实验性心肌梗死触发典型Wnt信号转导和内皮-间充质转化

典型Wnt信号传导在成年小鼠心脏的血管系统和瓣膜中是活跃的

为了了解动脉结扎后缺血损伤后典型Wnt信号的变化，我们首先分析了正常成人心脏中典型Wnt/β-catenin信号。为此，分离TOPGAL转基因小鼠的心脏，并进行β-半乳糖苷酶活性的整体染色和系列组织学分析(图2). 我们的结果表明，在正常心脏中，典型的Wnt信号活动主要存在于心脏底部的大血管和瓣膜中(图2A、B). 组织切片显示，β-catenin信号在主动脉和肺血管的中膜和内膜以及冠状血管和心外膜下微血管中活跃。在瓣膜中，表达主要见于瓣膜间质。

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图2。

正常成年小鼠心脏典型Wnt信号活动。使用TOPGAL小鼠系对成人心脏典型Wnt活性进行整体和组织学分析。（A） X-gal染色的整体心脏显示心脏底部大血管中典型的Wnt活性。该区域的组织切片显示主动脉（左中）、肺（右中）、冠状动脉和心外膜下微血管（右）的中膜和内膜中典型的Wnt活性。（B） 部分切割心脏的全贴X-半乳糖基化染色显示心脏瓣膜中具有典型Wnt活性的细胞（左）。组织切片（两个右侧面板）显示流出道（主动脉）和房室（二尖瓣）瓣膜结缔组织中典型Wnt活性阳性的细胞。（C） TOPGAL小鼠主动脉X-gal染色切片上的抗CD31抗体染色（棕色）显示血管内皮细胞中典型的Wnt活性（箭头所示）。（D） X-染色主动脉切片上的抗-SMA抗体结合（棕色）表明血管周围SMA中典型的Wnt活性（蓝色）⁺细胞。右三个面板是组织切片的IF图像，用识别血管平滑肌细胞（绿色）和β-半乳糖苷酶（红色）中SMA的抗体染色。合并后的图像（最右侧）显示两种抗原在主动脉内膜和中层细胞中的共定位。DAPI用于细胞核（蓝色）的反染。

染色模式表明，典型的Wnt活性标志着心脏内皮细胞和平滑肌细胞的亚群。为了证实这一发现，我们分析了用内皮特异性标记物CD31（PECAM-1）和SMA抗体染色的组织切片(图2C、D). 结果证实了平滑肌和内皮细胞亚群中的表达。综上所述，我们的结果表明，在心脏稳态期间，典型的Wnt活性仅限于内皮细胞和平滑肌细胞的选择亚群，以及瓣膜间充质细胞。

肉芽组织形成过程中梗死区和近梗死区典型Wnt信号被激活

为了测试标准Wnt通路的模式是否因心肌梗死而改变，我们阻断了TOPGAL小鼠的LAD或进行了假手术，在动脉结扎后的特定时间点分离心脏，并对β-半乳糖苷酶活性进行染色。简言之，我们收集了心肌梗死后24小时（细胞死亡和炎症期）、心肌梗死后4-7天（肉芽组织形成期间）和心肌梗死后3周（瘢痕组织成熟时）的心脏(图3A).

