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神经科学杂志。2008年12月31日；28(53): 14341–14346.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.2390-08.2008
预防性维修识别码：PMC3124002
NIHMSID公司：NIHMS85633标准
PMID：19118166
特维（Twij）

双功能microRNA miR-9/miR-9*调节REST和CoREST并在亨廷顿病中下调

艾米·帕克,15 宜兴,14 斯科特·哈珀,6 莱斯利·琼斯,78和贝弗利·戴维森12三5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

转录因子REST使非神经元细胞中的神经元基因表达沉默。在神经元中，部分蛋白质通过与亨廷顿蛋白结合而被隔离在细胞质中。亨廷顿蛋白中的聚谷氨酰胺扩张导致亨廷顿病（HD），从而消除REST-huntingtin结合。因此，REST易位到细胞核，占据RE1阻遏物序列并降低神经元基因表达。在这项工作中，我们发现与健康对照组相比，HD患者皮层中具有上游RE1位点的几种microRNA（miRNAs）水平降低。有趣的是，其中一种富含双功能脑的miR-9/miR-9*靶向REST复合体的两个成分：miR-9靶向REST*，miR-9*靶向CoREST。这些数据为REST沉默复合物及其调节的miRNAs之间的双负反馈环路提供了证据。

关键词：miRNA、REST、亨廷顿病、皮层、协调、RNA干扰

介绍

亨廷顿氏病（HD）是一种常染色体显性神经退行性疾病，由CAG三核苷酸重复扩增引起亨廷素，对亨廷顿（Htt）进行编码(亨廷顿病协作研究小组，1993年). HD患者经历了异常的运动、认知能力下降和精神障碍，经常导致过早死亡。虽然Htt广泛表达，但HD患者主要表现为中枢神经系统症状。HD患者的分子表型之一是纹状体和不同皮层区域的转录调控异常(Hodges等人，2006年). 转录改变的一个潜在机制是转录抑制因子RE1沉默转录因子（REST，也称为神经限制性沉默因子，NRSF）的异常细胞分布(Lunyak等人，2002年;Zuccato等人，2003年,2007).

REST在多能干细胞中表达最高，限制神经前体细胞和随后的神经元表达后表达降低(Ballas等人，2005年). 在成熟、健康的神经元中，REST表达水平较低，部分通过与Htt的相互作用而被隔离在细胞质中(Zuccato等人，2003年). 然而，在HD患者中，突变型Htt未能结合REST，导致其核移位(Zuccato等人，2003年). 一旦进入细胞核，REST可以结合RE1共有序列并招募包括mSin3、REST共有抑制因子1（CoREST，也称为RCOR1）和甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）在内的共有抑制因素(Andrés等人，1999年)使神经元特异性基因失活(Zuccato等人，2003年;Conaco等人，2006年). 同样，与miRNA转录物上游RE1序列结合的REST阻遏物复合体可能改变miRNA表达谱(Conaco等人，2006年;Klein等人，2007年).

MiRNAs是小的非编码RNA，通过与mRNAs的3′非翻译区（UTR）的序列互补参与转录后调控。miRNA与其靶mRNA的结合通常通过mRNA降解或翻译抑制导致其翻译抑制(巴特尔，2004年). 鉴于它们在调节细胞过程中的基本作用，如细胞命运、身份和功能(Sempere等人，2004年;Kim等人，2007年;Makeyev等人，2007年)，我们筛选了一组预测的REST调节的miRNAs(Jothi等人，2008年)采集自健康对照组和HD患者大脑的样本（HD等级1-4）。我们的数据显示，miRNA在HD进展过程中调控不当，而且有证据表明，miR-9/miR-9*是一种REST调节的miRNA，靶向REST沉默复合物的两个成分。

