简介
为了进入宿主细胞，大多数动物病毒利用细胞提供的内吞机制(23,39). 渗入细胞溶质通常发生于内胚体，通常由低腔pH值触发。然而，也有一些病毒偏离了这一标准路线。这些病毒包括多瘤病毒家族的成员，如小鼠多瘤病毒（mPy）和猴病毒40（SV40）。这些病毒是在细胞核中复制的非包膜DNA病毒。随着发现的人类多瘤病毒数量的增加，该病毒家族的兴趣和重要性迅速增长。最近发现的人类病原体包括KI多瘤病毒（KIPyV）、WU多瘤病毒和默克尔细胞多瘤病毒(1,17,20). MCPyV和侵袭性神经内分泌皮肤癌Merkel细胞癌相关。
大多数多瘤病毒与细胞表面的神经节苷脂结合，并内化到没有网格蛋白外壳的小而紧密的囊泡中(26,28,30,34,55,59). 它们不是利用内体进行穿透，而是进入内质网（ER）的内腔，在内质网中，它们被内腔巯基氧化还原酶和伴侣蛋白激活，然后再穿透细胞质或可能直接进入核质(28,37,46,53).
在这项研究中，我们重点关注SV40，一种与GM1结合并通过小窝/脂筏依赖性内吞机制内化的病毒(2,11,45,57,59). 一些病毒颗粒通过小窝被内吞，另一些通过平行的网格蛋白和小窝蛋白依赖机制进入。摄取缓慢且不同步，在最初的内吞作用后数小时内转移到内质网并穿透内质网膜(53).
SV40究竟在哪里度过了干预时间尚不清楚。与靶向ER的细菌毒素（如霍乱毒素和志贺毒素）不同，在反式-高尔基网络或高尔基复合体的水池。通过共焦显微镜和电子显微镜在早期内体（EE）中可以看到其中一些(28,42). 我们还报道了进入的SV40颗粒在所谓的“小窝小泡体”中的堆积，我们将其定义为大的小窝蛋白-1阳性、pH-中性、无转铁蛋白和其他EE标记物的内吞细胞器(44). 我们对这些细胞器中的病毒的观察使我们提出了一个模型，根据该模型，小泡体途径允许传入的SV40在从质膜到内质网的转运过程中绕过经典的内质体(44). 然而，我们最新的结果表明，小窝小泡体不是独立的细胞器，而是修饰的晚期内体（LE）或内溶体，小窝蛋白-1在过度表达或干扰小窝组装后积聚在其中(25).
根据这些发现，SV40之后的细胞内贩运途径需要重新评估。为了分析传入病毒的传播和感染途径，在这项研究中，我们使用了多种技术，这些技术允许在病毒进入细胞的不同阶段对病毒进行可视化、跟踪和定位，在这些阶段病毒的小泡组装不受干扰。实验包括活细胞的视频显微镜、电子显微镜（EM）以及各种小干扰RNA（siRNAs）和药物抑制剂形式的干扰剂。避免影响晚期内体可视化的固定伪影(25)，许多实验是用活细胞进行的。这些结果提供了感染病毒所遵循的细胞内途径的详细图片，并导致对我们之前的SV40进入模型的彻底修改。
材料和方法
细胞培养。
Lucas Pelkmans提供了人宫颈癌（HeLa CNX）细胞(43)和非洲绿猴肾细胞（CV-1）购自美国型培养物收藏。Caveolin-1敲除小鼠肺成纤维细胞（Caveolin-1KO细胞）如前所述(12). 细胞保存在补充有10%胎牛血清（FCS；Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。
质粒、抗体和其他试剂。
由Marino Zerial提供的Rab5a、Rab7和Rab9表达质粒先前由Sonnichsen等人、Vonderheit和Helenius亚克隆(56,62). Rab5Q79L之前有描述(42). LAMP1增强型绿色荧光蛋白（EGFP）由Jean Gruenberg（日内瓦大学）提供，Hrs-EGFP由Harald Stenmark提供(48)，大鼠DNM2（aa）-EGFP和大鼠DNM1（aa）K44A-EGFP由Mark McNiven提供(8).
小鼠抗LAMP1抗体（sc-18821）购自Santa Cruz Biotechnology；小鼠抗EEA1、抗caveolin-1和抗DNM2从BD Transduction Laboratories获得（目录号BD-610457）；从Sigma中获得小鼠抗β肌动蛋白（A1978）、抗Rab4、抗Rab2和抗NEDD4L。小鼠抗纤毛和抗埃兹林/绒毛膜抗体来自细胞信号技术。小鼠抗T抗原抗体1605是在内部生产的，用Alexa Fluor 647（AF647）、AF594和AF488标记的抗小鼠二级抗体是从Invitrogen获得的。所有化学品均购自Sigma-Aldrich。
SV40净化。
病毒纯化方案基于上述内容(10,15). 简言之，猴肾CV-1细胞在37°C、5%CO的完全培养基（DMEM[Gibco]补充10%FCS[LabForce，Nunningen，Switzerland]和4 mM GlutaMAX）中培养2在不添加添加剂的DMEM中，以0.01的感染倍数（MOI）感染了40个T175烧瓶的CV-1亚流细胞。细胞在完全培养基中培养14天。为了采集病毒，将细胞进行三次冻融循环，然后在10000×克在4°C下保持10分钟。将20毫升含病毒上清液装入10毫升CsCl缓冲液（1.4 g ml）中−1)在10 mM HEPES中（pH 7.4）。76000×离心后克在SW28转子（Beckman）中4°C下放置3小时，在CsCl缓冲垫中收集带状病毒。检查含有SV40的CsCl组分的密度，并在10 mM HEPES（pH 7.4）中将该组分调整为1.34 g/ml的CsCl密度。在100000×克在70.1 Ti转子（Beckman）中，在4°C的温度下，分离低病毒带16小时，并用含有50 mM HEPES（pH 8.0）、150 mM NaCl和1 mM CaCl的溶液进行透析2（病毒缓冲区）。将纯化的感染病毒保存在−80°C的小份中。
SV40的荧光标记。
荧光标记程序如前所述(44). 如前所述，经修饰的SV40病毒能够结合、进入并感染CV-1细胞(44).