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图3。

实验性心肌梗死后典型Wnt信号通路的激活。通过永久性结扎LAD诱导TOPGAL小鼠心肌梗死。假手术动物接受了相同的手术程序，没有进行血管结扎。（A） 缺血性损伤反应的实验时间线和相应阶段的示意图。（B） 在心肌梗死后24小时、4天、7天和3周分离心脏，并用X-gal染色以评估标准Wnt活性。上面板：带有可见缝线的前视图；中间面板：后视图；下面板：感兴趣区域和梗死部位的高分辨率图像。在假手术对照心脏中，β-半乳糖苷酶活性染色在手术后的所有时间点都无法与正常（即非手术）心脏区分，大血管周围有典型的Wnt活性。所显示的假手术例是从手术后7天开始的。同样，与未手术的心脏相比，LAD闭塞24小时后β-半乳糖苷酶染色没有明显变化。相比之下，从心肌梗死后第4天开始，大量X-gal阳性细胞（箭头）出现在心脏血管周围。心肌梗死后7天，梗死区和梗死周围区域出现典型Wnt活性的X-gal阳性细胞（箭头所示）。β-半乳糖苷酶（典型Wnt途径）活性在实验性心肌梗死后3周的损伤区域内未检测到。（C）在LAD闭塞后的指定时间点，使用从小鼠心脏分离的RNA进行实时定量RT-PCR分析。在手术后相同时间点分离的假手术动物的RNA样本作为对照。Sham样本在损伤后的所有阶段都有相似的表达水平。在心肌梗死样本中，典型Wnt信号传导的假定靶基因的峰值表达水平与心肌梗死后第7天β-半乳糖苷酶活性最高的时间一致，除了Myc公司早期（24小时）诱导。*P（P）<0.05;**对<0.01;***P（P）<0.001; NS：不显著。伪装，n个=6; 心肌梗死后24小时，n个=3; MI后7天，n个=6; 心肌梗死后3周，n个=3.

我们的结果表明，在心肌梗死后早期反应期间，典型的Wnt信号未被激活，因为冠状动脉结扎后24小时内分离出的TOPGAL小鼠心脏的X-gal反应性与假手术对照组几乎没有区别(图3B). 相反，LAD结扎后4天，典型的Wnt阳性细胞散布在心肌各处。到心肌梗死后7天，典型Wnt活性主要局限于梗死区和近梗死区的大量细胞。这种激活是暂时的，在梗死后3周消失。

与心肌梗死后TOPGAL小鼠β-半乳糖苷酶染色的时间一致，对在等效时间点采集的RNA样本进行实时定量PCR分析显示，bona-fideβ-catenin信号基因靶点（如Wisp1型,七氟化碳和Myc公司，MI后7天(图3C). 在测试的典型Wnt信号靶点中，Myc公司24小时也表现出强烈的诱导作用，可能是通过独立于典型Wnt信号传导的途径。

内皮细胞和SMA中典型Wnt信号被激活⁺心肌梗死后的细胞

颗粒组织形成的特征是内皮细胞增殖并萌芽形成新血管，肌成纤维细胞活化并迁移以沉积胶原蛋白，从而形成瘢痕。为了确定这一阶段典型Wnt信号活动标记的细胞类型，我们分析了LAD闭塞或假手术7天后TOPGAL小鼠心脏的组织切片。我们发现，心肌梗死后梗死区周围内皮细胞增多，其中存在活跃的典型Wnt信号。然而，MI后第7天在整个支架图像中观察到的强烈染色(图3)主要是由于大量心外膜下间充质样细胞的重新出现，这些细胞具有典型的Wnt信号活性(图4A). 心外膜细胞亚群中也存在典型的Wnt信号激活。

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图4。

典型Wnt活性标志着心肌梗死后内皮细胞和肌成纤维细胞。在LAD闭塞或假手术后7天，对TOPGAL小鼠心脏进行典型Wnt活性的组织学分析。（A） X-gal染色小鼠心脏的组织切片显示，在假心脏组织中，β-半乳糖苷酶（典型Wnt信号传导）的活性仅限于冠状血管的内皮细胞和周细胞以及微血管内皮细胞中（左图）。心肌梗死后，除了冠状血管和微血管外，典型Wnt信号标志着梗死区周围新出现的心外膜下间质样细胞和心外膜细胞亚群（中间两个面板）。相比之下，在心内膜下区域（右图）不存在典型Wnt信号传导活跃的细胞。（B） TOPGAL小鼠心脏组织切片的免疫组织学分析。在X-染色的心脏组织上使用抗CD31抗体的IHC显示近红外区内皮细胞（棕色）的典型Wnt活性（蓝色）（白色箭头）。右侧三个面板显示了使用抗β-半乳糖苷酶（绿色）和-CD31（红色）抗体获得的IF结果，以及相应的合并图像。典型的Wnt活性标记内皮细胞（白色箭头）。显示了无典型Wnt活性的内皮细胞（红色箭头）和非内皮、典型Wnt横向活性细胞（绿色箭头）的示例。DAPI用于细胞核（蓝色）的反染。（C） 使用TOPGAL小鼠X-gal染色心肌组织切片上的抗SMA抗体进行IHC分析，显示SMA中典型的Wnt活性（蓝色）⁺近红外区的细胞（棕色）（白色箭头）。右侧三个面板显示了使用抗β-半乳糖苷酶（绿色）和-SMA（红色）抗体获得的IF结果，以及相应的合并图像。蓝色是核DAPI复染。标准Wnt活动标志SMA⁺单元格（白色箭头）。绿色箭头指向SMA^——具有典型Wnt通路活性和SMA红色箭头的细胞⁺缺乏典型Wnt活性的细胞。SMA的一部分^——具有典型Wnt通路活性的细胞是巨噬细胞（补充材料图S1）。（D） 通过计算每个视野中双X-gal/CD31染色和单个CD31阳性细胞的数量，对典型的Wnt-活性标记内皮细胞进行量化。标准Wnt-active SMA⁺细胞数量通过计算SMA表达的X-gal阳性细胞数量在给定视野中占总细胞数的百分比或占总SMA的百分比进行量化⁺细胞数量。*P（P）<0.05;***P（P）<0.001. 对照组假手术，n个=5; MI样品，n个=5.

