肿瘤研究中的稳定同位素分解代谢组学（SIRM）及其在非小细胞肺癌中的临床应用

癌症生长的代谢需求

不受控制的生长是肿瘤细胞的一个普遍特征，它要求细胞代谢发生深刻变化，以维持增殖所需的额外能量和生物合成前体。加速有氧糖酵解是恶性转化的相关因素之一，80多年前Warburg首次描述了这一点(1956). 尽管许多癌细胞糖酵解显著上调（DeBerardinis等人。，2007; Fan等人。，2005,2008; Thornburg等人。，2008; Wong等人。，2004)这一过程本身不足以为合成代谢提供必要的前体；它们必须由额外的代谢过程提供。几种Krebs循环代谢产物，柠檬酸盐、草酰乙酸盐/天冬氨酸盐和α-酮戊二酸盐/谷氨酸盐，分别是脂肪酸、核酸和蛋白质生物合成的前体（Nelson和Cox，2005)所有这些都是增长所必需的。由于其中一些代谢物（例如草酰乙酸和α-酮戊二酸）保持在低细胞浓度，因此必须通过回补来补充，以维持克雷布斯循环和生物合成活动。两条主要的回复途径涉及丙酮酸羧基化（Fan等人。，2008)和谷氨酰胺分解（DeBerardinis等人。，2008; Mazurek和Eigenbrodt，2003; Mazurek等人。，2000,2005; Wong等人。，2004). 这两种途径的相对重要性似乎是组织特异性的（DeBerardinis等人。，2007; 风扇和车道，2008; Fan等人。，2009; Portais等人。，1993).

终末分化细胞维持基本代谢，主要用于细胞内稳态、修复以及营养物质和废物进出细胞的运输。运输利用离子梯度，最终由ATP水解驱动。一个细胞要分裂，它的生物量必须加倍，即大约65%的蛋白质、19%的脂质、13%的碳水化合物和3%的核酸。生物聚合物的组装具有高度的变性；能量代谢上调；1毫克生物量相当于来自蛋白质的大约33μmol碳、来自脂质的11μmol、来自碳水化合物的4μmol和来自核酸的0.9μmol的碳。在哺乳动物细胞中，约1 mg生物量包含30–35μmol碳，例如可从葡萄糖（即5–6μmol）或合成代谢氨基酸中获得。使用教科书中合成生物聚合物所需ATP当量的数量（Nelson和Cox，2005)尽管1μmol葡萄糖完全氧化为CO，但生成1 mg生物质需要来自生物合成途径的至少30μmol碳和至少30μmo ATP来驱动合成代谢反应₂可生成高达32μmol的ATP（对于NADH和FADH2，P:O分别为2.5和1.5），其中两个来自糖酵解，五个来自糖水解生成的NADH。事实上，肿瘤细胞通常会将三分之一或更多的葡萄糖转化为排泄的乳酸（DeBerardinis等人。，2007; Fan等人。，2008)它不仅清除了线粒体可能氧化的碳，还清除了糖酵解产生的NADH。在实践中，这意味着葡萄糖的氧化产生的ATP比32摩尔/摩尔葡萄糖的理论最大值要少得多。如果线粒体有功能，氨基酸和脂肪酸也会被氧化。脂肪酸氧化可以提供大量的ATP，但碳不能用于合成代谢目的。谷氨酰胺通过谷氨酰胺水解是合成代谢碳的重要来源（Mazurek和Eigenbrodt，2003)，并且取决于它是如何被氧化的细节，可能会提供适量的ATP。请注意，即使在低氧张力下，这种氧化也绝对需要有功能的线粒体。幸运的是，对于癌细胞来说，末端氧受体cytc（c）氧化酶对氧有很高的亲和力（Gnaiger等人。1998).

为什么是稳定同位素？

细胞内代谢物浓度随条件变化的变化通常相对较小（“代谢稳态”），这主要是由反馈和前馈调节循环耦合的广泛相互作用的反应网络造成的（Gunawardena，2010; 纳尔逊和考克斯，2005). 此外，由于真核细胞中的分隔，不同隔间中代谢物的实际池大小既不知道也没有常规测量。通常只测量代谢物的总量，并将其归一化为与组织量成比例的某种标准。

图1显示了一个简化的代谢方案，它代表了一种截短形式的糖酵解，其中有两个输入（葡萄糖或G和B）和多个输出（a、C和乳酸或Lac）。这个简单的方案立即说明了为什么单靠浓度测量是不够的，因为它们无法提供有关流量的信息，并且由于相同的代谢物用于多个“途径”，因此无法确定代谢物的来源。在稳定状态下，对于这种代谢方案，产品的生产速率如下：

（1A）

（1B）

（1C）

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图1。

简单的代谢方案。G代表细胞外葡萄糖，在细胞内被己糖激酶立即磷酸化为G6P。拉克_o个和Lac_我分别代表细胞外（排泄）和细胞内乳酸。表观速率常数，k个因为代谢转化是酶浓度的函数。在迈克利斯·蒙顿动力学的极限下，k个_我 = (k个_猫/K（K）_米)_我e（电子）_我[1−第页/瑞典克朗_等式]，其中e（电子）_我是游离酶浓度，第页和秒酶催化的产物和底物浓度K（K）_等式是反应的平衡常数（Roberts等人。，1985).