材料和方法

人体组织。

尸检脑样本取自纽约大脑库（纽约哥伦比亚大学）、哈佛大脑库（马萨诸塞州剑桥哈佛大学）和新西兰神经基金会大脑库（新西兰奥克兰大学），并征得家属的知情同意。组织取自健康对照组Brodmann的4区（BA4）皮层(n个= 7; 46–62岁）和HD 1级(n个= 7; 42–70岁），2(n个= 6; 年龄45–78岁），3(n个= 2; 年龄60–65岁），和4岁(n个= 4; 53–60). 对照组CAG重复长度为16–21；HD 1-4级为37-46。脑样本的尸检时间为2–20小时。

miRNA表达谱。

使用TRIzoL（Invitrogen）从皮层收集RNA。根据ABI Prism 7900HT上的制造商，使用TaqMan阵列人类MiRNA面板v1.0（TLDA）或TaqMan-MiRNA分析（应用生物系统；ABI）通过定量PCR（QPCR）获得成熟MiRNA的表达谱。成熟miRNAs归一化为RNU48，显示为相对于对照组的折叠变化。

克隆3′UTRs和内源性miRNAs。

REST的3′UTR（NCBI 362005年10月）（补充图S2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料)通过对从TRIzoL（Invitrogen）分离RNA制备的cDNA进行测序，然后使用扩展高保真DNA聚合酶（RocheApplied Science）和3′UTR特异性引物进行PCR扩增，在NT2、神经母细胞瘤、A549、HEK 293和HeLa细胞中验证网址：www.jneurosci.org). REST和CoREST 3′UTR均从HEK 293 cDNA克隆到雷尼利亚荧光素酶。从HEK 293基因组DNA中扩增人miR-9–3基因座，并将其克隆到含有Pol III小鼠U6启动子的Zero Blunt TOPO（Invitrogen）中。如上所述，克隆了mU6 miR-124a-1和miR-132发夹。

完美的目标控制。

通过络合8μ米含有与成熟miRNA和随机侧翼序列完全互补的位点的正、反义寡核苷酸。PCR循环在94°C 15 s、67°C 30 s、72°C 1 min条件下进行2次，并在72°C条件下延长1 min，然后在下游克隆雷尼利亚荧光素酶。

细胞培养、转染和荧光素酶分析。

HEK 293和NT2[NTERA-2 c1.D1，批号4742175，取自ATCC（CFL-1973）]细胞，在37°C和5%CO条件下，在补充10%热灭活胎牛血清的DMEM中培养2按照制造商的说明，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在24孔板上转染细胞三次，转染4 ng psiCHECK-3′UTR质粒和4–400 ng mU6 miRNA或pre-miR-9，9*或阴性对照（Ambion）。通过与mU6 miR-9/miR-9*和抗miR9–3、9–3*或阴性对照（Ambion）共同转染psiCHECK-3′UTR质粒进行抗miRNA拯救实验。对于NT2分化，0.01 m米向培养基中添加全反式维甲酸（Sigma-Aldrich）5天。

24小时后在月光光度计（PharMinen）上测量荧光素酶。雷尼利亚荧光素酶被归一化为萤火虫荧光素酶，并显示为相对于对照组。

“靶点保护物”（TSP）被设计为反义，以预测REST和CoREST的3′UTR MRE（补充方法，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 优化的TSP是与M.Behlke，Integrated DNA Technologies一起设计的，使用时间为0.01–0.1 n米.

siRNA。

用5n转染HEK 293和NT2细胞米消音器将siRNAs选择为REST（s11933）（si-REST），或如上所述的加扰阴性对照（si-NEG）（Ambion）。48小时后用TRIzol（Invitrogen）提取总RNA，用高效cDNA逆转录试剂盒逆转录，然后用REST或18s rRNA TaqMan基因表达分析（ABI）进行QPCR分析。

蛋白质斑点。

使用RIPA缓冲液（Pierce）和1×蛋白酶抑制剂使用标准技术采集蛋白质，并使用DC类蛋白质测定（生物试剂盒）。蛋白质提取物在7%丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至Immobilon PDVF转移膜（Millipore）。使用REST/NRSF（1:500；ab21635）、CoREST（1:1000；ab56165）（均为Abcam）和β-肌动蛋白（1:10000；Sigma）的一级抗体。使用ECL Plus Western印迹检测系统（GE Healthcare）开发印迹，并由AlphaEase FC（Alpha Innotech，5.0.1版）进行量化。