使用识别内皮标志物CD31和肌成纤维细胞标志物SMA的抗体进行的免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）分析证实，心肌梗死后7天，梗死和梗死周围区域的内皮细胞和SMA表达细胞中有典型的Wnt信号传导活性(图4B，C). 近红外区的巨噬细胞也以典型Wnt活性进行标记（补充材料图S1）。为了测量典型的Wnt-signaling阳性细胞的增加，我们计算了CD31⁺和SMA⁺梗死区和近梗死区标记有β-半乳糖苷酶活性的细胞，并将测量值与假手术小鼠相应心脏组织部位的细胞计数进行比较。结果表明，心肌梗死后，以β-半乳糖苷酶活性标记的内皮细胞比例从正常心外膜下心肌组织的约30%增加到50%，β-半乳糖苷酶阳性SMA表达细胞的总比例从几乎无法检测到的水平增加到整个心外膜下细胞群的12%。最后，β-半乳糖苷酶（典型Wnt途径）标记的SMA⁺细胞约占SMA的40%⁺此区域中的单元格(图4D).

MI后诱发EndMT

内皮细胞和SMA中经典Wnt活性的同时激活⁺细胞增加了后者来源于活化内皮的可能性。与这一概念一致，当尖端细胞获得间充质表型时，EndMT与血管生成和血管分支过程中不同器官的组织修复有关(Gerhardt等人，2003年). EndMT也与主动脉结扎后肌成纤维细胞的生成和心脏纤维化有关(Zeisberg等人，2007年).

EndMT的标志性特征包括内皮和平滑肌基因标记物（如CD31和SMA）双重阳性细胞的出现(Paruchuri等人，2006年;Goumans等人，2008年). 检查CD31是否⁺/座椅模块组件⁺实验性心肌梗死后出现双阳性细胞，我们通过IF分析心脏组织切片。我们发现大量双阳性CD31⁺/座椅模块组件⁺细胞，表明EndMT发生在MI后(图5A).

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图5。

心肌梗死后诱发终末MT。（A） 用识别心肌梗死后7天分离的小鼠心脏切片上CD31（红色）和SMA（绿色）的抗体进行IF分析。下面板是装箱区域的放大倍数较高。右侧相应的合并图像显示CD31和SMA共存的细胞（箭头）。DAPI用于细胞核（蓝色）的反染。（B） 心肌梗死或假手术后7天，使用从梗死周围组织分离的细胞，用抗CD31和-SMA抗体进行FACS分析。心肌梗死后第7天CD31和SMA双阳性细胞的数量显著增加（红圈）。完整的FACS数据集包含在补充材料图S2中。（C） FACS分析样本中CD31和SMA双阳性细胞的定量***P（P）<0.001. 对照组假手术，n个=3; MI后7天，n个=3.（D）实时定量RT-PCR分析上皮-间充质转化（EMT）或EndMT相关基因的表达，使用来自MI后特定阶段分离的TOPGAL小鼠心脏的RNA样品，如所示。推测EMT-和/或EndMT相关基因的峰值表达水平发生在MI后7天肉芽组织形成期间***P（P）<0.001; NS：不显著。对照组假手术，n个=6; MI后24小时，n个=3; 7天，n个=6; 3周，n个=3.（E）使用抗β-半乳糖苷酶（绿色）和蜗牛（红色）抗体对TOPGAL小鼠心脏切片进行IF分析。DAPI用于核复染（蓝色）。右侧面板是合并图像中方框区域的更高放大倍数。合并的图像显示，典型的Wnt-signaling活性细胞也表达EMT调节蛋白蜗牛（橙色；箭头）。