在G和B的恒定供应下，产品的时间历程是线性的。然而，在这些条件下的通量控制可能是分布式和复杂的，并且会随着条件的变化而变化。如果葡萄糖以指数形式消耗，克(t吨) = 克（0）经验（−k个₁t吨)，然后是中的术语克也会随着时间呈指数下降，而b条保持不变；这可能导致新陈代谢模式的改变。此外，产品浓度现在随时间非线性变化。

在组织内细胞之间以及不同器官之间存在通信的生物体中，这个问题更加复杂。然而，如果通过使用示踪剂，系统的化学扰动最小，那么不仅可以从同位素富集的变化中测量通量，还可以直接利用网络的哪些部分。原则上，示踪剂可以是可独立测量的天然代谢物的任何适当版本；传统上，这是使用放射性同位素实现的。稳定同位素具有几个优点，不仅因为其生物相容性和无害性，还因为稳定同位素如¹³C或¹⁵氮很容易与它们更丰富的天然同位素区分开来(¹²C和¹⁴N） 核磁共振和质谱。这两种技术具有敏感性和选择性，可以提供大量关于特定前体原子富集程度和富集程度的信息，即使是在复杂混合物中（Fan和Lane，2008; Fan等人。，1986; 车道和风扇，2007; Lane等人。，2008年a,2009年a). 通过使用具有同位素编辑（NMR）或超高质量分辨率的多维技术，无需从细胞提取物或生物流体中存在的丰富化合物混合物中分离成分。分辨率由分析工具本身提供，因此避免了色谱分离的许多复杂性（Fan等人。，2008; Lane等人。，2008年a).

人类非小细胞肺癌的SIRM分析

我们已经扩展了此类¹³人类肺癌患者的C-示踪剂和同位素方法（Fan等人。，2009; Lane等人。，2008年a,2009年b). 稳定同位素示踪剂[U-¹³C] -在手术切除原发肿瘤和周围非癌组织之前，招募患者静脉注射葡萄糖。这个¹³C示踪剂与人体实验完全兼容——重同位素的生物效应不易检测，注射的葡萄糖量约为葡萄糖耐量试验中使用量的20%。表1总结了路易斯维尔非小细胞肺癌SIRM研究中受试者的统计数据。

在我们历时4年制定的方案中，一名经同意患有可手术NSCLC的受试者输注[U-¹³C] -手术前大约3小时切除前的葡萄糖。在葡萄糖输注之前和之后立即采集血样（需要5-6分钟，包括盐水冲洗）。血样立即放在冰上，然后离心分离血浆中的红细胞。全血和血浆样本的等分样品用1N速冻₂静脉穿刺后30分钟内保存。图6显示了手术室组织采集的各个阶段。为了最大限度地减少缺血，只要符合患者护理要求，肿瘤组织就会被楔形切除。肿瘤暴露在外，对于非小细胞肺癌，外科医生可以肉眼识别肿瘤边缘。将肿瘤的两到三小片进行吸墨汁染色，然后冷冻夹在lN中₂(图6). 来自同一肺叶的非肿瘤肺切片，距离肿瘤边缘至少2厘米，也进行了类似的治疗。将多余的组织块吸墨汁，放入福尔马林、OPT或新鲜冷冻中进行后续病理检查。

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图6。

切除非小细胞肺癌。左上：缝合血管；右上角：收集到一个内袋中；左中取切除肺的肿瘤组织（白色）和非肿瘤肺组织；右中：切取肿瘤病理标本并冷冻；左下：液氮冷冻夹持肿瘤切片；右下：病理样本的吸墨纸组织。切除和冷冻之间的时间<5分钟。

切除和组织冷冻之间的时间少于5分钟，这可以保持组织的代谢状态。冷冻组织基本上可以无限期地储存在lN₂温度。术后采集血液和尿液样本，并将其作为术前血液进行处理，以提供葡萄糖摄取和利用的概述¹³血浆和¹³C尿液中的葡萄糖排泄。

利用核磁共振和质谱分析配对的非癌肺组织和癌组织之间代谢途径的差异。这种方法能够分析癌组织的不同代谢特征，而不受内在（如遗传）或外部环境因素（如饮食）的干扰因为患者自身的非癌组织起到了内部控制的作用。图7总结了¹³C原子来自¹³葡萄糖通过糖酵解进入克雷布斯循环，以及前体物质并入可观察代谢物后的去向。与非癌肺组织相比，肺肿瘤表现出更强的糖酵解能力，同时表现出其他意料之外或未知的独特代谢活动。特别是，肺肿瘤组织表现出改变但完整的Krebs循环活性和增强的丙酮酸羧基化，这可能在补充肿瘤生长所需的合成代谢前体中发挥关键作用（Fan等人。，2009). 这种合成代谢特性也可能是其他人类癌症的基础（Fan等人。，2008).

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图7。

的流量¹³来自[U的C原子-¹³C] -葡萄糖转化为可检测的代谢物。¹³来自葡萄糖（红色）的C原子通过糖酵解进入丙酮酸和丙氨酸，然后通过丙酮酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶反应进入克雷布斯循环制造器，最终进入大分子。