体内克隆分析揭示了成人神经干细胞的自我更新和多潜能特性

成人齿状回RGL自我更新的多种模式

我们首先量化了GFP的激活率⁺使用1X诱导范式的成人齿状回RGL。由单个RGL组成的克隆的百分比随着诱导时间的推移逐渐降低(图2A). 为了详细描述RGL的激活，我们通过关注成对的GFP直接明确地监测单个RGL的命运选择⁺处于细胞分裂过程中的细胞，或刚刚分裂并保持彼此接近的细胞(P（P）_c（c）≥ 99.8%). 正如预期的那样，我们观察到神经源性不对称细胞分裂导致了一个GFAP⁺RGL和一个GFAP⁻工控机(图2B). 我们还观察到由一个Sox2组成的细胞簇⁺GFAP公司⁺RGL和一个或多个Sox2⁺GFAP公司⁻非辐射前兆(图S2A)，一种细胞类型，有时被视为水平前体(Lugert等人，2010年;Suh等人，2007年). 有趣的是，我们观察到胶质细胞不对称分裂产生一个RGL和一个GFAP⁺浓密星形胶质细胞(图2C)表明胶质细胞的命运选择可以在RGL水平上进行。另一方面，未观察到RGL的寡基因不对称自我更新(图S2B至S2E). 神经原细胞分裂后，RGL恢复静止（MCM2⁻)，而IPC进入细胞周期（MCM2⁺;图2D). 相反，在胶质细胞分裂后，RGL和星形胶质细胞都变得静止（MCM2⁻;图2E). 令人惊讶的是，我们观察到对称细胞分裂产生两个RGL的情况(图2F)，以前没有在成人大脑中报道过。综上所述，这些结果表明成人齿状回中至少有三种RGL自我更新模式(图2G). 此外，RGL可以在活动细胞周期和静止状态之间交替。

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图2

成人齿状回个体RGL自我更新的不同模式

（A） 用1倍剂量的三苯氧胺诱导后成人齿状回中标记RGL激活的时间进程。图中所示为由单个RGL组成的克隆的数量，表示静止。数值为平均值±SEM（n=3-8只动物）。

（B–F）GFP共焦图像样本⁺RGL细胞分裂过程中或之后的细胞(P（P）_c（c）≥ 99.8%). 所示为神经源性不对称细胞分裂（B，D）、星形细胞不对称细胞分裂和对称细胞分裂（F）的样本。插入中指出了潜在的血统关系。R： RGL；N： 神经元谱系；A： 星形胶质细胞。注意，细胞分裂后，RGL和新生星形胶质细胞恢复到静止状态（MCM2⁻; D、 E），而IPC重新进入细胞周期（MCM2⁺; D） ●●●●。比例尺：10µm。

（G） 成人齿状回RGL制作的三种自我更新模式示意图。

成人齿状回RGL的长期克隆谱系追踪

为了确定标记RGL的长期命运，我们使用免疫组织学和形态学标记物对1和2 mpi时单个克隆的组成进行了表征(图S1B;图3). 共有54个克隆在1 mpi时使用nestin-CreER进行了特征分析^T2段;用1X三苯氧胺诱导后的Z/EG范式。大约83%（54个克隆中的45个）包含至少一个RGL(图4A). 在含有RGL的克隆中，约69%（45个克隆中的31个）包含至少一个RGL和一个以上细胞(图4A)，表示积极自我更新。在这些激活的克隆中，约6%（31个中有2个）含有多个RGL，没有任何其他细胞类型(图3A和​和4A），第4页)，建议对称自我更新以扩大RGL池而不进行分化。重要的是，约13%（31个克隆中的4个）包含神经元谱系（例如Prox1⁺)、浓密或星状星形胶质细胞（GFAP⁺或S100β⁺)和至少一个RGL(图3B和​和4A；第4页;电影S2)表明单个RGL在一个月内既有自我更新的分化，也有多谱系的分化。大约45%（31个中有14个）的克隆包含至少一个RGL和神经元后代，没有任何星形胶质细胞(图3C)，而约35%（31个克隆中的11个）的克隆至少含有一种RGL和星形胶质细胞，没有任何神经元后代(图3D)表明非对称的自我更新和单能分化。大多数克隆包含少于6个子代(图4B)，其中三个最大的克隆都包含大量的IPC(图S4A).