为了验证和量化这些结果，在手术后7天，将LAD闭塞或假手术小鼠的心脏组织分离为单细胞制剂，用CD31和SMA抗体染色，并用FACS分析。如所示图5B以及补充材料图S2，在心肌梗死后7天，表达CD31和SMA的双阳性细胞显著增加。具体来说，CD31的百分比⁺/座椅模块组件⁺正常心脏组织中的细胞数量从不足1%增加到几乎占分离细胞总数的25%(图5C).

其他与间充质转化相关的基因包括蜗牛(Medici等人，2006年;Kokudo等人，2008年)，Fsp1型(Zeisberg和Neilson，2009年)，波形蛋白(Milsom等人，2008年)，基质金属蛋白酶2(Song等人，2000年;Duong和Erickson，2004年)，Tgfβ1(Tavares等人，2006年;Zeisberg等人，2007年;Goumans等人，2008年)和第1A1列(Zeisberg等人，2007年;Hashimoto等人，2010年). 心肌梗死后不同时间点EndMT相关基因表达的实时定量RT-PCR分析显示蜗牛,Fsp1型,生长因子β1、波形蛋白和第1A1列对应CD31的外观⁺/座椅模块组件⁺心肌梗死后第7天的细胞(图5D).

为了测试调节间充质转化的蛋白质（如蜗牛）是否在典型Wnt阳性细胞中发生诱导，我们在心肌梗死后7天对TOPGAL小鼠的心脏组织切片进行染色。结果表明，蜗牛在具有典型Wnt信号活性的细胞中表达(图5E). 总之，我们的结果表明，EndMT发生在缺血性损伤后，并在肉芽组织形成期间达到最高点。此外，典型的Wnt活性标志着细胞正在经历EndMT。

以典型Wnt活性标记的心肌梗死后肌成纤维细胞的内皮起源

为了证实近场间充质细胞的内皮起源，我们将内皮细胞SCL-Cre-ER交叉^T型小鼠系，其中SCL公司基因座驱动他莫昔芬诱导的Cre-ER^T型(Göthert等人，2004年)，到R26RstoplacZ公司鼠标线(索里亚诺，1999年). 这个SCL公司基因在造血细胞和内皮细胞中表达(Sanchez等人，1999年). 然而，5′增强子已被证明仅在内皮细胞中有效，因此可以对内皮细胞及其后代进行特异性和永久性的基因标记(Sinclair等人，1999年;Göthert等人，2004年).

我们注射了双转基因系的成年后代SCL-Cre-ER公司^T型/R26RstoplacZ公司命名为end-SCL-lacZ小鼠，用三苯氧胺诱导Cre重组酶并标记内皮细胞。最后一次三苯氧胺给药后7天，小鼠接受LAD或假手术。手术后7天的组织学分析表明，在假手术小鼠中，β-半乳糖苷酶的表达仅限于内皮细胞以及主动脉周围和瓣膜中的一些间充质细胞(图6A; 补充材料图S3）。相反，LAD闭塞小鼠的心脏组织中，β-半乳糖苷酶阳性内皮细胞和表达β-半乳糖苷酶的间充质细胞增加(图6A). 抗-SMA染色证实在血管周围和心外膜下梗死区存在双阳性β-半乳糖苷酶/SMA细胞(图6B).