SV40感染。
将6孔板或12孔板中的CV-1细胞在37°C、5%CO的接种培养基（含有50 mM HEPES缓冲液[Invitrogen]和0.5%牛血清白蛋白[BSA；Fluka][PH6.8]的R培养基[Gibco]）中感染SV402MOI为1时持续2小时，导致20%至30%的感染，或MOI为5时，导致30%至50%的感染。随后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）洗涤细胞，并在37°C、5%CO中用10%FCS维持在DMEM中2再持续22小时，直到用4%甲醛在PBS中固定20分钟。将细胞透化，标记SV40 T抗原表达，并进行荧光激活细胞分选仪（FACS）分析。
对于药物抑制剂的实验，细胞在添加病毒前一小时和感染期间与相应的药物（样品）或溶剂单独培养（对照样品）。药物使用浓度如下：0.2 mM金雀异黄素溶于二甲基亚砜（DMSO）（Calbiochem），5μM诺卡唑溶于DMSO（Sigma），100 mM原钒酸盐（OV）溶于H2O（西格玛），DMSO（西格马）中0.5μg/ml布雷费尔丁A（BFA），DMMO（西格马）中80μM达纳菌素，100 nM巴非霉素A1DMSO（Fluka）中的（Baf），H中的10μM莫能菌素2O（西格玛），20 mM NH4H中的Cl2O（西格玛）和在DMSO（西格玛）中的100nM冈田酸（OA）。NH时，用50 mM HEPES额外缓冲培养基（pH 7.4）4使用了Cl(29).
FACS分析。
对于FACS分析，用4%甲醛在PBS中固定细胞，渗透（0.1%[wt/vol]皂苷、2%FCS、20 mM EDTA和0.02%NaN三在PBS中），用一级抗体在室温（RT）下染色2小时（小鼠抗T抗原[1:100]），然后用Alexa Fluor 647标记的山羊抗鼠IgG（1:500；Invitrogen）在室温下染色45分钟。使用CellQuest 3.1软件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）用FACSCalibur细胞仪分析细胞。每个样本至少分析10000个细胞。
转染、亚细胞定位、免疫染色和显微镜检查。
为了进行定位研究，使用Amaxa电穿孔系统将2μg质粒DNA瞬时转染CV-1细胞，编码荧光标记的蛋白质版本，并将其放入带有盖玻片或8孔玻璃底室的12孔培养皿中。在培养12h后，将荧光标记的SV40（～10的MOI）添加到细胞中冰上1h，洗去未结合的病毒，并在37°C下用倒置蔡司200 M旋转圆盘显微镜在加热后的不同时间点对表达少量XFP标记融合蛋白的细胞进行活成像，氩/氪和氦/氖激光器、带100×1.47数字孔径（NA）物镜的哈马松C9100-13电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）相机，以及使用变形金刚（分子器件）或倒置蔡司激光扫描共聚焦显微镜（510Meta型）的温控孵化室；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）配备加热装置、100×Zeiss复消色差物镜（1.4 NA）、30 mW的氩激光器（458、477、488和514 nm）、1 mW的HeNe激光器（543 nm）或5 mW的氦氖激光器（633 nm）。
为了用AF488-右旋糖酐装载细胞，CV-1细胞被镀入8孔玻璃底室。在培养12h后，在37°C下添加AF488-右旋糖酐（目录号D-22910；Invitrogen）4h。将细胞清洗并在37°C下再培养20 h，然后将荧光标记的SV40-AF647（MOI为～10）添加到细胞中冰上1 h。将未结合的病毒洗掉，将细胞再培养4小时，然后在37°C下用上述显微镜设置进行活体成像。
对于与荧光病毒孵育后的细胞蛋白的免疫荧光检测，细胞用4%甲醛溶液固定在PBS中，并在含有3%BSA（wt/vol）和0.05%（wt/vol）Triton X-100（TX-100）的PBS中渗透，以用抗EEA1（1:500）染色或用含有0.1%（wt/vo）的PBS渗透皂苷和3%牛血清白蛋白用抗LAMP1（1:200）抗体染色，然后用与AF488、AF594或AF647（Invitrogen）偶联的二级抗体染色。使用ImmuMount（Thermo Shandon）安装样品，并使用蔡司LSM 510 Meta共焦显微镜系统进行成像。使用Image J（美国国立卫生研究院）或Adobe Photoshop（Adobe Systems）处理图像。
固定细胞和活细胞共定位的量化。
通过使用倒置蔡司200M旋转圆盘显微镜（如上所述）采集单个共焦切片，对表达XFP标记结构的活CV-1细胞中病毒的共定位进行量化并使用基于MATLAB的共定位程序分析图像（Peter Horvath，苏黎世理工大学光学显微镜中心）。如果至少50%的病毒与标记重叠，并且标记信号在病毒下方同时显示出明显的局部最大值，程序认为病毒与给定标记共定位。使用配备有倒置Olympus IX80显微镜的CellR宽视野显微镜系统拍摄的图像，使用100×1.47-NA油UplanSApo物镜，定量病毒与LAMP1和EEA1在固定细胞中的共定位。样品用氙灯（MT20 CellR装置）照明，并用哈马松Orca ER相机记录。五z（z）对每个细胞进行叠加，并使用基于MATLAB的共定位程序对强度进行投影和分析。
使用Metamorph软件（Molecular Devices）、LSM 510软件包（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）或制造商提供的CellR软件版本，在相同的显微镜设置下采集一个实验中的所有样品。