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图3

成人齿状回个体RGL长期谱系追踪后的克隆分类

（A–D）主动自我更新克隆的共焦图像样本。（A）中的克隆包含两个巢穴⁺RGL，但没有其他细胞，表明RGL池对称自我更新和扩展。（B）中的克隆由GFAP组成⁺RGL（1），GFAP⁺浓密的星形胶质细胞（2）和神经元谱系的18个细胞簇（3），其中一些表达齿状颗粒细胞标记Prox1，表明自我更新和多谱系分化（参见电影S2). （C）中的克隆由GFAP组成⁺RGL（1）和Tbr2⁺IPCs（2），表明自我更新和单潜能神经源性分化。（D）中的克隆由GFAP组成⁺RGL（1）和GFAP⁺浓密的星形胶质细胞（2），指示自我更新和单潜能星形胶质细胞分化。这个P（P）_c（c）还显示了每个克隆的值。比例尺：10µm。

（E–G）没有RGL的分化克隆的共焦图像样本。（E）中的克隆包含一个成熟神经元，具有突出的树突棘（比例尺：2µm）。（F）中的克隆由两个巢穴组成⁻浓密的星形胶质细胞。（G）中的克隆包含两个Prox1⁺神经元（2个）和一个GFAP⁺星形胶质细胞（3）。比例尺：10µm。

（H） 克隆的共焦图像样本表明两个月内进行了多次自我更新。克隆体由三个巢穴组成⁺RGL（1、2、3）和两个IPC。比例尺：10µm。潜在的血统关系如所示图S3A。

（I） 克隆的样本共焦图像表明在两个月内有多种自我更新和多谱系分化模式，包括对称、神经源性不对称和星形胶质细胞源性不对称自我更新。克隆体由两个巢穴组成⁺RGL（1，2），一个Prox1⁺具有精细树突树状化的成熟神经元（3）和一个S100β⁺星形胶质细胞（4）。比例尺：10µm。潜在的血统关系如所示图S3B。

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图4

标记后不同时间点的克隆属性摘要

（A） 用1倍剂量的三苯氧胺诱导后，在1和2mpi时对不同类型克隆的频率进行量化。数据表示克隆类别的定义子组之间的相对频率。括号中显示了特定类型的数量和子组中克隆的总数。R： RGL；A： 星形胶质细胞；N： 神经元谱系。

（B） 1 mpi时每个克隆内的子代数的直方图。

（C） 定量比较在1和2mpi下观察到的不同克隆组成的频率。使用与（A）中相同的数据集绘制每个齿状回所有克隆中每种类型的频率，以进行比较。R： RGL；A： 星形胶质细胞；N： 神经元谱系。数值代表平均值±SEM（*：P（P）< 0.05; 学生t检验；n=7和13齿状回，分别为1和2mpi）。

（D） 在1、2和12mpi时，具有静止（单个R）的克隆、具有激活的RGL（R+X）的克隆和缺乏RGL（无R）的克隆的频率的定量比较。1和2 mpi使用与（A）中相同的数据集。12 mpi时，用0.5倍剂量的三苯氧胺（n=7齿状回）诱导动物。数值代表平均值±SEM（*：P（P）< 0.05; 学生的t检验）。

