生物体水平的生长控制中发挥着重要作用（有关综述，请参阅Conlon和Raff 1999). 因此，一个挑战是了解细胞内和细胞外因子如何协调控制细胞生长，以及这种调节的变化如何导致癌症等病理状况。

在细胞生长中起关键作用的激素介导途径之一涉及胰岛素或胰岛素样生长因子（IGF）（有关综述，请参阅普劳德和丹顿1997). 生物化学研究表明，胰岛素受体（InR）或胰岛素样生长因子（IGF）与胰岛素结合后，直接或通过胰岛素受体底物（IRS）将磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）招募到细胞膜上作为中间产物。膜脂磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP）的磷酸化2)通过PI3K产生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP三)激活一种Ser/Thr激酶Akt。Akt和另一个由任务大纲（雷帕霉素靶点）基因最终控制两个下游效应器的磷酸化，即p70 S6激酶（S6K）和4E-结合蛋白（4E-BP），这两个效应器参与翻译控制（有关综述，请参阅托马斯和霍尔1997;Sonenberg和Gingras 1998;Schmelzle和Hall 2000). S6K的磷酸化增加了其朝向核糖体S6亚单位的激酶活性，导致5′末端寡嘧啶束（TOP）mRNA的翻译增加，这些mRNA主要编码翻译装置的组成部分，如核糖体蛋白。4E-BP的磷酸化从非活性eIF4E/4E-BP复合物中释放真核生物起始因子4E（eIF4E），允许eIF4E在翻译起始中发挥作用。该途径的一个众所周知的负调节因子是PTEN肿瘤抑制因子，它作为磷酸酶转化PIP三至PIP2（有关审查，请参阅坎特利和内尔1999). 胰岛素信号在生长控制中的重要性已由来自果蝇属.功能丧失突变果蝇属胰岛素途径成分的同源物，包括InR、IRS、PI3K、Akt、TOR、和60万，所有这些都会导致细胞尺寸减小PI3K，Akt公司、和S6K系列，或失去负调节器PTEN公司，导致单元格大小增加(Chen等人，1996年;Böhni等人，1999年;Goberdhan等人，1999年;Huang等人，1999年;Montagne等人，1999年;Verdu等人，1999年;Weinkove等人，1999年;Gao等人，2000年;Oldham等人，2000年;Zhang等人，2000年).

结节性硬化症（TSC）是一种常染色体显性遗传疾病，每6000名患者中就有1人受到影响（有关综述，请参阅Young和Povey 1998). 这种疾病的特点是良性肿瘤广泛发展，称为药瘤，经常导致皮疹、癫痫发作和精神发育迟滞。TSC是由TSC1类或TSC2系统抑癌基因。TSC2系统编码假定的GTPase激活蛋白（GAP），以及TSC1类编码含有两个线圈结构域的新蛋白质(1993年欧洲16号染色体结节性硬化联盟;van Slegtenhorst等人，1997年). TSC1和TSC2蛋白在哺乳动物细胞中形成复合物(van Slegtenhorst等人，1998年;Nellist等人，1999年)并被提议控制包括细胞周期在内的各种细胞功能(Soucek等人，1997年,1998)，内吞作用(Xiao等人1997)，细胞粘附(Lamb等人，2000年)、和转录(Henry等人，1998年). 然而，尚不清楚这些潜在功能在正常发育过程中是如何使用的，以及TSC公司基因导致良性肿瘤。

虽然缺乏动物模型TSC1类到目前为止还没有报道，动物模型研究缺乏TSC2系统基因提供了对TSC公司发育中的基因。Eker大鼠株在大鼠体内含有种系插入突变TSC2系统导致TSC2蛋白过早截断的基因(Kobayashi等人，1997年;Rennebeck等人，1998年). 缺少小鼠模型TSC2系统也通过基因靶向产生(Kobayashi等人，1999年;Onda等人，1999年). 在这些模型中，纯合子TSC2系统突变体是胚胎致死性的，而杂合携带者容易形成肿瘤。最近，果蝇属同系物TSC1类和TSC2系统已报告(伊藤和鲁宾1999). 伊藤和鲁宾表明，细胞缺乏吉格斯舞曲，的果蝇属同系物TSC2系统单元大小增加。他们进一步建议吉格斯舞曲突变细胞是由于在影像椎间盘发育结束时未能进入M期，导致多倍体，从而增加细胞大小(伊藤和鲁宾1999). 鉴于DNA含量的增加在任何TSC公司脊椎动物良性肿瘤千兆突变表型可能反映了果蝇属发展。在这方面果蝇属突变体缺乏TSC1类基因可以补充分析吉格斯舞曲突变体。为了简单起见，TSC1类和TSC2系统在论文的其余部分中都被用来指代果蝇TSC1和TSC2系统同系物，除非另有规定。