内化分析。
将SV40-AF488（～10的MOI）添加到CV-1细胞中，转染Rab7-单体RFP（mRFP）以在冰上观察细胞边界1小时。随后，在5%CO存在下将细胞加热至37°C2在37°C、5%CO的条件下，对活细胞在加温后4小时记录染料的荧光信号2使用配备有高灵敏度Hamamatsu C9100-13 EM-CCD相机的蔡司200 M旋转圆盘共焦显微镜。对于对照样品，在冰上培养10分钟后在室温下拍摄图像。A类z（z）取至少5个细胞，每片厚度为0.5μm。以1:50的稀释度添加台盼蓝（0.4%[wt/vol]；Invitrogen）后，立即改变了暴露在细胞表面的粒子的发射光谱，并导致505-530-nm通道中的可检测荧光损失。将荧光图像导出为12位标记图像文件格式（TIFF）文件并进行合并，用图像J（NIH）投影最大强度，并用MATLAB中实现的自定义共定位程序进行量化（Peter Horvath，苏黎世联邦理工大学光学显微镜中心）。
电子显微镜。
对于薄片EM，将CV-1细胞镀到12-mm盖玻片上，在37°C的R培养基中用100 nM Baf或5μM诺卡唑或在没有药物的情况下用SV40（MOI为200）培养2或4小时，然后用2.5%戊二醛固定（用0.05 M碳酸钠[pH7.2]、50 mm KCl、1.25 mm MgCl2和1.25 mM CaCl2)在室温下保温60分钟，然后在2%OsO中保温1.5小时4在冰上。如前所述进行脱水、包埋和薄片切割(28). 对于阴性染色，0.4-μm网格铜网格涂有4-nm碳膜。添加含有0.5 mg/ml SV40的10μl样品30 s，排出多余液体，并在蒸馏水中用2%乙酸铀酰再染色30 s。在透射电子显微镜（蔡司EM 91显微镜）之后，图像被导出为8位TIFF文件。
RNAi屏幕。
利用siRNAs对108个编码蛋白质的选定基因进行SV40感染的RNA干扰（RNAi）筛查，这些蛋白质在氯氰菊酯依赖性和非依赖性内吞、信号传递、内吞膜运输以及细胞骨架组织中起作用。
HeLa细胞在96周的黑色光学底板（Nunc）中独立转染，每个基因有三个不重叠的靶向siRNA（Qiagen）（见补充材料中的表S1），每个siRNA一式两份，并在两个独立实验中转染。为了监测转染效率，在每个平板中使用导致细胞死亡的siRNA（Hs_KIF11_6；Qiagen）(66). 添加AllStarsNegative siRNA作为非靶向对照，每板四胞胎。为了避免最外层的孔中细胞分布不均匀，只使用了96 well板的内部60个孔，而最外层的36个孔中填充了介质。
根据反向转染方案进行转染。简言之，siRNA（最终浓度为20 nM）和Lipofectamine RNAiMAX（最终稀释度为1:1000；Invitrogen）在Opti-MEM（Invitrogen）中预先稀释，在96周的平板上发现，并在RT下培养至少10分钟，以形成siRNA-lipid复合物。将补充有10%FCS和GlutaMAX（Invitrogen）的DMEM中每孔共1300个HeLa细胞添加到脂质siRNA复合物中，并在37°C下培养72小时。AllStarsDeath阳性对照孔中细胞分布不均匀或细胞死亡不足的平板被丢弃。
用PBS清洗细胞一次，并用SV40悬浮液接种在R培养基（RPMI培养基，pH 6.8）中，MOI使10%至30%的感染细胞在37°C下持续120分钟。将病毒接种物替换为全培养基（DMEM），并将细胞在37°C下再培养22小时。用甲醛固定后（最终浓度为4%），对细胞进行清洗、渗透（PERM缓冲液[0.1%Triton X-100，3%BSA，PBS]通过0.4μm膜过滤以去除纤维），并在PERM缓冲溶液中用1:1000稀释的一抗1605的一抗SV40小T抗原孵育120分钟。用PBS清洗平板，并在PERM缓冲液中稀释二级抗体（与Alexa Fluor 488；Invitrogen偶联的羊抗鼠抗体的1:1000稀释液）和Hoechst 33258染料（1:10000；Invit罗gen）30分钟。
在Pathway 855自动显微镜工作站（Becton Dickinson）上，使用10倍物镜（奥林巴斯）和基于激光的每秒自动聚焦图像，获得每个通道每孔16张图像（nucleus/Hoechst 33258和T抗原/Alexa Fluor 488）。使用基于MATLAB的感染评分程序（Mathworks）确定每个孔的细胞数（CN）和原始感染指数（rawII）。由于细胞密度影响SV40感染，所以细胞密度对感染指数的影响是用一个独立的棋盘来确定的。简言之，在筛选条件下，每孔转染AllStarsNegative siRNA的不同数量的HeLa细胞被SV40感染。根据获得的每个细胞密度的感染指数，多项式回归函数normII=如果计算（CN）。用以下方程式确定筛网各孔的密度校正相对感染指数（corrRII）：
使用RNAi筛选分析软件包cellHTS2进一步处理CN和corrRII数据(7). 这两个特征在每个平板内相对于AllStarsNegative对照进行独立归一化，然后进行z（z）-分数计算（分别为zCN和zII）和所有重复实验的标准化，基本上如cellHTS2软件手册所述(http://bioconductor.org/packages/2.5/bioc/html/cellHTS2.html). zCN′的细胞数截断靶siRNA≥−3（每孔约500个成像细胞）用于丢弃所有强烈减少细胞数量的siRNA。从剩下的siRNAs中，那些z（z）感染分数超出了所有AllStars阴性对照siRNA标准偏差的5倍带宽z（z）得分[zII'靶siRNA>|5×SD（zII′AllStars否定)|]影响SV40感染的基因（“hits”）由至少2个显著靶向siRNA定义，以减少病毒感染。每次命中的感染变化占阴性对照的百分比（100%），如所示根据siRNA的对数回归，从该特定命中的所有重要siRNA的平均值zII近似得出z（z）在所有重复实验中，感染分数与相应感染指数的平均值相同。