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图6。

标准Wnt-signaling-marked SMA⁺ 细胞来源于内皮细胞。End-SCL-lacZ双转基因小鼠每隔一天用三苯氧胺治疗10天，以诱导Cre-ER^T型重组酶并对内皮细胞及其后代进行基因标记。在最后一次给药他莫昔芬后7天，对小鼠进行LAD闭塞或假手术。（A） 冠状动脉结扎或假手术后7天的X-半乳糖染色和组织学分析。在假手术小鼠中，Cre重组酶的诱导仅标记心外膜下区域的内皮细胞（上面板；箭头）。相比之下，在心肌梗死后第7天的组织切片中，β-半乳糖苷酶活性标记了内皮细胞和间充质样细胞（箭头所示），表明后者起源于内皮细胞（下图）。（B） 在心梗后7天，用抗SMA抗体对tamoxifen治疗的终末期SCL-lacZ小鼠的X-gal染色心肌组织切片进行IHC分析。心肌梗死样品心外膜下近端区域观察到双β-半乳糖苷酶/SMA阳性细胞，而假对照组没有，表明SMA⁺细胞来源于内皮细胞。左下角的面板显示了放大倍数较高的方框区域。箭头表示SMA/β-半乳糖苷酶双阳性细胞。该图量化了典型Wnt活性和SMA双阳性细胞占总SMA的百分比⁺心外膜下组织中的细胞***P（P）<0.001;n个=14个视野。（C） 使用抗β-catenin抗体对三苯氧胺治疗的终末期SCL-lacZ小鼠心肌梗死后7天的X-gal染色心肌组织切片进行IHC分析。左侧面板：假对照显示β-catentin在心肌细胞（白色箭头）和内皮细胞亚群（白色箭头所示）的夹层盘中积聚。中间和右侧面板：心肌梗死后7天，间充质细胞中也存在核β-catenin（黑色箭头）。黑色箭头表示心肌细胞间盘中的β-连环蛋白染色。右侧面板显示了中间图像中方框区域的放大倍数。

组织切片定量显示β-半乳糖苷酶⁺/座椅模块组件⁺细胞占心外膜下SMA的35–40%⁺细胞群(图6B). 因为三苯氧胺诱导仅标记了一小部分常驻内皮细胞，所以这个数字很可能低估了内皮源性SMA⁺细胞。

因为典型Wnt通路信号峰值与EndMT活性最高的时间一致，所以我们研究EndMT衍生的间充质细胞是否具有典型Wnt活性。在本实验中，我们使用识别β-catenin的抗体分析了LAD或假手术后7天tamoxifen治疗的终末期SCL-lacZ小鼠的心脏组织切片。结果显示，内皮来源的β-半乳糖苷酶染色的间充质细胞中存在核β-连环蛋白，表明EndMT-derived细胞具有典型的Wnt活性(图6C).

实验性MI

小鼠在麻醉下接受了开胸手术。手术期间，将10-0尼龙缝合线穿过心肌，插入左前降动脉周围的左心室前外侧壁，并永久结扎血管。手术后，胸腔被关闭，动物们得以康复。在手术后的特定时间点，即第1天、第4天、第1周和第3周，对小鼠实施安乐死，并分离整个心脏进行X-半乳糖染色和组织学分析，或用于获取RNA以进行基因表达研究。假手术动物在没有冠状动脉结扎的情况下进行了类似的手术。在范德比尔特小鼠心血管病理生理学和并发症核心进行手术。

全组织染色法测定β-半乳糖苷酶活性

将整个心脏分离到冷的1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后在4°C下，在含有1%甲醛、0.2%戊二醛和0.02%NP40的1×PBS溶液中固定30分钟。固定后，用1×PBS清洗心脏两次，每次20分钟，然后在30°C的X-gal染色溶液中放置过夜（1 mg/ml X-gal，5 mM铁和铁氰酸钾，以及2 mM氯化镁在1×PBS中）。拍下整颗心脏的照片，然后将其保存在4°C的1×PBS中，直至嵌入石蜡中并切割成5μm的切片。切片脱蜡，用曙红进行反染色，脱水并装裱。