这里我们报告了第一个缺乏TSC1类基因。我们证明TSC1和TSC2在果蝇属细胞和功能共同控制细胞生长。我们进一步表明TSC公司基因作用于一条平行的途径，该途径汇聚于胰岛素途径下游阿克特。我们的研究确定了TSC公司肿瘤抑制因子作为新的胰岛素信号负调控因子。

结果

TSC1突变体的分离

我们使用了FRT/FLP复合系统(徐和鲁宾1993)以筛选果蝇属影响细胞大小的突变的基因组。在第三条染色体的右臂上发现了两个致命突变，在眼睛和翅膀的突变克隆中产生了放大的细胞。这两个突变体都在胚胎-幼虫过渡期死亡，没有明显的形态缺陷。这些突变定位于95D7-11；95E8区域通过缺陷映射。此区域包含果蝇属哺乳动物的同源物TSC1类基因(伊藤和鲁宾1999). 考虑到果蝇TSC2同系物吉格斯舞曲导致细胞大小的类似增加TSC1类或TSC2系统我们研究了95D-E基因突变是否破坏了果蝇TSC1同源物。DNA测序分析显示两个等位基因都发生点突变（图。​（图1B）。1B） ●●●●。TSC1类12有一个导致移码的单碱基缺失，截断了氨基酸896的蛋白质。据预测，这种突变会删除TSC1蛋白的部分线圈结构域，这些结构域与TSC2结合有关(van Slegtenhorst等人，1998年). 另一个等位基因，TSC1类29，包含一个单碱基无义突变（C到T），用终止密码子取代氨基酸61（Gln）。这种突变被预测为无效等位基因，因为它截断了大部分蛋白质。4.7-kb构造，仅包含TSC1类基因组DNA能够完全拯救TSC1类12和TSC1类29纯合子转化为活的和表型的野生型动物，证实这两种突变确实破坏了TSC1类（图。​（图1）。1).TSC1类12和TSC1类29在细胞大小的表型上无法区分。所有后续分析均使用TSC1类29等位基因。

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的结构TSC1类TSC蛋白的位点和预测结构。(A类)基因组结构TSC1类轨迹。这个TSC1类基因位于CG6129型和秒103R上。外显子用粗线表示，内含子用细线连接相邻外显子。转录起始点用一条线表示，末尾带有箭头。翻译起始点用双线表示，末尾有一个箭头。指出了用于救援构造的基因组DNA片段。(B类)的示意结构果蝇属TSC1和TSC2蛋白。TSC1是一种预测的1100氨基酸多肽，含有两个卷曲-卷曲结构域（CC1和CC2）。分子损伤TSC1类12和TSC1类29显示。TSC2是一种预测的含有GAP结构域的1847 aa多肽。

TSC1自主控制细胞和器官大小

扫描电子显微镜显示TSC1类突变克隆比周围的野生型ommatidia大（图。​（图2A）。2A） ●●●●。眼科切片显示，突变感光体的横纹肌体大约是该地区相邻野生型感光体大小的1.8倍(n个 = 48). 然而，小眼的组织和各种细胞类型的分化几乎是正常的，偶尔会有感光细胞的丢失或增加（图。​（图2B）。2B） ●●●●。仔细检查由遗传标记组成的花叶病小蜂TSC1类突变和非突变细胞表明TSC1类细胞大小的突变是严格的细胞自主的（图。​（图2B）。2B） ●●●●。在机翼上也观察到对细胞大小的类似自主效应（图。​（图2C）。2C） ●●●●。因此，TSC1类自主控制细胞大小。检查是否TSC1类调节器官大小，我们选择性地切除TSC1类眼底影像盘的功能无眼的-FLP技术(Newsome等人，2000年). 这项技术使我们能够持续产生眼盘，其中>90%的细胞是突变的TSC1类这种眼盘的大小是野生型眼盘的2.9倍(n个 = 19; 图。​图2D，E）。2D、 E）。因此，TSC1类自主控制器官大小。