表1。
| 基因 | 说明 | 蛋白质类别 | 功能 | 感染减少（%） |
|---|
| RAB5C型 | RAB5C，RAS癌基因家族成员 | 小GTPase | 内膜蛋白质分类 | −69.9 |
| RAB4A型 | RAB4A，RAS癌基因家族成员 | 小GTPase | 内膜蛋白质分类 | −68.1 |
| CFL1型 | Cofilin 1（非肌肉） | 肌动蛋白结合蛋白 | 细胞骨架重组 | −67.5 |
| CBLC公司 | Cas-Br-M（小鼠）嗜生态逆转录病毒转化序列c | E3泛素蛋白连接酶 | 内体蛋白（EGF）分类 | −64.4磅 |
| 巴基斯坦2 | P21蛋白（Cdc42/Rac）活化激酶2 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 | 细胞骨架重组 | −63.7 |
| NCK2号机组 | NCK适配器蛋白2 | 衔接蛋白 | EGF信号转导/细胞骨架重组 | −63.3 |
| EHD1型 | 裕利安怡域名1 | 衔接蛋白 | EGF信号转导/细胞骨架重组 | −63.3 |
| ARHGAP10型 | Rho GTPase激活蛋白10 | GTPase激活蛋白 | 细胞骨架重组 | −62.4 |
| STX5A型 | 突触蛋白5 | SNARE蛋白 | 囊泡融合/内体到TGN的转运 | −61.3 |
| RAB5A型 | RAB5A，RAS癌基因家族成员 | 小GTPase | 内膜蛋白质分类 | −60.8 |
| CBL公司 | Cas-Br-M（小鼠）嗜生态逆转录病毒转化序列 | E3泛素蛋白连接酶 | 内体蛋白（EGF）分类 | −60.4 |
| UBASH3A公司 | 泛素相关和SH3结构域A；TULA公司 | 衔接蛋白 | 内体蛋白质分选 | −58.3 |
| RAB5B型 | RAB5B，RAS癌基因家族成员 | 小GTPase | 内膜蛋白质分类 | −56.2 |
| PRKCG公司 | 蛋白激酶Cγ | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 | 蛋白质信号 | −55.5 |
| HGS公司 | 肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物 | 衔接蛋白 | 内膜蛋白质分类 | −55.5 |
| GRB2级 | 生长因子受体结合蛋白2 | 衔接蛋白 | EGF信号 | −55.4 |
| DNM2（DNM2） | 动力蛋白2 | 小GTPase | 囊泡破裂 | −55.4 |
| ARRB2号机组 | 逮捕β2 | 衔接蛋白 | 高尔基复合体到内体的蛋白质分选 | −54.9 |
| NEDD4L公司 | 神经前体细胞表达，发育下调4样 | E3泛素蛋白连接酶 | 内体蛋白（EGF）分类 | −53.9 |
| GGA2公司 | 高尔基相关γ-adaptin含耳Arf-结合蛋白2 | 衔接蛋白 | 蛋白质分选/TGN-溶酶体转运 | −53.2 |
| PAK3系列 | P21蛋白（Cdc42/Rac）活化激酶3 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 | 细胞骨架重组 | −52.9 |
| PIK3C3型 | 磷酸肌醇-3-激酶，3类 | 磷酸肌醇-3-激酶 | 内体蛋白质分选 | −52.8 |
| NEDD4公司 | 神经前体细胞表达，发育下调4 | E3泛素蛋白连接酶 | 内体蛋白（EGF）分类 | −52.2 |
| RAB1A公司 | RAB1A，RAS癌基因家族成员 | 小GTPase | 从ER到高尔基复合体的囊泡交通调节器 | −51.5 |
| 数字音频广播2 | 失能同源物2，有丝分裂原反应磷酸蛋白(黑腹果蝇) | 衔接蛋白 | 内膜蛋白质分类 | −51.3 |
| DYNC2H1型 | Dynein，细胞质2，重链1 | 运动蛋白 | 膜泡运输 | −51.3 |
| RAB22A型 | RAB22A，RAS癌基因家族成员 | 小GTPase | 内膜蛋白质分类 | −49.8 |
| PRKCZ公司 | 蛋白激酶C zeta | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 | 蛋白质信号 | −49.2 |
| SNX15型 | 排序nexin 15 | 排序nexin | 内膜蛋白质分类 | −48.2 |
| VIL2级 | 维尔林-2；埃兹林 | 肌动蛋白结合蛋白 | 细胞骨架重组 | −47.6 |
结果
SV40感染依赖于内体蛋白。
为了确定与SV40感染有关的细胞因子，我们用HeLa细胞对108种已知参与内吞作用各方面的细胞蛋白进行了靶向siRNA沉默筛选（参见补充材料中的图S1A）。补充材料中的表S1显示了靶向蛋白质和使用的siRNA的完整列表。材料和方法对实验过程进行了详细描述。对每个基因使用三个非重叠的siRNA。siRNA转染72小时后，细胞被SV40感染，再24小时后，将其固定并进行Hoechst染色，以显示所有细胞核，并使用针对SV40 T抗原的抗体进行间接免疫荧光，以识别感染细胞的细胞核（图S1D和S1E）(43).