接下来，我们用1X三苯氧胺诱导后，在2mpi下对98个克隆的组成进行了表征(图4A). 与1 mpi相比，静止克隆的频率显著降低，而没有RGL的克隆的频率增加(图4C). 在1和2mpi之间，表明对称或非对称自我更新的克隆的频率相似。特别是，克隆显示自我更新和多潜能分化的频率随时间没有显著变化。有趣的是，一个克隆包含三个RGL和两个IPC(图3H;P（P）_c（c）=97.9%），建议在两个月内进行三轮自我更新(图S3A). 另一个克隆包含两个巢穴⁺RGL，一个Prox1⁺具有精细过程的神经元和一个S100β⁺星形胶质细胞(图3I;P（P）_c（c）=97.5%），表明一个RGL在两个月内经历了三种不同的自我更新模式，对称、神经源和不对称(图S3B). 总的来说，每个克隆在1或2mpi时的成熟子代数量很少，只有不到3个神经元或4个星形胶质细胞(图S4B和S4C). 无GFP⁺克隆包含任何NG2⁺少突胶质前体细胞或成熟少突胶质细胞，尽管有大量NG2⁺周围有细胞(图S2B至S2E).

我们还描述了一些动物在12 mpi时用0.5倍剂量的三苯氧胺诱导后的特征，以减少诱导细胞的数量和克隆重叠的概率(图1B,S4D和S4E). 与2mpi相比，静止克隆的频率几乎没有降低，但没有RGL的克隆的频率显著增加(图4D). 重要的是，相当大比例的克隆同时包含RGL（s）和分化后代，这表明激活的RGL可以维持一年(图4D).

综上所述，这些结果表明，在成人齿状回两个月的时间窗内，有很大比例的RGL显示出自我更新和多潜能分化的特性，并且至少有一些激活的RGL在12个月内保持不变，因此，将RGL鉴定为一种内源性多能干细胞。

基于MADM的成人齿状回RGL细胞系追踪

为了使用不同的遗传模型来证实我们的发现，我们采用了MADM报告（双标记镶嵌分析；图S5A) (Zong等人，2005年). 除了稀疏标记外，基于MADM的方法还具有双色系统的优点：G2-X相重组导致GFP和/或RFP标记来自单个有丝分裂事件的两个子细胞及其所有后代，而G1/G0相重组仅产生GFP⁺招标书⁺克隆(图5A). 雀巢CreER^T2段;在没有三苯氧胺注射的情况下，MADM小鼠在整个成年齿状回中没有表现出GFP或RFP的渗漏表达（n=5只动物）。在186至373 mg/kg三苯氧胺（单次静脉注射；2个月大的动物）的范围内，2dpi时在整个成年齿状回内的SGZ中标记了约2个前体，与Z/EG报告者相比，标记效率大大降低(图5B和5亿). 齿状回中大多数标记的前体细胞是RGL（75%；n=15个细胞/10只动物）。有趣的是，所有标记的细胞都是GFP⁺招标书⁺2 dpi时(图5C)与重组时它们处于静止状态的概念一致。因此，MADM报告者允许对成人齿状回中的静止RGL进行更严格的克隆分析。

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图5

基于MADM的巢穴分析⁺成人大脑中的放射状胶质样神经前体

（A） 根据Cre介导的重组时间，示意图显示基于MADM的报告器的潜在颜色组合。G2-X期重组导致两个子细胞及其所有子代在单个有丝分裂事件中的双色标记，而G1/G0期重组仅产生GFP⁺招标书⁺（黄色）克隆。

（B） 他莫昔芬对成年巢蛋白CreER齿状回标记前体数量的剂量反应^T2段;2 dpi的MADM小鼠。数值代表平均值±SD（n=3齿状回）。

（C） 成人齿状回中用GFP和RFP标记的单个RGL的样本投影共焦图像。比例尺：100µm（插入件为10µm）。

（D） 概率克隆概述(P（P）_c（c）)用于MADM研究中所有标记的细胞簇。根据计算模拟计算概率（in图S1C)以及直接测量子代到克隆中心的最长距离(图S5C).