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TSC1类自主控制细胞和器官的大小。(A类)携带纯合子克隆的复眼的扫描电子显微照片TSC1类29细胞。变异克隆占据了图片中眼睛的上半部分。请注意TSC1类突变体ommatidia比野生型ommatida大。(B类)截面到aTSC1类29在成人眼中克隆。突变克隆的标志是没有色素。与杂合感光细胞相比（通过Axiovision软件测量），突变感光细胞的触角体面积增加了约80%。在克隆边界，镶嵌小眼畸形包含正常大小的杂合细胞（箭头）和扩大的纯合细胞TSC1类可以看到突变细胞（箭头），表明TSC1类自主控制单元大小。(C类)翼缘鬃毛包含TSC1类29突变克隆。请注意TSC1类变异猪鬃（标记为年-（由翼缘上方的一条线表示）比深色的野生型刚毛更厚更长。(D–E型)野生型眼天线光盘的图像(D类)还有一个眼天线盘TSC1类通过使用ey-Flp公司技术(电子). 椎间盘也因玻璃-lacZ在视网膜细胞中表达。这些图像是在相同的放大倍数下拍摄的。请注意TSC1类–眼盘比野生型大得多。

TSC1在影像椎间盘发育过程中控制细胞生长和增殖

检查单元格大小何时发生变化TSC1类突变细胞，我们检测了影像盘中的突变克隆。突变克隆中的细胞核更大，细胞尺寸增加，在第三英寸影像盘中很明显（图。​（图3A-F），三A–F），表明细胞大小在幼虫发育过程中发生了变化。此外，TSC1类突变（-/-）克隆包含的细胞比它们的+/+双点多（例如，见图​图3A–C）。三A–C）。直接检查TSC1类−细胞，我们在卵沉积（AED）后26、50和74小时诱导克隆，并在119小时定量分析突变克隆和孪生点中的细胞数量。中单元数的平均比率TSC1类在AED诱导26小时、50小时和74小时的克隆中，突变体克隆与双点相比分别为3.1、1.6和1.2(n个 > 40）。由于突变克隆和孪生点来源于同一发育时期出生的有丝分裂姊妹细胞，这些结果表明缺乏TSC1类不仅影响细胞大小，还影响细胞增殖。然而，我们不能正式排除突变克隆中细胞数量增加是由突变细胞死亡减少引起的可能性。

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TSC1类在影像椎间盘发育过程中控制细胞生长和增殖。在所有面板中，TSC1类突变克隆由FRT/FLP产生，并标记为无Ubi-GFP信号（绿色）。(A–C)包含一个大的TSC1类−克隆（箭头）。亮绿色染色的相邻区域表示+/+双点（箭头）。对椎间盘进行神经元特异性核Elav蛋白染色（红色）。显示了三幅图像，其中一幅是GFP(A类)Elav染色法之一(B类)和一种GFP和Elav重叠染色(C类). 请注意，与双点相比，突变体细胞核的大小和突变体克隆的面积显著增加。（D–F)第三英寸视盘部分的共焦图像，包含TSC1类突变克隆（箭头）。椎间盘用指骨样蛋白（红色）染色，突出了细胞的轮廓。显示了三幅图像，其中一幅是GFP(D类)，一种阴茎肽染色(电子)GFP和指骨样蛋白重叠染色(F类). 注意突变细胞的大小增加。(G–小时)包含TSC1类突变克隆（箭头）。圆盘用纤维蛋白（红色）染色，标记细胞的核仁。显示了三幅图像，其中一幅是GFP(G公司)，纤维蛋白染色之一(H（H）)以及GFP和纤维蛋白染色的叠加(H（H）). 注意到细胞核大小增加TSC1类–细胞。

