包括PG9、PG16和VRC01在内的广泛中和抗体对流行早期和晚期新近传播的B亚型HIV-1变异株的活性^▿

摘要

简介

人们普遍认为，控制艾滋病流行的最有效方法是使用疫苗，以防止人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染(14). 对大多数病毒而言，由现有疫苗引发的中和抗体（NAbs）与保护作用相关(2,34). 被动免疫被证明可以在猕猴模型中提供对猴免疫缺陷病毒（SIV）感染的保护(三,19,27,28,33,49)，表明预先存在的体液免疫也可能能够预防HIV-1感染。然而，HIV-1分离株的巨大序列变异性阻碍了基于NAb的有效疫苗的开发。因此，疫苗设计的一个重要重点是识别和表征抗体特异性，这些抗体能有效对抗目前流行的大多数HIV-1变异体，以便将其表位用于免疫原设计(9). 然而，在免疫原中模拟交叉反应中和抗体表位的成功率非常有限(29).

在天然HIV-1感染期间，直到传播后大约2个月或更晚，才能检测到针对自体病毒株的NAbs(1,11,16,31,32,36,37,45,51). NAbs延迟发展的两个因素是CD4的大量耗竭⁺急性HIV-1感染时T细胞与肠道生发中心的破坏(25,48). 生发中心的早期丢失可能会影响早期高亲和力HIV-1特异性NAb的生成。然而，相当大比例的HIV感染者（～30%）在感染2至3年后能够对多种异源HIV-1变体产生NAb反应(12,13,41). 迄今为止，已从这些人中分离出几种具有广泛HIV特异性中和活性的罕见有效单克隆抗体（MAb）。

直到最近，只有少数具有相对亚型特异性中和模式的广泛中和抗体（BrNAbs）被鉴定出来：CD4结合位点定向MAb b12、聚糖结合MAb 2G12和gp41定向MAb 2F5和4E10(5). 虽然对猕猴的研究表明，这些单克隆抗体的低滴度足以阻止感染(19,20,21)研究表明，一些病毒对多种BrNAb的中和具有抵抗力(5,8,35). 因此，我们可以假设，这些抗体特异性太窄，无法对全球HIV-1产生保护性免疫。相比之下，最近发现的单克隆抗体PG9和PG16主要与病毒包膜三聚体第二可变环上的四元表位结合(50)以及针对CD4结合位点的MAb VRC01(54)与早期BrNAbs相比，显示出极大增强的中和广度和效力。

在之前的一项研究中，我们报告说，在疫情过程中，HIV-1对抗体中和产生了更强的抵抗力(7). 在该研究中，与从疫情早期血清转化个体分离的病毒相比，从近年血清转化个体中分离的HIV-1变体对多克隆抗体（即人血清和HIV-Ig）和MAb b12的敏感性降低，但对MAb 2G12、2F5或4E10的敏感性不降低。我们在这里通过研究HIV-1对抗体中和的适应是否也影响最近鉴定的BrNAbs PG9、PG16和VRC01的中和活性来扩展这些发现。此外，我们对目前已知的BrNAbs（b12、2G12、2F5、4E10、PG9、PG16、VRC01）和TriMab（b12，2G12和2F5的1:1:1混合物）对抗来自当代血清转化者的最近传播的HIV-1变体的广度和效力进行了全面概述。我们的结果表明，虽然HIV-1在疫情过程中对CD4结合位点直接中和（CD4 binding site directed neutralization）和PG16（PG16）的中和（neutraility）具有更强的抵抗力，但所有病毒变体都对至少一种测试的BrNAbs敏感。我们的观察结果表明，疫苗需要引发具有多种特异性的广泛中和抗体，以抵御目前流行的绝大多数HIV-1毒株。

材料和方法

结果

通过广泛中和抗体PG9、PG16和VRC01中和来自历史和当代血清转化者的新近传播的HIV-1变体的敏感性。

为了扩展我们之前的观察结果，在20年的过程中，HIV-1对BrNAb b12、HIV-Ig的中和作用变得更具抵抗力(24)和来自HIV-1感染者的个人血清，我们测定了历史和当代血清转化者最近传播的HIV-1变异体的敏感性(表1)通过最近鉴定的BrNAbs VRC01、PG9和PG16进行中和。HIV-1克隆变异体是从疫情早期感染者（1985年至1989年间的血清转化[SC][历史血清转化者]）和最近几年感染者（2003年至2006年间的血清转变者]）中获得的。为了防止强烈的自体体液免疫反应对HIV-1变异体中和敏感性的潜在影响，我们仅使用在SC6个月内获得的克隆病毒。