（E） 克隆的共焦图像样本表明在两个月的窗口内有自我更新和多谱系分化。所示为由GFAP组成的克隆的共焦图像⁺RGL（1），未成熟神经元（2），GFAP⁺浓密的星形胶质细胞（3）和一簇IPC（4），以及潜在谱系关系图。比例尺：10µm。

（F） Z/EG（n=98个克隆；与图4A)和MADM记者（n=23个克隆）。绘制了所有动物克隆中每种类型的频率。R： RGL；A： 星形胶质细胞；N： 神经元谱系。

2 mpi时，标记子代到克隆中心的距离测量显示，MADM和Z/EG报告者之间的分布相似(图S5C)，为我们在本研究中定义克隆的标准提供了独立验证。重要的是，2 mpi时的克隆组成显示出包含神经元谱系、星形胶质细胞和RGL的多能和自我更新克隆的频率相似(图5D和5E;P（P）_c（c）≥ 95%). 所有子代均为GFP⁺招标书⁺(图5E和S5D系列). 定量分析进一步表明，Z/EG和MADM报告者之间不同类型克隆的频率相似，包括静止、对称自我更新、不对称自我更新和分化的克隆(图5F). 两位独立报告员的结果聚合在一起，验证了我们的克隆分析方法，并为RGL作为成年小鼠海马内源性自我更新和多能干细胞提供了有力证据。

PTEN在成人齿状回RGL激活和自我更新模式中的作用

为了研究RGL调控行为的分子机制，我们检测了PTEN的作用，PTEN是一种调节多种类型体干细胞的肿瘤抑制剂(Hill和Wu，2009年). 我们生成了nestin-CreER^T2段;Z/EG；铂族^{飞行/飞行}小鼠(图S6A; PTEN cKO小鼠），并使用相同剂量的三苯氧胺进行诱导。与嵌套核心一样^T2段;Z/EG（对照）小鼠，成年PTEN cKO小鼠（n=5只；图S6A). PTEN的免疫染色证实其在GFP中的缺失⁺PTEN cKO小鼠的细胞(图S6B).

接下来，我们研究了目标条件的短期影响Pten公司单个RGL中的删除。在2 dpi时，PTEN cKO小鼠中由单个RGL组成的克隆的百分比显著降低(图6B). 引人注目的是，21%的克隆含有对称分裂的RGL，而在2 dpi的对照小鼠中没有观察到这种情况(图6B). 因此，在基本生理条件下，PTEN在RGL内发挥细胞自主功能，维持RGL的静止并抑制成年齿状回RGL的对称自我更新。

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图6

PTEN在调节成人齿状回RGL的静止、自我更新模式和分化中的作用

（A） 由两个RGL组成的克隆的共焦图像样本铂族在1 mpi时删除。比例尺：10µm。

（B） RGL的快速激活和对称性自我更新铂族单个RGL中的删除。所示为对照组（n=6）和PTEN cKO小鼠（n=5）在2 dpi时RGL的静止和对称自我更新的量化。数值代表平均值±SEM（**：P（P）< 0.01; *:P（P）< 0.05; 学生的t检验）。

（C和D）定量比较1 mpi时对照组（n=7）和PTEN cKO（n=6）不同克隆类型的频率。所示为每个类别之间的相对频率的饼图（C）和所有克隆之间不同类型的频率的汇总（D）。分化克隆的详细分析如所示图S6GR：RGL，A：星形胶质细胞，N：神经元谱系。数值代表平均值±SEM（**：P（P）< 0.01; *:P（P）< 0.05; 学生的t检验）。

神经系统神经干细胞体内分析的克隆方法

以前曾尝试过几种方法在哺乳动物系统中进行克隆谱系追踪(Snippert and Clevers，2011年). 经典的基于逆转录病毒的方法(Sanes等人，1986年;Turner和Cepko，1987年)在发育中或在体内成人大脑中，还没有证明从单个前体细胞分化出自我更新和多谱系分化(Morshead等人，1998年;Suh等人，2007年). 最近开发了基于MADM的遗传方法，用于克隆追踪发育过程中的神经元谱系(Zong等人，2005年). 我们的研究代表了对成人大脑中的神经前体进行体内克隆分析的初步遗传努力。这种方法可能适用于神经系统内外前体的克隆分析。该系统可以通过更好的Cre-driver系列进行改进，以更具体地针对前体亚型和更通用的记者，如五彩纸屑(Snippert等人，2010年)和Brainbow系统(Livet等人，2007年).