核仁是细胞内核糖体组装的主要部位，其大小与蛋白质合成和增殖速度有关(Derenzini等人，1998年). 我们使用了一种抗核仁蛋白纤维蛋白的抗体(Aris和Blobel 1988)检查核仁大小TSC1类−细胞。我们发现TSC1类−翅膀影像盘中的细胞是2.1倍(n个 = 70）相邻野生型细胞（图。​（图3G-I），三G–I），与角色一致TSC1类在细胞生长和增殖中。

TSC基因缺失不会增加倍性

研究果蝇TSC2基因暗示TSC2系统−细胞进行内复制，导致多倍体，从而增加细胞大小(伊藤和鲁宾1999). 为了解决类似机制是否会导致TSC1类−细胞，我们检测了TSC1类−使用几种不同的技术对细胞进行检测：用共焦或荧光显微镜定量测量DNA染料Hoechst 33342或碘化丙啶染色在完整的影像盘中，以及对分离的影像盘细胞进行FACS分析。令人惊讶的是，我们发现，TSC1类−细胞DNA含量为二倍体（图。​（图4A、B）。4A、 B）。尽管TSC1类突变细胞核比其野生型同胞大，突变细胞中DNA染色的相对强度较弱，并且细胞核中的总荧光在突变细胞和野生型细胞之间具有可比性（图。​（图4A、B）。4A、 B）。这一观察促使我们重新检查TSC2系统−细胞。与TSC1类−细胞中，我们观察到DNA染色的总荧光TSC2系统−与野生型细胞相当的细胞（图。​（图4C，D）。4C、 D）。与DNA染色的显微测量一致，FACS对分离的椎间盘细胞的分析显示TSC1类−或TSC2系统−细胞与野生型细胞的比较（图。​（图4E、F）。4E、 F）。这些结果表明TSC公司基因不会增加倍性，因此TSC1类−或TSC2系统−细胞并不是由于DNA含量增加。

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TSC1类−和TSC2系统−细胞为二倍体。在A类–D类，突变克隆由FRT/FLP产生，并标记为无Ubi-GFP信号（绿色）。(A–B)包含两颗恒星的第三英寸视盘部分的共焦图像TSC1类−克隆（箭头）。用DNA染料碘化丙啶（PI，以红色显示）对椎间盘进行染色。显示了两幅图像，其中一幅是GFP(A类)和一个PI染色(B类). 请注意，突变细胞中PI染色的强度较弱。使用LSM 510软件对Z系列进行定量分析表明，突变体和野生型细胞细胞核中的总荧光具有可比性（数据未显示）。(C–D类)一个三英寸视盘的一部分的荧光显微镜图像，其中包含一个TSC2系统(吉格斯舞曲)突变克隆（箭头）。用DNA染料Hoechst 33342（蓝色）对椎间盘进行染色。请注意，突变细胞中的Hoechst 33342染色强度较弱。使用Axiovision软件进行定量分析表明，突变体细胞和野生型细胞细胞核中的总荧光具有可比性（数据未显示）。(E–F)分离的翼想象盘的流式细胞术分析TSC1类−(电子)和TSC2系统−(F类)克隆。突变细胞和野生型（WT）细胞的轮廓分别用重痕迹和轻痕迹表示。除循环二倍体细胞的DNA含量外，未检测到任何信号（数据未显示）。请注意TSC1类−或TSC2系统−细胞与野生型细胞相似。