当三种siRNA中至少有两种显示受感染细胞数量显著减少或增加时，即当平均值为z（z）感染分数至少是标准偏差的五倍z（z）所有阴性对照siRNA的得分（参见补充材料中的图S1C）。通常，这意味着感染细胞减少50%或更多。补充材料中的图S1B显示了转染siRNAs对分析的全套样品中细胞数量和感染指数的影响范围。还显示了非靶向siRNA对照（AllStarsNegative）和转染对照（Hs_KIF11_6/EG5；Qiagen）的作用，这两种对照存在于每个平板中。从细胞数量的急剧下降来看，在所使用的324个siRNAs中，有26个被发现有毒。我们的分析没有考虑这些因素。
共有30个蛋白质被鉴定为hits(). 它们属于许多不同的蛋白质类。然而，很明显，大量（总共18个）具有与内体相关的功能。内切体相关点击包括Rab5a、Rab5b、Rab5、Rab4a、Rab22a、GTPase dynamin-2（DNM2）和肝细胞相关底物（Hrs或Hgs）。通过Western blots定量分析确定了一些蛋白质的敲除水平。例如，对于最佳siRNAs，Rab4a、Rab5a、Hrs和DNM2蛋白的表达降低到17%以下（参见补充材料中的图S2）。
需要进一步的研究来验证这些结果，并阐明这30种蛋白质在感染中的作用。然而，发现近三分之二的撞击与经典内体室的调节和功能密切相关，这意味着内体在SV40感染中起着重要作用。
SV40进入内体。
为了分析传入病毒进入内体的程度，采用了间接免疫荧光显微镜、定量活细胞成像和电子显微镜（EM）。大多数共定位和定量实验都使用活细胞成像，因为我们最近发现CV-1细胞中的许多LEs和内溶酶体在与用于免疫荧光的甲醛固定剂固定期间破裂并丢失其内容物(25). 此外，EM和活细胞成像中常见的晚期内胚体腔室的圆形经常丢失。例如，比较LEs和溶酶体标记LAMP1在（现场）和（固定）。
内部化SV40与内体标记物共定位（另请参阅补充材料中的电影S1至S3）。（A） CV-1细胞与SV40-AF488在37°C下孵育120分钟。用EE标记物EEA1的抗体混合细胞并进行免疫染色。使用蔡司LSM 510共聚焦显微镜系统对共聚焦切片进行成像。（B到D）将荧光标记的SV40添加到转染有不同XFP标记的内体标记的CV-1细胞中，并在指定的时间点用旋转圆盘共焦显微镜实时成像（C除外，C是用蔡司LSM 510系统成像的）。（E） 升温后不同时间与标记Rab7-EGFP和Rab5-mRFP共定位的病毒百分比。它是根据D中显示的图像计算得出的。误差条是三个不同实验中5到15个细胞每个时间点数据平均值（SEM）的标准误差，每个细胞平均50到100个颗粒。（F） 与A相同，但用SV40-AF594孵育细胞，并用LE标记LAMP1染色。
内化SV40与EE和LE标记物的配色（另请参阅补充材料中的电影S4）。（A和B）SV40-AF647被添加到转染Rab7-mRFP和LAMP1-EGFP或Rab9-EYFP的CV-1细胞中，并在升温后153分钟用旋转圆盘共焦显微镜成像。（C） 荧光标记的SV40内化到转染有组成活性突变体Rab5Q79L-EGFP的CV-1细胞中，并在加热后160分钟用共焦显微镜实时成像。（D） 将荧光标记的右旋糖酐添加到CV-1细胞中2 h，培养过夜，并将其置于SV40-AF647中，在冰上结合2 h。在加热至37°C后240 min，用共焦显微镜对细胞成像。
固定伪影使得免疫荧光法难以显示和定量晚期内吞细胞器中的病毒等货物。事实上，这可能在一定程度上解释了为什么过去我们未能观察到LEs中的病毒。
为了避免过度表达的不利影响，我们将观察范围限制在表达报告构建物的水平很低的细胞。这是通过使用配有高灵敏度EM-CCD相机的旋转圆盘共焦显微镜实现的。使用基于MATLAB的算法量化颜色化。通过像素大小和强度检测病毒。当50%或更多的病毒像素与第二通道中的物体（内腔小泡）重叠时，病毒被视为共定位。为了量化，在每个时间点分析来自至少三个不同实验的5到15个细胞中的50到100个病毒（每个细胞）。
通过固定细胞的间接免疫荧光显微镜和表达XFP标记EE标记的细胞的活细胞成像，可以重复观察到荧光标记SV40与EE标记物的共定位。显示了固定细胞的共聚焦部分，其中病毒颗粒为绿色，含有EEA1的细胞器为红色。许多EEA1阳性的内体中含有病毒颗粒。细胞外围的绿色斑点代表尚未内化的病毒。90分钟后，SV40细胞与内源性EEA1共定位的比例达到总细胞相关病毒的7.6%±1.7%。
图中显示了一个相似的共焦截面（虽然更接近质膜平面），红色荧光病毒与绿色Rab5-EGFP在活的未固定细胞中广泛共定位。表达该ESCRT 0成分的活细胞中Hrs-EGFP阳性细胞器中也可检测到病毒().
含有SV40的Rab5-EGFP阳性EEs通常较小且位于外围，而含有EEA1和Hrs-EGFP的EEs较大且位于细胞质的核周区域(和C）。在活细胞中，可以看到SV40颗粒与细胞质中含有Rab5和Rab7-mRFP的细胞器一起移动，这表明共定位并非巧合(并参见补充材料中的电影S1至S3）。150分钟后定量时，与Rab5-mRFP共定位的总细胞相关病毒颗粒的16.8%±3.6%，与之前报告的观察结果一致(42). EEs中的病毒比例至少在2小时内保持不变().
SV40进入晚期内体。
尽管LEs在固定细胞中保存较差，如上所述，但在含有内源性免疫染色LAMP1（绿色）的细胞器中可以看到病毒颗粒（红色）(). 在表达LAMP1-EGFP、Rab9-enhanced yellow fluorescent protein（EYFP）或Rab7-mRFP的活细胞中，共定位更加清晰和广泛(以及2A和B）。LEs和内溶酶体呈圆形，呈环状膜荧光。标记的SV40可以通过细胞质与内体一起移动（参见补充材料中的电影S3和S4）。
在之前的一篇文章中，我们观察到组织学活性Rab5Q（Rab5Q79L）的表达抑制了感染(42). 最近的研究表明，Rab5Q的过度表达在成熟的内体水平上导致LE成熟的有效阻滞(65). 为了确定SV40在过表达Rab5Q的CV-1细胞中的细胞内位置，我们添加了SV40-AF647。在添加病毒后2小时，大多数病毒颗粒定位于分选缺陷、扩大的内体().
固定后的定量和免疫荧光显示，SV40颗粒与内源性LAMP1的共定位在升温后90分钟达到15.6%±1.9%的峰值。然而，在定量不受固定诱导的细胞器破坏影响的活细胞中，与LAMP1-EGFP和Rab7-EGFP的共定位水平要高得多。在Rab7-EGFP表达细胞中，它随时间线性增加，4.5h后达到细胞相关病毒的49.9%±10.1%().
为了证实SV40也会在未转染细胞中转移到晚期内胚体隔室，我们将CV-1细胞暴露于异硫氰酸荧光素（FITC）-右旋糖酐中4小时，然后在没有荧光液相标记的情况下培养20小时，以预加载晚期内胚体和溶酶体。然后让SV40-AF647进入细胞4小时。通过共焦显微镜观察细胞时，我们清楚地观察到大多数病毒位于含FITC-右旋糖酐的晚期内体和溶酶体中().