与我们之前的观察结果一致，HIV-1在日历时间内和人群水平上对CD4结合位点定向中和活性变得更具抵抗力，我们观察到CD4结合部位定向抗体VRC01的中和敏感性显著降低(图1A） 来自历史和当代血清转化者的HIV-1变异体之间。由于VRC01的可用性有限，与当代血清转化者的数量相比，对少数历史血清转化者中的病毒进行了这种抗体的检测，但我们在之前的研究中仍然包括了对b12和HIV Ig进行检测的所有个体的病毒变体(7). 虽然历史血清转化者的所有病毒和当代血清转化者中的大多数病毒变种对VRC01在浓度低于5μg/ml时的中和作用敏感，但病毒复制抑制率（IC₅₀)与历史血清转化者病毒相比，当代血清转化者的病毒增加了约10倍。与CD4结合位点导向抗体b12和VRC01的结果相平行，目前流通的病毒变体中增加的比例似乎对PG16的中和具有抵抗力(图1B和C）。中间IC₅₀来自历史和当代血清转化者的病毒的PG9的s没有显著差异，而PG16的中和抗性有增加的趋势(P（P）= 0.053) (图1B和C）。

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图1。

历史和当代HIV-1变体对最近鉴定的广泛中和抗体中和的敏感性。对1985年至1989年或2003年至2006年间通过单克隆抗体VRC01（A）、PG9（B）和PG16（C）进行血清转化的个体在初次感染期间分离出的克隆HIV-1变体进行中和。每个数据点显示50%抑制浓度（IC）的几何平均值₅₀)来自一个血清转换器的所有病毒变体(n个=1至14）。水平条表示中间IC₅₀每个组的所有患者。使用Mann-Whitney评估各组之间的差异U型测试。水平虚线表示测试的最高抗体浓度。SC，血清转化。

HIV-1包膜糖蛋白的分子变化可能影响对VRC01、PG9和PG16的敏感性。

研究HIV-1对VRC01中和敏感性在日历时间内的降低是否可以用病毒包膜分子特征的变化来解释，如前所述，对来自历史和当代血清转化者的gp120病毒序列与CD4和VRC01的已知残余接触进行了比较(54) (图2A） ●●●●。尽管在这些位点观察到各种氨基酸取代，但病毒对VRC01中和的敏感性与某些氨基酸的存在或不存在之间没有明确的相关性。较长的V5循环与VRC01的中和抗性增加有一定相关性（斯皮尔曼第页= 0.037,P（P）=0.041），但历史和当代血清转化者的HIV-1变异体的V5区长度没有差异。然而，来自当代血清转化者的病毒似乎在V5环下游有更多的替代物。

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图2。

突变可能影响历史和当代血清转化病毒中PG9和/或PG16和VRC01中和敏感性。对于每个个体，几何平均值（GM）IC₅₀PG9和PG16（A）以及VRC01（B）是所有病毒变体中的一种。集成电路₅₀s是彩色编码的，用越来越深的颜色表示中和敏感性的增加。与参考序列HXB2的序列差异显示了病毒包膜中先前显示影响PG9和/或PG16中和敏感性的那些位置(50)以及与CD4和VRC01逐个残基接触(54). 对于PG9和PG16，160N的正负号分别表示该位置存在或不存在潜在的N-连接糖基化位点。（A） 粗体显示的位置处的丙氨酸替换显示增加了IC₅₀PG9和/或PG16增加了150倍以上，而剩余位置的替换将IC增加5到40倍₅₀s.标有星号的位置主要影响对PG16中和的敏感性。（B） 对于VRC01的敏感性，gp120与VRC01和CD4的接触分别用一个和两个星号表示，而粗体位置表示与VRC02和CD4相互作用。

如前所述(50)，V2区160位处无潜在的N-连接糖基化位点，这与在测试的最高抗体浓度（1μg/ml）下对PG9和PG16中和的抗性一致(图2B） ●●●●。此外，在先前报道的影响HIV-1对这两种抗体中和敏感性的位置观察到多个氨基酸替换(50) (图2B） ●●●●。虽然我们无法确定某些突变的存在与病毒对PG9和PG16介导的中和作用的敏感性之间的关联，但在当代血清转化者病毒的这些位置观察到的突变比历史血清转化者的病毒更多，这可能解释了观察到的PG16中和抗性增加的趋势。