TSC1和TSC2在果蝇细胞中共同的信号通路中发挥作用并形成稳定的复合物

根据他们相同的疾病表型，人类TSC1类和TSC2系统基因被认为在一个共同的信号通路中发挥作用。这个果蝇TSC1和TSC2系统突变体为我们提供了一个从基因上解决这个问题的机会。如果TSC1类和TSC2系统我们可能会期望以共同的方式行事TSC1和TSC2双突变细胞具有与TSC1类或TSC2系统单个突变体。事实上，我们观察到TSC1和TSC2双突变细胞显示出与TSC1类或TSC2系统单个突变细胞（图。​（图5A-C），5A–C），表明这些基因在控制细胞生长的共同途径中发挥作用。人类TSC1和TSC2蛋白可以相互结合(van Slegtenhorst等人，1998年;Nellist等人，1999年). 鉴于相同的表型TSC1类−,TSC2系统−、和TSC1类−TSC2系统−细胞，我们怀疑果蝇属TSC1和TSC2蛋白也可能相互关联。为了研究这种可能性，我们在果蝇属表达TSC1和TSC2蛋白的S2细胞分别标记有Myc和V5表位（图。​（图5D）。5D） ●●●●。这些实验揭示了TSC1和TSC2之间的特定相互作用（图。​（图5E）。5E） ●●●●。此外，我们将相互作用域映射到TSC2的N端半（图。​（图5E），5E） 与人类TSC2蛋白的研究一致(van Slegtenhorst等人，1998年). 综上所述，这些结果表明TSC1和TSC2在蛋白质复合体中发挥作用，以调节细胞生长果蝇属.

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TSC1和TSC2之间的相互作用。(A–C)机翼边距包含TSC1类−(A类),TSC2系统−(B类)，以及TSC1类−TSC2系统−(C类)克隆。请注意TSC公司单或双变异猪鬃（标记为年−（由机翼边缘上方的一条线表示）尺寸相似。(D类)表位标记的TSC1和TSC2蛋白在S2细胞中表达的示意图。TSC1结构与全长蛋白相对应，并以～150-kD蛋白的形式迁移。生成了三个TSC2结构，包括全长（TSC2，>200 kD）、N端半体（TSC2N，～130 kD）和C端半体。(电子)对表达TSC1/TSC2、TSC1/TSCAN和TSC1/TSCS2C构建物的S2细胞进行裂解，用α-MYC免疫沉淀（IP）总细胞裂解物，用α-V5免疫印迹(左边面板）。TSC2或TSC2N，但不是TSC2C，可以与TSC1免疫沉淀。同样的印迹被剥离并用α-MYC重制，以表明TSC1在所有车道上的表达水平相当(中间的面板）。作为附加对照，使用Ni-NTA琼脂糖（α-His）从同一细胞裂解液中沉淀TSC2、TSC2N和TSC2C，并用α-V5进行探测。这些蛋白质的表达水平相当(正确的面板）。(F–H（飞行高度）)翅膀表达MS1096标准/UAS-TSC1(F类),MS1096标准/UAS-TSC2(G公司)，以及MS1096标准/UAS-TSC1；UAS-TSC2分别是。这些图像是在相同的放大倍数下拍摄的。翅膀过度表达TSC1类和TSC2系统约28%的翅膀大小表示TSC1类或TSC2系统独自一人。

果蝇TSC1和TSC2的共同表达，但不是单独表达两个基因，会降低细胞和器官大小

我们使用了GAL4-UAS公司系统(布兰德和佩里蒙1993)评估过度表达的影响TSC1类和TSC2系统对细胞生长的影响。果蝇属TSC1、TSC2或这两种基因产物的组合表达于无人机转基因受镀锌4驱动器线路MS1096标准在翼点区域几乎均匀地表达高水平的GAL4(卡普德维拉和格雷罗1994). 尽管过表达TSC1类或TSC2系统单独使用并没有导致任何可见的表型，这两个基因的共同表达导致了翅膀尺寸的急剧减小（图。​（图5F–H）。5F–H）。对机翼尺寸和翼手密度的量化显示，机翼尺寸减小了72%，细胞尺寸减小了65%(n个 = 20). 因此，机翼尺寸的大部分减小可以通过单元尺寸的减小来解释。我们认为TSC1和TSC2在体内作为复合物发挥作用，并且以限速浓度作为蛋白质复合物存在。因此，只有这两种蛋白同时过度表达，而不是单独表达任何一种蛋白，才能增加TSC1–TSC2蛋白复合物的浓度，从而导致与功能丧失表型相反的细胞生长抑制。