当将病毒加入细胞后2小时进行EM时，SV40颗粒()在光滑壁、紧密贴合的质膜内陷中可见()，位于外周细胞质的膜结合小泡中()，在没有管腔内小泡的内胚体样结构中() (26,28)和多泡体（MVB）晚期内体(). 19小时时，他们已经到达ER的平滑区域()，但一些存在于多层体（MLB）中(). 在高尔基复合体或反式-高尔基网络。
SV40进入内胚体结构和内质网。（A）通过阴性染色观察纯化的SV40。（B至G）纯化的病毒在加热后的不同时间与CV-1细胞孵育，固定，包埋在塑料中，切片并成像。箭头指向单个病毒颗粒。病毒被视为单个颗粒（A），存在于质膜（B）、内胚体结构（C至F）和内质网（G）的光滑区域内。E中的字母E代表“内体”。比例尺表示200纳米。
综合起来，数据表明，内化的SV40进入外周和核周EEs以及LEs，其中许多以MVB和MLB的形式存在。4小时后，当第一个病毒颗粒进入ER时(53)，80%以上的内化病毒与内体室相关。EE相关病毒池相对较小（少于总细胞相关病毒的20%）的原因很可能是病毒从质膜缓慢而不同步地到达，以及病毒从EE持续向LE移动。最近观察到mPy从EEs向LEs的类似进展，mPy也通过内体转运到ER(46).
液泡pH值升高阻止SV40感染。
SV40与内体的关联提出了这样一个问题：这种贩运途径是否在生产性感染中起作用。首先，我们分析了已知的抑制剂对提高内胚体和溶酶体管腔pH值的作用。NH在场时4根据流式细胞术的测定，T抗原表达细胞的数量减少到对照的15%。含有莫能菌素，一种羧基离子载体和巴非霉素a1（Baf）是一种负责内体酸化的空泡ATP酶抑制剂，感染几乎被完全抑制().
内化和感染的酸依赖性。（A） 用100nM巴非霉素A预处理CV-1细胞1小时1（Baf），20 mM NH4Cl或10μM莫能菌素（Mon），并在药物持续存在的情况下感染SV40 24小时（MOI为1）。通过SV40 T抗原的免疫染色和流式细胞术测定感染水平，并将其归一化为无药对照。（B） 用SV40（MOI为1）感染细胞，并在不同时间向细胞中添加Baf。如上所述确定A的感染。（C）与A相同，但使用小鼠成纤维细胞小窝蛋白-1敲除细胞和Baf。所示数据表示三个独立实验数据的平均值±SEM，每个实验都有三份样品（A到C）。（D） NH存在下内化SV40颗粒的百分比4Cl、Baf和Mon。误差条显示了三个不同实验中5到15个细胞每个时间点的SEM，每个细胞的平均颗粒数为50到100。升温后不同时间，在Mon（E和F）和Baf（G和H）存在下，用SV40粒子孵育CV-1细胞的（E到G）EM图像。箭头指向病毒颗粒。比例尺指示200 nm。
当在添加SV40后的不同时间添加Baf时，发现在细胞升温后90分钟的中点出现敏感台阶。因此，这种速效抑制剂影响了SV40感染的早期步骤，与病毒内化大致一致(). Baf还抑制来自小窝蛋白-1基因敲除小鼠的成纤维细胞中SV40的感染，表明小窝蛋白诱导的依赖性感染途径也需要酸化(). 这些药物不影响细胞活性。总的来说，除了NH观察到的胞内空泡肿胀外，细胞形态正常4氯和莫能菌素（见下文）。
为了分析感染途径中的哪些步骤被阻断，我们采用了基于共价连接到SV40颗粒的特定荧光团AF488的定量内化分析。AF488可通过添加不透膜染料台盼蓝进行淬火(63) ().
内化分析。（A） 在加入荧光标记的SV40前20 h，用Rab7-mRFP转染CV-1细胞。将细胞在冷环境中培养1小时，冲洗掉未结合的病毒，然后立即将细胞转移到显微镜上。五z（z）在加入台盼蓝熄灭细胞外荧光之前（洗涤后10min）和之后（洗涤后15min），用旋转圆盘共焦显微镜对每个细胞的切片进行成像。（B） 与A相同，但细胞在37°C下孵育240分钟后熄灭（244分钟）。（C） 与A相同，但在37°C下与病毒孵育240分钟之前和期间，细胞预先与Baf孵育1小时。
结果表明，在对照细胞中，80%的AF488标记的病毒颗粒在4h内内化4存在氯或莫能菌素，只有20%的病毒颗粒被内化(). 先前报道过莫能菌素引起SV40内化障碍(54). EM证实，在莫能菌素处理的细胞中，在升温后22小时，大多数SV40颗粒仍滞留在质膜内陷中(). 内化颗粒的少数群体位于MVB和MLB中().
此外，在Baf处理的细胞中，大多数SV40颗粒仍留在质膜上()，但在这种情况下，内化的少数颗粒出现在没有腔内膜的内胚层结构中(). 这一结果可以通过活细胞显微镜得到证实：在Baf处理的细胞中，少数内化的SV40-AF647颗粒仅与Rab5-mRFP共定位，而在莫能菌素和NH中4Cl-处理细胞，病毒主要与Rab7-mRFP共定位(并参见补充资料中的电影S5和S6）。Baf导致对照细胞观察到的圆形环状Rab5染色缺失，而NH4Cl和莫能菌素引起Rab5-和Rab7-阳性空泡的扩张(、C和D）。
真空pH值升高会抑制SV40的贩运（另请参阅补充材料中的电影S5和S6）。（A、C和D）SV40-AF647与转染XFP标记蛋白和100 nM巴非霉素A的细胞孵育1（Baf），20 mM NH4添加Cl或10μM莫能菌素；在加热后的不同时间点用共焦显微镜对细胞进行成像。注意NH4Cl和莫能菌素引起内体和溶酶体肿胀，Baf导致内体失去圆形外观。（B） 在100nM Baf存在下，在加温后的不同时间点与标记物Rab7-EGFP和Rab5-mRFP共定位的病毒的百分比，根据如A中所示的图像计算。误差条是来自三个独立实验的5-15个细胞的每个时间点的数据的SEM，平均每个细胞有50-100个颗粒。
综合起来，数据表明，感染受到所有三种pH扰动剂的抑制。虽然病毒与细胞表面的结合不受影响，但内化作用强烈减少。天然气4Cl和莫能菌素允许少数内化的病毒进入LEs和MVB。Baf似乎在早期干扰了内体成熟，病毒在修饰的EE中被截留。这些观察结果与SV40利用内体途径感染以及酸性细胞器pH值升高可在感染途径中引入多个阻滞的概念一致(5,6,9,61).