历史和当代血清转化病毒之间的遗传关系。

这里观察到的来自历史和当代血清转化者的病毒之间中和敏感性的差异可能因我们当地队列中病毒之间相对紧密的遗传关系而有偏差。历史血清转化者病毒的多样性低于当代血清转化者的病毒（分别为6.2%和13.2%；P（P）<0.0001），但反映了在这些时间范围内分离出的全球B亚型HIV-1病毒多样性的变化（分别为7.2%和12.9%；P（P）< 0.0001). 此外，使用邻接法进行的系统发育分析也没有支持来自历史或当代血清转化者的病毒聚类(图3)或最大似然法（数据未显示），但五名当代受试者（P195、P004、P151、P197和P019）除外。然而，该群集中的病毒对VRC01（IC）都表现出广泛的中和敏感性₅₀范围在0.05和2.02μg/ml之间）和PG9/PG16（IC₅₀范围在<0.02到>1μg/ml之间），表明这些病毒之间的遗传相关性不能预测中和谱的相似性。

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图3。

历史和当代血清转化病毒之间的遗传关系。将来自历史（填充方块）和当代（开放方块）患者的gp120序列与1985年分离的无关B亚型病毒（BaL[灰三角]）作为外群进行比对。节点上的双星号表示100%的引导值，而单星号表示70%或更高的引导值，在所有情况下也高于90%。

针对新近传播的当代HIV-1变异株的广泛中和抗体活性的比较。

我们的观察结果如本文和之前的研究所述(7)表明HIV-1的中和敏感性随着时间的推移而降低，但仅限于某些抗体特异性。为了更好地理解目前已知的广泛中和抗体中和目前流行的最近传播的HIV-1变体的潜力，我们比较了BrNAbs b12、2G12、2F5、4E10、PG9、PG16，VRC01和TriMab抗HIV-1变异体，这些变异体是在原发性HIV-1感染期间从当代血清转化者中分离出来的。

为了找到中和活性的模式，我们基于中间IC进行了聚类分析₅₀每一个广泛中和抗体的患者的所有病毒变异。分析结果显示为热图(图4). 根据患者对PG9和PG16中和的敏感性，将其分为两组，与其余BrNAbs相比，PG9和PG16具有最强的中和能力。这两种抗体的活性密切相关（斯皮尔曼第页= 0.88,P（P）<0.0001[数据未显示]），除P153外，所有患者的病毒对PG9和PG16均具有耐药性或敏感性。然而，所有对PG9和PG16中和有抵抗力的病毒都被两个或多个其他测试的BrNAbs中和。

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图4。

在原发性HIV-1感染期间，从当代血清转换器中分离的针对HIV-1变体的广泛中和抗体的中和活性的热图和聚类分析。每行显示中间IC₅₀每个个体的所有病毒变异(n个=21）对于七个BrNAb和TriMab（按列排列）。较深的颜色表示较强的中和活性，而最浅的颜色表示在测试的最高抗体浓度下未观察到中和作用。颜色键值在日志中的范围为0.008μg/ml（黑色）到25μg/ml（白色）₁₀如图左上角所示。患者病毒根据其中和敏感性进行分组，如图左侧树状图所示，而BrNAbs则根据其中和活性进行聚类，如图顶部树状图中所示。标有负号或加号的方框表明，该个体至少有一种病毒变种在测试的最高浓度下抵抗（−）或对相应BrNAb的（+）中和敏感。

与其余BrNAbs相比，VRC01和4E10的中和活性最为广泛，因为除P013和P004外，所有患者都有对VRC01中和和4E1O敏感的HIV-1变异体。相反，相对较大比例的患者携带对2G12和/或b12中和有抵抗力的病毒，因此2G12与b12与其他抗体分开聚集。有趣的是，2G12和b12的中和活性曲线与TriMab的几乎没有相似之处。相反，TriMab与2F5的中和相关性最高（Spearman第页= 0.46,P（P）<0.0001[数据未显示]），表明2F5可能在很大程度上负责抗体鸡尾酒的中和活性，至少对这组病毒是如此。此外，TriMab和2F5也与4E10聚集，这很可能是这些gp41定向抗体表位近端定位的结果。

随着HIV-1在疫情过程中对中和作用的抵抗力越来越强，出现了这样一个问题，即一种能够单独或联合诱导当前已知抗体特异性的疫苗是否足以抵御当前流行的HIV-1毒株。如热图所示(图4)，在测试的抗体浓度下，没有一种测试病毒对所有抗体都具有耐药性；事实上，大多数病毒变体对多种抗体敏感。然而，在1μg/ml的低浓度下，19%的病毒变体对所有七种BrNAbs都具有耐药性（数据未显示）。