统计分析。

数据通过单因素方差分析进行分析，然后是Dunnett的事后（post-hoc）分析（GraphPad InStat，GraphPadSoftware，3.06版）。

结果

miRNA表达随HD进展而变化

为了确定miRNA是否与HD疾病进展有关，我们从对照组和HD 1-4级脑样本中分离出总RNA。我们特别选择了Brodmann的4区（BA4）皮层，因为先前的研究表明HD患者该区域存在广泛的转录变化(Hodges等人，2006年). 我们发现，随着HD分级的增加，五种预测的REST调节的miR显著不同：miR-9(F类(3,22)= 9.876,对=0.0003），miR-9*(F类(3,22)= 6.799,对=0.0021），miR-29b(F类(3,22)= 3.658，p=0.0281），miR-124a(F类(3,16)= 7.833,对=0.001）和miR-132(F类(3,22)= 7.611对= 0.0011) (图1A类). 对于miR-139、miR-135b和miR-212，随着疾病严重程度的增加，未观察到显著差异，而miR-218表现出随着疾病等级的增加而增加的趋势(图1A类). 约翰逊及其同事先前的工作测量了未知疾病等级的HD脑中前体miRNA水平(Johnson等人，2008年). 有趣的是，与我们的发现相反，他们的研究表明miR-124a没有变化，miR-29a水平升高，miR-132水平降低。我们发现早期HD患者组织中miR-29a有增加的趋势，随后降低。此外，我们发现miR-132在第1和第2阶段没有变化，但随后显著上调。前体的差异(Johnson等人，2008年)鉴于最近的报道描述了miRNA的转录后调控，与成熟miRNA水平相比（本研究）并不奇怪(Obernosterer等人，2006年;Lee等人，2008年).

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一些REST调节的miRNA水平随着HD进展而改变，miR-9/9*靶向沉默复合物。A类，通过QPCR测量HD和健康对照皮质（BA4）HD 1、2和3/4级中REST调节的miRNAs的纵向表达谱。与对照组相比，HD脑中成熟miRNA水平(*对< 0.05, **对< 0.01).B类,C类miR-9/9*减少含有REST或CoREST的3′UTR的报告蛋白的表达。B类，HEK 293细胞与表达miR-9/9*（mU6 miR-9/9*）和REST 3′UTR荧光素酶报告子的载体共转染。24小时后测量相对荧光素酶活性。相对于靶点增加mU6 miR-9/9*的剂量导致相对荧光素酶的剂量依赖性降低。包含与成熟miR-9（miR-9-PT）或miR-9*（miR-9*-PT）具有完美互补性的单位点控制载体作为阳性对照(n个= 3).C类，实验如中所示(B类)CoREST 3′UTR荧光素酶报告员(n个= 3).D类,E类用mU6 miR-9/9*转染HEK 293细胞24小时后，REST和CoREST蛋白表达水平均降低。D类，典型的Western blots和密度测定(E类)休息(n个=5）和CoREST(n个= 5). 直方图显示β-肌动蛋白水平归一化后的平均值±SEM*对< 0.05, **对< 0.01.

接下来，我们使用基于QPCR的miRNA阵列平台评估了对照组和早期HD（1级和2级）BA4皮质中365个成熟miRNA的表达谱。我们发现HD1和/或HD2样本中又有7个miRNAs减少（补充表1，见网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 此外，与对照组相比，HD1样本中的miR-196a和miR-486分别显著增加近六倍和三倍。这些结果为HD中选择的miRNA的差异调节提供了额外的证据。

REST和CoREST包含预测的miR-9和9*调控位点

MiR-9和MiR-9*，在HD早期降低(图1A类)来自3个基因组位点（miR-9-1、9-2和9-3）的同一初级转录物；miR-9-1和miR-9-3都具有可被REST占用的上游RE1序列(Conaco等人，2006年;Johnson等人，2008年). 我们从HEK 293细胞中扩增了人类miR-9–3基因座，并将其克隆到小鼠U6启动子（mU6 miR-9/9*）下游，用于异源表达miR-9/miR-9*。克隆的mU6 miR-9/9*质粒导致miR-9和miR-9*的高效表达和处理，这是通过敲除完全靶控物（PT）确定的（补充图S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).