通过LEs进入ER的分子要求。
货物从EE到LE的移动依赖于复杂的内体成熟过程，其中涉及多种细胞因子(39). 其中，微管很重要，因为它们介导成熟内体从外围向核周细胞质的运动，并调节与溶酶体的融合(三,5,6,13). 诺卡唑破坏微管可有效抑制SV40感染，但不影响内化(和F）。病毒颗粒未到达ER(44).
SV40通过晚期内体途径和到达内质网的分子要求。（A）与模拟治疗对照组相比，在5μM诺卡唑（Noc）存在下内化的SV40颗粒的百分比。（B和C）SV40颗粒在5μM诺卡唑存在下加入CV-1细胞4小时的EM图像。黑色箭头表示病毒。（D） SV40-AF647与转染Rab7-mRFP和Rab5-EGFP的CV-1细胞在5μM诺卡唑的持续存在下孵育。显示了230分钟后拍摄的代表性细胞的共焦切片。（E） 在5μM诺卡唑存在下，升温后不同时间点与Rab7-mRFP和Rab5-EGFP共定位的病毒颗粒百分比，如D中所示的图像所量化。误差条是三个不同实验中5至15个细胞每个时间点数据的SEM，每个细胞平均有50到100个颗粒。（F） 用5μM诺卡唑孵育的CV-1细胞在5μM的MOI下感染SV40 24 h。在升温后8 h清洗药物，或在清洗后添加不同的药物。感染水平通过SV40 T抗原的免疫染色和流式细胞术标准化为无药对照来确定。所示为三个独立实验数据的平均值±SEM，每个实验都有三份样品。缩写：Baf，bafilomycin A1; Mon，莫能新；BFA，布雷费尔丁A；OV，原钒酸盐；Gen，染料木素；OA、冈田酸；钙蛋白C；戴恩，戴纳索尔。（G） 与模拟处理对照组相比，在80μM dynasore存在下内化的SV40颗粒的百分比。
加热后4小时，诺可达唑处理细胞的EM显示，病毒颗粒位于内吞体样细胞器中()和MVB(). 在活细胞显微镜下，SV40-AF647存在于Rab5-EGFP和Rab7-mRFP阳性的空泡中(). 随着时间的推移，我们可以观察到大多数内化的病毒颗粒(和E）积累在两种细胞器中：不含Rab7的Rab5阳性内体，以及病毒位于Rab7阳性结构域的Rab5-和Rab7-阳性成熟内体(). 后一种细胞器对应于先前描述的LE成熟过程中的中间产物，这些中间产物被微管功能的抑制所阻止(三,5,62).
诺卡唑效应是可逆的，它为将进入途径分为两个阶段提供了一种方便的方法：早期事件直至并包括成熟的内体，以及晚期事件，在此期间病毒移动到LEs并最终移动到ER。当CV-1细胞在加入SV40后与诺卡唑孵育8小时，然后进行诺卡唑洗脱，感染恢复到对照水平的75%() (53). 当诺卡唑在洗脱时被其他抑制剂替代时，可以研究诺卡唑阻断剂下游进入途径中步骤的抑制剂敏感性().
诺卡唑洗脱后抑制感染的药物包括酸化抑制剂莫能菌素和Baf。金雀异黄素（一种通用酪氨酸激酶抑制剂）、原钒酸盐（一种酪氨酸磷酸酶抑制剂）和冈田酸（一种Ser/Thr磷酸酶的抑制剂）的抑制作用表明了酪氨酸和Ser/Thr磷酸化的作用。根据布雷菲尔丁A（BFA）的强烈抑制作用判断，Arf蛋白似乎在该途径的早期和晚期都发挥了作用，这与之前报道的数据一致(41,50). 除了破坏高尔基复合体内和从高尔基复合体到内质网的囊泡运输外，已知BFA还能诱导内体的管状化并抑制从EEs到内溶酶体的货物运输(33,58). 诺卡唑洗脱后钙磷蛋白C未能抑制感染的发现表明，蛋白激酶C（PKC）的作用（siRNA筛选中的两次点击）位于诺卡唑阻滞的上游。
在诺康唑后步骤中阻止感染的抑制剂之一是dynashote，它是DNM2的抑制剂(36). 在不引起细胞毒性的浓度下，它使感染率降低了80%以上(). DNM2在siRNA感染筛查中也大受欢迎(). 先前显示显性阴性DNM2结构的过度表达可以减少感染(45). 然而，定量内化分析表明，在SV40的情况下，dynasore抑制的不是内吞摄取，而是下游事件().
总之，结果表明，细胞内病毒运输途径的后半部分的调节是复杂的，并依赖于许多细胞因子。很明显，一些抑制剂，如BFA、酸化抑制剂和染料木素，会影响诺卡唑阻滞前后的过程。观察到的效果与感染病毒通过LEs进入ER的过程一致。
讨论
我们的研究得出的最重要的结论是，SV40在感染进入宿主细胞的过程中会通过一系列经典的内吞细胞器。这些包括EE、成熟的杂交内体、具有多泡和多层小体特性的LE，以及最有可能的内溶酶体。路径示意图如所示.传代缓慢且不同步，病毒在最初内化后数小时到达内质网(53).