免疫荧光和免疫组织化学

对于心脏组织切片的IF实验，将新鲜分离的心脏嵌入最佳切割温度复合物（OCT）中，并切割成5μm的切片。抗体染色前，将载玻片在室温下解冻，浸泡在4%多聚甲醛中，并在冰上固定5分钟。将载玻片在1×PBS中清洗三次，每次清洗5分钟。切片在1%牛血清白蛋白（BSA）和0.05%皂苷的1×PBS溶液中在室温下封闭1小时。然后在4°C下用一级抗体孵育切片过夜。然后，将载玻片在1×PBS中洗涤三次，每次洗涤5分钟，在室温下与二级抗体孵育1小时，在1×PBS中洗涤3次，每次清洗5分钟，并用VECTASHIELD荧光固定介质（Vector Laboratories）固定。

对于IHC染色，β-半乳糖苷酶染色的石蜡包埋心脏的5μm切片按照标准方案通过组织透明和分级酒精脱蜡。将载玻片浸入0.3%过氧化物酶溶解于封闭溶液中5分钟，在室温下淬灭内源过氧化物酶活性。然后封闭切片并用上述IF的一级抗体染色。然后，在1×PBS中各清洗切片三次，每次5分钟，然后在使用小鼠或兔子一级抗体时用ImmPress通用试剂（Vector Laboratories）孵育，或在使用大鼠初级抗体时使用抗-Rat Ig马兔过氧化物酶检测试剂盒（BD Pharmingen）。根据制造商的说明使用套件。对载玻片进行复染、脱水并用Permount组织学贴装介质（Fisher）贴装。组织学服务由范德比尔特组织学中心提供。

用于组织学分析的抗体及其在封闭溶液中的各种稀释液为：抗β-半乳糖苷酶的兔IgG组分（Cappel Pharmaceuticals；1:2000稀释）、抗SMA的单克隆小鼠抗体（Sigma；1:800）、抗β-catenin的单克隆鼠抗蜗牛抗体（Chemicon；1:600）、，大鼠抗鼠CD31/PECAM1（BD Pharmingen；1:100）和大鼠抗小鼠F4/80（Abcam；1:100。用于IF的二级抗体为：山羊抗小鼠Cy3-偶联抗体、驴抗兔Cy3抗体、山羊抗鼠Cy3、山羊抗小鼠Alexa-Ffluor-488抗体和山羊抗兔Alexa-Ffruor-488。Cy3-结合抗体来自Jackson ImmunoResearch，Alexa-Fluro-488结合抗体来自Invitrogen。二级抗体以1:200的稀释度使用。为了可视化和量化IF实验中的细胞，心脏组织切片用荧光染料4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；1:5000稀释；Invitrogen）染色以标记细胞核。

对于bEnd.3细胞上的IF，细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠和1×抗生素抗真菌混合物（Sigma）的DMEM（Gibco）中培养，放在Nunc Lab-Tek室载玻片上。用5μM GSK-3β抑制剂BIO IX（CalBiochem；Cat#361550）或5μM其非活性类似物甲基-BIO（MeBIO；CalBiocchem；Cat#361556）处理细胞1、4、24或48小时。用1×PBS清洗细胞，并在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。用1×PBS清洗细胞三次，每次5分钟，用0.2%Triton X-100在1×PBS中在室温下渗透30分钟，用1×PBS清洗三次，每个5分钟。在室温下用1 mg/ml BSA在1×PBS中封闭固定细胞30分钟，然后在4°C下与初级抗体孵育过夜。第二天，用1×PBS清洗细胞三次，每次5分钟，用二级抗体在室温下孵育1小时，用1 x PBS清洗三次，每个5分钟。用荧光染料DAPI（1:5000稀释）标记细胞核。使用的主要抗体是：单克隆小鼠抗SMA（1:800）、大鼠抗CD31（1:100）和单克隆小鼠抗β-连环蛋白（Sigma；1:800）。作为第二抗体，我们使用山羊抗小鼠Cy3缀合物（1:600）和驴抗大鼠Alexa-Fluor-488（1:400）。