我们的基因标记方法具有高度的可重复性，并提供了一个高空间分辨率，用于在最小扰动下分析体内个体前体行为。此外，该方法以静态RGL为目标，由于技术限制，这些RGL基本上无法访问。一些早期的研究依赖于BrdU保留方法来识别静止的前体，这仍然存在争议(Snippert and Clevers，2011年). 其他人则使用抗有丝分裂治疗来消除快速增殖的前体细胞，并选择静止的群体，这并不准确地代表生理条件(Doetsch等人，1999年;Seri等人，2001年). 我们的非侵入性遗传方法带来了一些令人惊讶的发现。首先，在成年小鼠齿状回中，神经前体的星形胶质细胞命运选择似乎被低估了。以前使用BrdU和逆转录病毒的研究表明，神经发生的频率是胶质生成的十倍(Steiner等人，2004年). 相反，克隆分析中星形胶质细胞和神经元生成的频率相似(图4C). 造成这种差异的一个潜在原因是RGL的神经源性不对称分裂产生IPC，IPC会经历多轮细胞分裂(图2D)而RGL的胶质原性不对称细胞分裂产生的星形胶质细胞迅速退出细胞周期(图2E). 此外，星形胶质细胞可以通过RGL的直接分化而不需要细胞分裂来生成(图S6F和S6G). 因此，BrdU和逆转录病毒方法倾向于标记IPC，导致对胶质细胞命运选择的低估。重要的是，我们的研究提供了直接证据，证明胶质细胞的命运选择可以在神经干细胞水平上进行。其次，IPC和神经母细胞的扩增能力似乎未得到充分评价。而不是通过瞬时放大细胞进行估计的1-2轮细胞分裂(Seri等人，2001年)，单个克隆可以在紧密集群中包含多达18个IPC(图3B;电影S2)，建议最多5个细胞周期。第三，在基础条件下，单个RGL的每一轮激活都会产生少量成熟神经元和星形胶质细胞。与最近发现的成人海马神经发生中从IPC向成神经细胞过渡期间的显著细胞死亡一致(Sierra等人，2010年)，本研究中观察到的所有大型克隆都包含IPC。这些结果表明，海马回路紧密地调节新细胞的掺入。

成人大脑中的多功能和自我更新神经干细胞

对于哺乳动物体内系统中单个细胞水平的假定干细胞的基本特性知之甚少(Snippert and Clevers，2011年). 与之前的观察结果一致(Lugert等人，2010年;Seri等人，2001年;Suh等人，2007年)，嵌套⁺GFAP公司⁺基于MCM2表达和MADM分析，RGL基本处于静止状态。一旦激活，在年轻成年小鼠中，相当大比例的RGL在一个月内显示出自我更新和多潜能分化。一些RGL在两个月内经历了三轮细胞分裂和三种不同的自我更新模式(图3H和3I). 虽然许多RGL随着时间的推移而耗尽，但重要的是，在12个月的时间里，激活的RGL中有很大比例得到了维持(图4D). 在300多个克隆中，我们检测到少突胶质细胞系中没有标记细胞，这不是由于报告人的限制。一项使用Z/EG小鼠进行谱系追踪的研究表明，NG2⁺在成人齿状回中，祖细胞产生少突胶质细胞，但不产生新的神经元(Kang等人，2010年). 总之，这些结果表明，在基础生理条件下，神经元/星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系是由成年海马体中单独的前体池产生的。