感染性SV40进入CV-1细胞的模型。SV40与受体（GM1）结合，分裂成脂筏，通过小窝介导或小窝蛋白-1非依赖性脂筏依赖性内吞机制诱导质膜内化。病毒被转移到Rab5-、EEA1-和Hrs-阳性的EE。当这些内体获得Rab7时，SV40与Rab7阳性结构域结合。通过内体成熟，病毒成为LAMP1-、Rab9-和Rab7-阳性LEs的内腔成分，最终成为内溶体。液泡ATP酶（v-ATP酶）负责内体和溶酶体的酸化。SV40内化和后续运输步骤需要酸化。病毒通过一种未知机制直接或不太可能通过高尔基复合体从内吞途径的晚期腔室转移到内质网。进入途径中的早期和晚期事件可被各种抑制剂和其他扰动物阻断。参考文献中报道的不同药物的作用。
综上所述，这些观察结果未能支持我们之前的模型，即SV40通过小窝蛋白-1阳性的非内体细胞器（我们称之为小窝体）绕过内胚体进入内质网(44). 此时放弃小泡体模型的主要原因是双重的。首先，这里提出的结果清楚地说明了以内体为基础的传入病毒的贩运以及内体在生产性感染中的作用。其次，我们在最近的研究中发现，最初描述的小泡体可能代表修饰的LEs或内溶酶体(25). 我们观察到，当小窝蛋白-1结构体的过度表达、胆固醇的降低和空洞的耗竭损害小窝组装时，就会出现富含小窝蛋白的“小窝体”。在这些条件下产生的未组装小窝蛋白-1是泛素化和内吞的，在溶酶体降解之前，它在LEs内的管腔内小泡（ILV）中积累。导致SV40进入小泡体模型的最初实验是用过度表达小泡蛋白-1的细胞进行的(42,44). 由于缺乏适当的LE标记，以及我们现在认识到的用甲醛固定CV-1细胞中晚期内体隔室而不丢失内容物（包括病毒颗粒）的困难，加剧了这种混淆(25).
我们在HeLa细胞中的靶向siRNA沉默筛选中，内切体在SV40进入中的中心作用被一系列内切体点击所强调。消耗Rab5a、Rab5b、Rab5、Hrs、c-Cbl、Rab4a、Rab 11b、SNX15、PIK3C3、DNM2和arrestin beta-2等蛋白质后，感染性下降。已知这些蛋白质在货物运输到内体、内体功能和内体调节中发挥多种作用(24).
光镜实验证实，80%以上的内化SV40颗粒进入Rab5阳性、EEA1-阳性和Hrs-阳性的EEs，以及LAMP1阳性、Rab7-阳性、Rap9-阳性和FITC-右旋糖酐阳性的LEs和溶酶体。EM证实了内体结构中存在病毒。
研究发现，提高内吞细胞器pH值的药物可以抑制感染。它们的主要抑制作用涉及结合病毒的内化。内吞阻滞背后的机制尚不清楚，但这种效应在一定程度上解释了SV40感染对pH扰动的高度敏感性。此外，在Baf存在的情况下，被内化的病毒部分（约20%）未能超越Rab5阳性的EE，而在莫能菌素存在的情况中，未能超越LE。这并不意外，因为在干扰内吞体的酸化后，常常会观察到内吞体成熟和货物运输到溶酶体的障碍(5,6,9,54,61).
其他人之前观察到莫能菌素对SV40内化和细胞内转运的抑制作用(54). 此外，最近有报道称，mPy和两种人类多瘤病毒（BK和JC病毒）需要酸化才能感染(4,27,32). 然而，在之前的两份报告中，研究人员未能观察到酸化扰动剂对SV40感染的抑制作用(4,60). 差异可能是技术性的：在我们的实验中，我们考虑到进入过程缓慢，因此我们相应地延长了药物治疗。我们还确定了嗜溶性弱碱NH4通过在培养基中加入有效的缓冲液，Cl在整个实验过程中保持活性，以防止培养基pH下降，从而降低抑制效果(29).
SV40的分选深入到内吞途径的降解分支是感染的必要条件，这一发现最好地通过干扰内体成熟的扰动效应来说明。以前(42)，我们已经观察到，组成活性Rab5Q的表达抑制了感染，这会在成熟内体水平上有效阻止LE的成熟(18,65). 此外，我们观察到，当内腔小泡的形成被耗竭小时数和LE形成所必需的泛素依赖机制的其他成分所阻断时，感染被抑制() (49). 此外，当诺卡唑干扰微管内体运输以及使用酸化抑制剂时，感染受到抑制(54). SV40与许多晚期穿透病毒（如甲型流感病毒、鼻病毒、mPy、布尼亚病毒和细小病毒）一样依赖于内体成熟(19,35,39,67).
研究人员发现了几种抑制剂和干扰剂来预防诺康唑阻滞后的感染(). Baf和莫能菌素的敏感性表明，除了在早期进入过程中发挥作用外，还需要在途径后期进行酸化(5,6,9,61). BFA的抑制作用证实了Arf蛋白的晚期作用(41,50,64).
激酶和磷酸酶在SV40进入的早期和晚期均起作用(43). OV是一种酪氨酸磷酸酶抑制剂，可显著增加SV40的内化(45)dynasore的抑制作用表明，DNM2是诺康唑后步骤所必需的。DNM2除了在初级内吞过程中具有特征性的作用外，以前的报道还支持胆固醇和其他货物从内体运输到内质网，以及从内体输送到高尔基复合体(31,40,51).
SV40的进入与其他多瘤病毒有许多相同的特征。人类BK病毒、JC病毒、MCPyV以及小鼠多瘤病毒似乎需要神经节苷脂才能感染(14,15,21,22,30,34,46,55,59). 虽然最近发现的人类多瘤病毒的进入途径尚未详细研究，但已知mPy、BK病毒和JC病毒进入内体并依赖酸化(4,27,32,38,46,47). 就研究充分的mPy而言，提出了回收内生体和晚期内生体的作用(32,38,46). 像SV40一样，其他多瘤病毒被输送到内质网腔，似乎利用内质网机械进行脱膜和膜渗透(27,37,46).
为什么多瘤病毒使用如此复杂的进入途径？一个原因是，由于衣壳由二硫键网络稳定，它们需要获得内质网内腔中的巯基氧化还原酶和伴侣，以进行初始脱膜(37,53). 此外，越来越多的证据表明，病毒的膜渗透依赖于ER相关降解途径的成分(27,37,53). 细菌毒素（如志贺毒素和霍乱毒素）也利用内胚体途径到达内质网。与多瘤病毒一样，这些病毒具有与鞘糖脂受体相关并聚集的同五聚体结合亚单位(15,16,52). 这些相似性表明，多聚鞘糖脂与含胆固醇的脂质结构域的结合和结合不仅为病毒和毒素提供了进入内体的入口券，而且正如Qian等人最近提出的那样，也延长了从内体到内质网的旅程(46).