TSC基因作用于Akt下游的胰岛素通路上的平行通路

众所周知，胰岛素途径在控制果蝇属（有关审查，请参阅斯托克和哈芬2000). 细胞的功能丧失和功能获得表型TSC公司基因与PTEN公司，InR-PI3K-Akt途径的负调控因子(Goberdhan等人，1999年;Huang等人，1999年;Gao等人，2000年). 这促使我们调查TSC公司胰岛素途径的基因和成分。以前的研究表明内部或阿克特导致细胞尺寸减小。为了调查inr，Akt公司、和TSC公司基因，我们检测了TSC1 Akt公司和TSC1输入双突变克隆。强等位基因的纯合细胞内部(内部35;Fernandez等人，1995年)，或的空等位基因阿克特(Akt1公司q个;Staveley等人，1998年)它们较小，并且由于发育过程中的细胞竞争，很少在成年克隆眼中恢复（图。​（图6A、B；6A、 B；另请参见Verdu等人，1999年). 然而，TSC1输入35或TSC1 Akt1公司q个双突变细胞的细胞大小增加与TSC1类−电池（图。​（图6A-E）。6A–E）。此外内部收益率和阿克特变异细胞也在TSC1输入35或TSC1 Akt1公司q个双突变克隆，产生包含更多细胞的较大克隆（图。​（图6A–D6A–D和数据未显示）。这一结果表明TSC1类从基因上来说是下游的行为阿克特该观察结果与在线性InR-PI3K-Akt途径中从Akt下游分子作用的TSC1或在从Akt-下游汇聚胰岛素途径的平行途径中作用的TSCI相一致。

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这个TSC公司基因作用于Akt下游的胰岛素途径的平行途径。各种突变克隆的眼睛切片。突变克隆的基因型标记在每个部分的下方，以及与野生型对应物相比，突变杆状体的相对大小（X值）。在每个基因型中至少测量了50个小蜂。突变克隆的标记是没有色素，突变克隆的边界用红线勾勒出来。尽管内部−或阿克特−克隆包含很少的细胞，TSC1类−内部−，或TSC1类−阿克特−克隆包含更多的细胞（只有部分突变克隆显示在C和D中）。(A类)内部−. (B类)阿克特−.（C）TSC1类−内部−.（D）TSC1类−阿克特−. (电子)TSC1类−. (F类)PTEN公司−. (G公司)TSC1类−PTEN公司−.

为了区分这两种可能性，我们产生了对PTEN公司和TSC1类PTEN是InR-PI3K-Akt途径的负调控因子PTEN公司导致Akt活性和细胞生长增加。我们推断，如果TSC1在InR-PI3K-Akt途径中从Akt下游起作用，我们可能预期PTEN TSC1公司双突变体细胞显示出与任一单个突变体相似的细胞大小表型。然而，如果TSC1与InR-PI3K-Akt途径平行，我们可能会认为PTEN TSC1型与单个突变体相比，双突变体细胞对细胞大小具有加性效应。我们观察到PTEN TSC1公司双突变感光细胞是野生型细胞的2.9倍，而野生型细胞只有1.9倍PTEN公司−和1.8适用于TSC1类−(n个 = 50). 这一结果强烈表明TSC公司基因在一条平行通路中发挥作用，该通路在Akt下游汇聚于胰岛素通路。

TSC1或TSC2的杂合性拯救了功能丧失InR突变体的致命性

在我们的研究过程中，我们观察到TSC公司基因和内部突变。苍蝇纯合子内部35，一个强大的功能丧失等位基因，对幼虫致命(Fernandez等人，1995年). 然而，纯合子内部35杂合子苍蝇TSC1类可以存活到成年人（表​（表1），1)这意味着TSC1类基因可以挽救内部突变体。

表1

TSC1的杂合性或TSC2系统挽救功能丧失胰岛素受体突变体的致命性

基因型
存活至蛹期的动物（%）
存活至成年阶段的动物（%）
方程式M1
 00
方程式M2
566.6
方程式M3
ND（无损检测）0
方程式M4
ND（无损检测）39