讨论

最近发现了极为广泛和有效的HIV-1中和抗体，部分具有新的表位特异性，为基于NAb的HIV-1疫苗的开发提供了希望。然而，我们最近描述了一个事实，即在20年的疫情过程中，HIV-1对抗体中和的抵抗力更强(7). 因此，在我们目前的研究中，我们分析了目前已知的大多数BrNAbs的中和活性，尤其是最近发现的抗体PG9、PG16和VRC01，这些抗体针对历史血清转化者和近期血清转化者初次感染期间分离出的HIV-1变体。

与来自历史血清转换器的HIV-1变种相比，从当代血清转换器分离的病毒对VRC01中和的敏感性降低，这证实了我们之前的观察，即HIV-1对CD4结合位点导向的中和活性（包括b12中和）具有更强的抗药性。有趣的是，VRC01和b12对我们的病毒组的中和活性谱在我们的热图分析中没有聚集(图4)和不相关（数据未显示），这表明对这些抗体中和的抵抗可能是由不同的机制赋予的，正如之前其他人所建议的那样(52,54). 在我们之前的研究中(7)我们观察到，HIV-1的中和抗性增加与V1区域更长和相同区域中更多潜在的N-连接糖基化位点（PNGS）一致。这些较长的V1环可能被选择来掩盖潜在的表位或立体阻碍中和抗体进入CD4结合腔。除了CD4结合区外，V5环还参与与VRC01的相互作用，并位于抗体的重链和轻链之间(54). 从当代血清转化病毒中观察到的V5下游的更多突变可能因此影响VRC01的结合。然而，gp160的残基突变与CD4和VRC01接触(54)很可能无法完全解释历史和当代血清转化病毒中和敏感性的观察差异。此外，我们无法在特定氨基酸位置（如D368、E370或I372）发现关键突变。

除CD4结合位点导向抗体外，HIV-1对PG16中和的敏感性似乎有所降低，这与之前描述的干扰PG9和/或PG16中和作用的HIV-1 Env突变积累相一致(50). 这种群体水平的突变积累可能是PG9和PG16类抗体选择压力的直接结果。因此，这一观察结果可能表明，具有PG9-和/或PG16-样特异性的抗体在相当大比例的HIV-1感染个体中引发，或者这些逃逸突变在具有这些抗体特异性的罕见个体中被选择，随后由于一种称为补偿固定的机制而被固定(46). 另外，在抗体表位上的PG9-和PG16-类抗体没有直接选择压力的情况下，HIV-1对PG9和PG16的中和敏感性可能发生变化。选择较长的V1环来掩盖CD4结合位点对中和抗体的接触可能同时降低了HIV-1对PG16中和的敏感性。

尽管HIV-1在人群水平上对抗体中和的抵抗力增加，但新发现的BrNAbs PG9、PG16和VRC01对目前流行的、最近传播的亚型B HIV-1变异体显示出非凡的中和广度和效力。这三种BrNAb在浓度低于1μg/ml的情况下，能够中和我们当代血清转换器队列中87%的所有病毒变体。另一种最近发现的中和抗体，HJ16(10)也进行了测试，但发现对历史和当代血清转化者的HIV-1变异体具有非常有限的中和作用（中位IC₅₀s、 ～20μg/ml），因此不包括在本研究中。对于PG9和PG16，本研究中在1μg/ml浓度下中和的病毒百分比与报告的这些BrNAbs对B亚型HIV-1的中和活性一致(50). 相反，集成电路上的VRC01₅₀≤1μg/ml中和了本研究中病毒变异体的比例（33%）小于之前分析的B亚型HIV-1变异体组（80%）(52). 在Wu等人的研究中(52)用假病毒在TZMbl细胞中测试了对VRC01的80%中和敏感性，在基于PBMC的分析中，已知假病毒比主要病毒对中和更敏感(15); 然而，他们还在基于PMBC的分析中测试了较小的B亚型病毒群，并在这些分析中发现VRC01的中和敏感性相当。这种差异可能反映了与Wu等人可能使用过的来自历史血清转换器的病毒变体相比，来自当代血清转换器的HIV-1变体对VRC01的中和抗性增加。本研究中显示的整体中和敏感性仅适用于来自当代血清转化者的HIV-1变异体，因为这些变异体与当前流通菌株相关。然而，在历史血清转化者的HIV-1变种中，VRC01的中和敏感性与Wu等人报告的相似。然而，值得注意的是，本研究中分析的另外30%的当代病毒变种在抗体浓度为1至5μg/ml时被VRC01中和，这表明，来自当代血清转化者的相当大比例的相对中和抗性HIV-1变体仍然对VRC01中和敏感，尽管抗体浓度较高。由于我们在分析中只包括了B亚型变异体，我们无法得出关于这三种BrNAbs对其他HIV-1亚型的活性的任何结论。此外，尽管我们观察到一些非链B型HIV-1变异体包膜中的分子变化与疫情日历期间抗体中和抗性增加相一致(7)在疫情过程中，非亚型B型HIV-1的中和抵抗力是否发生了变化，变化程度如何，仍有待确定。然而，鉴于不同亚型中PG9、PG16和VRC01的中和广度(50,52)很可能这些BrNAbs继续对来自不同亚型的HIV-1变异体表现出广泛而有效的中和活性。