荧光辅助细胞筛选分析

心肌细胞耗尽的心肌细胞悬浮液的制备如下。在主动脉底部切开后，清洗小鼠心脏以清除血液并无菌隔离。中庭被完全拆除。用10 mg/ml胶原酶II（Worthington）、2.4 U/ml dispase II（Roche Diagnostics）和DNA酶IV（Sigma）在2.5 mM CaCl中对心室进行粉碎和消化₂在37°C下保持20–25分钟，然后通过细胞过滤器。将肌细胞耗尽的细胞悬浮液在1500℃离心克5分钟，并在含有0.5%BSA和2 mM EDTA的1×PBS中重新悬浮。

为了防止非特异性结合，用FcR阻断试剂（Miltenyi Biotec）培养细胞。然后是单细胞悬浮液（10⁶细胞/ml）使用藻红蛋白缀合的抗小鼠CD31（克隆390；eBioscience）和周青素叶绿素蛋白缀合的抗CD45（克隆30-F11；eBioscience）进行标记。细胞在4°C下培养20分钟，清洗并重新悬浮在PBS/BSA/EDTA缓冲液中。

细胞内染色检测SMA时，用4%多聚甲醛和0.1%皂苷固定细胞，并在1×PBS中渗透⁵100μl缓冲液中的细胞）与异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗SMA（Sigma）在4°C下孵育30分钟。接下来，用0.1%皂苷清洗细胞一次，并将其重新悬浮在含有0.5%BSA和2 mM EDTA的1×PBS中。数据采集在范德比尔特流式细胞术核心的FACScalibur流式细胞仪（BD Immunocytometry Systems）上进行，数据使用WinList 5.0软件进行分析。抗原阴性背景结合由同型对照的荧光强度定义。

细胞培养和荧光素酶分析

在第六段和第八段之间使用BAEC。细胞在含有10%FBS、1%Pen-Strep和1%L-谷氨酰胺的标准高糖DMEM中培养。用5μM GSK-3抑制剂IX（BIO）或同等体积的溶媒溶液（DMSO，Sigma）处理细胞。

bEnd.将3个小鼠内皮细胞接种在12孔板（5×10）中⁴细胞/孔），生长48小时，然后转染0.48μg Super TOPFlash质粒（Addgene；质粒12456），编码萤火虫荧光素酶基因和0.02μg pRL-TK雷尼利亚荧光素酶报告载体（Promega），隔夜使用FuGENE6（Roche Molecular Biochemicals）作为转染剂，并遵循制造商的规范。第二天，用1μM BIO或1μM MeBIO刺激细胞6小时。DMSO处理作为对照。使用Promega的双荧光素酶报告试验测定荧光素素酶活性。萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶活性和数据报告为基底（DMSO，载体）上的折叠诱导。

常规定量RT-PCR分析

按照制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）和使用RNase easy迷你试剂盒（Qiagen）从小鼠心脏中分离出总RNA。

为了将RNA反向转录为cDNA，将3μg RNA与100 ng寡核苷酸（dT）混合₁₅并在65°C下培养5分钟。1 mM dNTP、60 mM KCl、15 mM Tris-Cl、pH 8.4、3 mM MgCl₂添加0.3%吐温20、10 mMβ-巯基乙醇、10 U RNasin（Promega）和100 U Mo-MLVRT（Invitrogen），并在37°C下培养55分钟。在95°C下培养5分钟，使酶失活。接下来，将20 ng cDNA与Taq DNA聚合酶（Promega）和相应引物在0.25μM浓度下孵育35个周期（95℃下1分钟，60–65℃下1 min，72℃下1 min.）。β-肌动蛋白或Gapdh公司被用作内部控制。在iCycler（BioRad）上使用iQ SYBR Green Supermix试剂盒（BioRad）进行定量PCR。相对基因表达水平使用2^{（–DDCt）}公式(Livak和Schmittgen，2001年). 引物序列已包含在补充材料表S1中。

我们感谢马莲丽和王志章为MI小鼠模型的手术程序和超声心动图；Joel Walthall提供图像帮助；和布莱恩·菲奥雷特对手稿进行批判性阅读。我们还感谢Joachim Göthert、Glen Begley和Scott Baldwin提供的转基因SCL小鼠。这项工作得到了国家卫生研究院赠款HL083958型; 和HL100398型至A.K.H。，NIGMS向范德比尔特大学医学科学家培训项目授予T32GM07347，以及美国心脏协会O.A.博士前奖学金。