在交叉路口内部35TSC1类29和内部35，对191只苍蝇进行了评分。 

在交叉路口内部353 TSC2系统192和内部1(3)05545共有110只苍蝇得分。 

（ND）未确定。 

类似地TSC2系统足以拯救另一个人的死亡内部突变体（表​（表1）。1). 携带等位基因组合的苍蝇内部353/内部l（3）05545号100%致命(Fernandez等人，1995年). 然而，大约39%的内部353/内部l（3）05545号TSC2杂合的苍蝇可以存活到成年（表​（表1）。1). 综上所述，这些结果提供了令人信服的体内证据，表明TSC公司基因是发育过程中胰岛素信号的负调控因子。

讨论

身体和器官大小如何调节的机制基本上还不清楚（有关综述，请参阅Conlon和Raff 1999). 最近的遗传学研究果蝇属提示胰岛素途径可能协调控制细胞生长和增殖，进而调节器官大小。在这里，我们提供了证据表明TSC公司肿瘤抑制基因在控制细胞大小和器官大小方面也发挥着重要作用。尽管在携带人类肿瘤的患者中观察到细胞大小增加TSC1类或TSC2系统突变（有关审查，请参阅Young和Povey 1998)，其潜在机制尚不清楚。我们的结果表明TSC公司基因和胰岛素途径在控制细胞生长中起拮抗作用。损失TSC公司基因产生的细胞大小表型与PTEN公司类似地TSC公司基因减少细胞大小PTEN公司过度表达。我们的双突变分析结果表明TSC公司基因作用于与胰岛素途径平行的途径TSC公司途径汇聚于胰岛素途径下游阿克特已知有几种蛋白质在Akt下游直接发挥作用，或在Akt.下游的胰岛素途径上聚合。其中包括S6K(托马斯和霍尔1997)，4E-BP(Sonenberg和Gingras 1998)和Ser/Thr激酶TOR(Schmelzle和Hall 2000). 我们的基因分析与TSC公司调控这些候选蛋白的途径。或者TSC公司基因可能调节未知的细胞生长调节因子。目前我们无法区分这些模型。

我们最有说服力的证据表明TSC公司基因和胰岛素信号传导来自于观察到的TSC1类或TSC2系统足以挽救InR突变体功能丧失的致命性。这表明TSC公司基因与胰岛素信号密切相关，而不是在完全独立的细胞生长途径中发挥作用。这些结果表明TSC公司抑癌基因是胰岛素信号传导的新型负调控因子，可调节TSC公司基因可能提供一种潜在的方法来纠正某些疾病（如糖尿病和肥胖）中的胰岛素信号缺陷。

未来的一个重要挑战是了解TSC抑癌基因调控胰岛素途径的分子机制。TSC1（包含线圈结构域）和TSC2蛋白（包含GAP结构域）的预测结构提供了这方面的线索。TSC2蛋白对两种小GTPase Rab5和Rap1具有GAP活性(Wienecke等人，1995年;Xiao等人，1997年). Rab5是内吞途径的一个速率限制成分(Bucci等人，1992年). 据推测，TSC肿瘤抑制因子的丢失可能导致内化生长因子受体或其他信号介导的膜结合分子的错误分类，否则这些分子将经历溶酶体降解，从而导致某些生长促进途径的结构性激活(Xiao等人，1997年). Rap1的体内功能尚不清楚，在不同条件下，Rap1可以作为细胞增殖的正负调节因子(Kitayama等人，1989年;Yoshida等人，1992年). 进一步研究果蝇TSC基因可能为Rab5GAP和Rap1GAP活性在生长抑制中的相对重要性提供见解。

材料和方法

分子生物学

基因组DNA是从TSC1类突变胚胎并用PCR扩增。PCR产物通过使用跨越TSC1类轨迹。该分析揭示了TSC1类12和TSC1类29等位基因（图。​（图1B）。1B） ●●●●。一个4.7 kb的基因组片段，仅包含TSC1类转录单位被克隆到改良的Casperhs载体Casperhs-1中(潘和鲁宾1997)，用于救援实验。

全长TSC1类cDNA克隆LD24327来自Research Genetics，用于生成UAS-TSC1类构造。

使用pAc5.1/V5-HisB载体（Invitrogen）构建Myc标记的TSC1和V5/His标记的TSC2。通过PCR添加编码N-末端Myc表位（MEQKLISEEDLNE）的序列，以取代全长的第一个Met密码子TSC1类cDNA。