我们的结果支持了干细胞和祖细胞特性显著异质性的新概念，即使在同一组织内也是如此(李和克利夫斯，2010). 一些RGL表现出自我更新和多谱系分化，少数RGL在长时间内保持不变。其他人表现出单一分化，许多人随着时间的推移分化而没有自我更新。我们的结果不符合一项基于最近在成人海马体群体水平上进行的血统追踪研究提出的“一次性干细胞模型”，该研究表明巢蛋白在成年海马体中的表达与成年海马体细胞的表达有关⁺RGL不可逆地退出静止状态，通过不对称分裂迅速生成多个神经元后代，随后转化为成熟的星形胶质细胞(Encina等人，2011年). 我们在克隆水平上的研究揭示了一个更为复杂的图景，并表明成人大脑中神经干细胞特性的表型表达存在显著的异质性。这种异质性是否是由于RGL和/或其局部生态位的内在属性差异造成的，仍然是一个有趣的问题。我们的结果并不排除在基础条件下和/或刺激后，其他类型的细胞在成人齿状回中表现为自我更新和多能干细胞的可能性，例如Sox2⁺非辐射前兆(Lugert等人，2010年;Suh等人，2007年).

成人脑中RGL自我更新的多种模式

我们的研究揭示了成人大脑中神经干细胞激活的多种模式，并提出了成人海马神经干细胞谱系关系的新模型(图7A). 激活的RGL面临至少四种命运选择(图7A). 神经元谱系始于RGL不对称细胞分裂，产生高度增殖的IPC，之后RGL恢复静止。RGL表现出对称性自我更新的低频率，表明成人大脑具有惊人的能力来放大神经干细胞池。此外，在成人大脑中有两种独立的星形胶质细胞生成途径：一种是通过不对称细胞分裂，另一种是经由过渡型星形胶质细胞直接分化(Brunne等人，2010年). 重要的是，单个RGL有可能在多轮自我更新过程中做出所有这些选择，这一点从包含多个RGL以及神经元和星形胶质细胞谱系的克隆中可以看出(图3I). 因此，总RGL池反映了RGL决策随时间推移的总和：通过静止或不对称自我更新维持，通过终端分化减少，以及通过对称自我更新扩展。

我们的研究还揭示了成人大脑中神经干细胞的独特特征，这些特征似乎与发育中的不同。发育中的大脑中的神经干细胞持续增殖，并以连续的方式呈现出时间分离的对称自我更新、神经发生和胶质生成(Temple，2001年). 相比之下，成人神经干细胞大多处于静止状态，但可以激活以从三种自我更新模式中选择，然后返回静止状态。这些差异是否是由于固有特性和/或其局部生态位造成的，尚待研究。

免疫染色、共焦成像和处理

穿过整个齿状回的冠状脑切片（厚度为45µm）保持序列，并按所述进行免疫染色(Ge等人，2006年). 本研究中使用的抗体列于表S1共聚焦图像用于确认GFP⁺根据免疫组织学和形态学特性进行细胞鉴定(图S1B). 对于3D重建，使用重建1.1.0对整个齿状回的光学堆栈进行连续对齐（国家卫生研究院John C.Fiala）。这些图像是使用内部MATLAB脚本（The MathWorks，Inc.）进行优化的。

我们感谢D.Lee和Song和Ming实验室成员的讨论，感谢G.Fishell分享巢穴核心^T2段小鼠，L.DeBiase检测NG2抗体，J.Song、S.Danzer、C.Song、Y.Namgung、X.Duan和K.Sailor寻求帮助，Q.Hussaini、Y.Cai和L.Liu获得技术支持。这项工作得到了NIH（NS047344，AG024984）和NARSAD向H.S.、NIH（NS048271，HD069184）和MSCRF向G.L.M.的资助。M.A.B.是MSCRF研究员。