与新鉴定的BrNAbs PG9、PG16和VRC01相比，早期鉴定的BrNA bs b12、2G12、2F5和4E10仅对当前流通的、最近传播的HIV-1变异体产生中度中和广度和效力。与先前的研究一致，靶向gp41、2F5和4E10中MPER区域的BrNAb显示出最广泛的中和活性(23)而CD4结合位点定向的BrNAb b12的中和能力最窄(30,38). 这些结果似乎强调了这样一种观点，即HIV-1在人群水平上增加的中和抵抗力是CD4结合位点定向中和活性的特异性，正如我们之前观察到的，对2F5-和2G12-介导的中和的抵抗力并没有随着时间的推移而增加，而随着时间的推移，对4E10介导的中和反应的抵抗力甚至可能下降(7).

尽管来自同一个体的病毒变体的中和敏感性水平通常相似，但对于来自某些个体的病毒，观察到对某些抗体中和的敏感性存在显著差异。这是意料之外的，对于每个单独的病毒，在感染后早期从同一时间点分离出变体，并显示出有限的序列多样性（gp120序列内的多样性≤1.0%）。我们的研究结果可能表明，病毒包膜的微小变化可能导致广泛不同的中和敏感性，这加强了抗体应该对感染具有完全保护作用的观点，因为即使在感染的初级阶段也可能发生导致中和抗性的变化。事实上，在急性HIV-1感染患者中，已观察到传播/创始病毒从自体血清中和中立即逃逸(3a年). 在本研究中，历史患者在血清转化后第一次就诊时分离出病毒，这比当代血清转化者的病毒平均晚1.4个月。然而，鉴于最早的自身中和抗体反应的广度有限，主要针对病毒包膜的可变区域，采样时间点的差异似乎不太可能对病毒通过广泛中和抗体中和的相对敏感性产生重大影响。因此，我们认为，尽管所研究的病毒可能与这些人中传播或创始的病毒不同，但其中和敏感性可能仍与得出有关疫苗设计的结论有关。

在缺乏保护相关性的情况下，尚不清楚疫苗应产生何种抗体滴度，以提供对HIV-1感染的保护。然而，具有广泛中和活性的有效抗体反应似乎是最理想的。尽管在疫情过程中，HIV-1对某些抗体特异性的中和抗性增加，但本研究中测试的所有病毒变体对浓度低于5μg/ml的至少一种BrNAb敏感。然而，赋予最强中和活性的抗体特异性因病毒变体而异，表明针对HIV-1的疫苗最有可能诱导靶向病毒包膜的各个区域的中和抗体，以实现最大的保护。目前已知的BrNAb特异性可能足以对所有全球传播的HIV-1变体提供保护，尽管可能需要额外的抗体特异性来处理对目前已知BrNAb相对耐药的病毒变体。幸运的是，通过对大量人群进行精英中和活性筛选，发现了更有效的BrNAbs，如VRCPG04，其与CD4结合位点结合，中和宽度与VRC01相似(第23页). 此外，从IAVI方案G队列中分离出13种额外的抗体，其中一些抗体的效力和广度甚至比PG9和PG16更强(50安). 随着这些新出现的有效BrNAbs的出现，更多可能包含在多价HIV-1疫苗中的表位正在被确定。

总之，我们已经表明，在疫情过程中，HIV-1对CD4结合位点导向抗体（包括新发现的有效BrNAb VRC01）的耐药性越来越强，并且可能已经演变为对可变导向抗体PG16的耐药性增加。然而，尽管中和抗性增加，但目前流通的HIV-1菌株对低浓度的多个BrNAbs敏感，特别是对最近发现的BrNAbs。面对20年来不断变化的HIV-1形势，需要具有特殊中和宽度的有效抗体来靶向病毒包膜的多个部位，以实现杀菌免疫。

致谢

脚注

参考文献