果蝇菌株

TSC2系统192(演出192)，为空TSC2系统等位基因，以及UAS-TSC2苍蝇由伊藤直人提供(伊藤和鲁宾1999).内部35和内部353（强等位基因）是曼弗雷德·弗雷希（Manfred Frasch）的礼物(Fernandez等人，1995年).阿克特q个，一个激酶缺失的等位基因阿克特由Armen Manoukian善意提供(Staveley等人，1998年).PTEN公司dj189型为空等位基因(Gao等人，2000年). 产生克隆的基因型如下。

TSC1突变克隆：

y w hsp-flp;TSC1类29FRT82B型/FRT82B，带+适合成人眼睛y w hsp-flp;TSC1类29FRT82B型/FRT82B，年+成人翅膀yw hsp-flp;TSC1类29FRT82B型/FRT82B、Ubi-GFP+用于图像光盘

ey-Flp TSC1：

y w ey-flp玻璃-lacZ;TSC1类29FRT82B型/FRT82B，带+第3类

TSC2突变克隆：

yw hsp-flp;TSC2系统192FRT80B型/FRT80B、Ubi-GFP+用于图像光盘

TSC1 TSC2双突变克隆（以y标记-):

y w热休克蛋白flp;TSC2系统192FRT80B TSC1型29/年+P[TSC1+]FRT80B TSC1型29成人翅膀

TSC1 Akt双突变克隆（以w标记-):

y w hsp-flp;FRT82B Akt公司q个TSC1类29/FRT82B带+适合成人眼睛

双突变克隆中的TSC1（标记为w-):

y w hsp-flp;FRT82B TSC1型29内部35/FRT82B带+适合成人眼睛

PTEN突变克隆（以w标记-):

y w hsp-flp;PTEN公司dj189型FRT40A型/FRT40A，年+w个+适合成年人

TSC1 PTEN双突变克隆（以w标记-):

y w hsp-flp;PTEN公司dj189/PTEN公司dj189型; FRT82B TSC1型29/FRT82B带+P[私人+]用于成人眼睛

细胞转染和免疫沉淀

S2细胞通过磷酸钙法（Invitrogen）转染。细胞在冷免疫沉淀缓冲液（1%Triton X-100，0.5%NP-40，150mM NaCl，10mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，1mM EGTA，0.2mM PMSF）中溶解。根据制造商的说明，使用抗Myc抗体（Santa Cruz Biotechnology）和蛋白G Sepharose进行免疫沉淀。

流式细胞术

如前所述，对分离的想象翼盘细胞进行FACS分析(Neufeld等人，1998年).TSC1类或TSC2系统由FLP/FRT介导的重组诱导的纯合突变克隆通过使用泛素GFP-FRT染色体（由Bruce Edgar捐赠给Bloomington股票中心）来标记其缺乏GFP表达。FACS分拣在FACStar机器上进行，并使用CellQuest程序进行分析。

组织学和显微镜

通过FLP/FRT介导的有丝分裂重组产生突变细胞克隆(徐和鲁宾1993). 按照以下描述对影像盘进行免疫染色徐和鲁宾（1993）抗纤维蛋白抗体是John Aris的礼物(Aris和Blobel 1988). 使用蔡司LSM 510共焦显微镜采集共焦图像，并使用LSM 510.软件进行分析。在配备AxioCam数码相机的蔡司Axioplan显微镜上采集光显微图像，并使用Axiovision软件进行分析。

致谢

我们感谢Elizabeth Chen、Jin Jiang和Keith Wharton对手稿的批判性阅读。我们还感谢布鲁明顿库存中心、发育研究杂交瘤银行、Manfred Frasch、Naoto Ito和John Aris提供的苍蝇库存和试剂，以及UT西南分子和细胞成像设施提供的眼部切片帮助。D.J.P.是弗吉尼亚·默奇森·林希库姆（Virginia Murchison Linthicum）医学捐赠学者，由NIH（GM62323）和AHA（0130222N）资助。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件ude.demws.tendem@napd; 传真：（214）648-8885。

文章和出版物见www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.901101。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社