miR-9和9*的预测靶点包括REST和CoREST[TargetScan 4.1(Lewis等人，2003年)]. 考虑到REST阻遏物复合体在HD基因错误调节中的假定作用，这很有趣(Zuccato等人，2003年). REST的3′UTR（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)和CoREST（补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)包含miR-9、miR-9*、miR-132和miR-124a的miRNA识别元件（MRE）（仅限CoREST）(吴和谢，2006). 作为miR-9/9*和REST或CoREST相互作用的首次测试，我们从基因编码下游克隆了REST和CoREST的3′UTR雷尼利亚荧光素酶。mU6 miR-9/9*与REST或CoREST-3′UTR报告子结构的共转染显著降低雷尼利亚荧光素酶活性与对照组比较(F类(2,6)= 333.08,对=0.0001和F类(2,6)= 16.134,对REST和CoREST分别为0.0034）(图1B类,C类). 与这些基于报告的分析一致，在HEK 293细胞中过度表达mU6 miR-9/9*，而不是mU6 milR-124a或132，显著降低了REST(F类(2,12)= 26.006,对=0.0001）和CoREST(F类(2,12)= 24.017,对=0.0001）表达式(图1D类,E类). 因此，miR-9/9*的CoREST和REST中预测的MRE是功能性的，而不是miR-124a和miR-132(图1D类,E类).

miR-9以REST为目标

REST全长3′UTR（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)和CoREST（补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)含有几个预测的miR-9和miR-9*的保守MRE位点。因为mU6 miR-9/9*在加工后产生成熟的miR-9和miR-9*（补充图S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)，我们使用释放单个成熟miRNA（在本例中为miR-9或miR-9*）的人工前体miRNA（pre-miR）和抗miRNA（对每个成熟miRNA都是反义的）来确定是否存在miR-9、miR-9*REST和/或CoREST的优先活性。15 n的共转染米含有REST 3′UTR的荧光素酶报告子的前miR-9显著降低了报告基因的表达(F类(2,9)= 35.524,对<0.0001）与前miR-9*或阴性对照前miR相比(图2A类). [使用包含完美miRNA靶位点的报告构建物证实了前miR的特异性（补充图S4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)]. 此外，抗-miR-9，但不是抗-miR-9*挽救了对雷尼利亚与REST 3′UTR报告质粒共转染mU6 miR-9/9*后的荧光素酶活性(F类(2,6)= 19.539,对=0.0024）（补充图S5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 为了将报告研究扩展到内源性REST，我们用前miR-9转染HEK 293细胞。这导致内源性REST蛋白表达显著下降(F类(2,9)= 7.552,对=0.0119）与前miR-9*或前miR阴性对照相比(图2B类,C类). 总之，这些结果表明，与miR-9*预测MRE相比，在REST的3′UTR中miR-9预测MRE具有功能性。

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miR-9针对REST的3′UTR。A类，用含有3′UTR的荧光素酶报告子共转染HEK 293细胞休息在浓度增加的情况下（0.1、1.0、5.0或15.0 n米)人工前miR-9减少相对荧光素酶活性(n个= 4).B类,C类，转染带有前miR-9（30 n）的HEK 293细胞后REST的敲除米). 代表性的西方污点(B类)和密度测定(n个=4）独立实验(C类)归一化为β-actin后。数据为平均值±SEM*对< 0.05, **对< 0.01.D类，一个代表性的蛋白质印迹显示，设计用于阻断REST的预测miR-9结合位点（TSP+）的靶位点保护剂（TSP）挽救了mU6-miR-9/9*介导的REST敲除。HEK 293细胞与mU6-miR-9/9*和TSP+或TSP阴性对照（Neg）共转染，24小时后在细胞裂解物中测量REST水平。密度测定法n个=4个独立实验表明，与TSP阴性（0.54±0.212）处理细胞相比，TSP+（0.97±0.065）处理细胞的REST增加。

接下来，我们设计了一种LNA修饰的寡核苷酸作为TSP，与REST 3′UTR中预测的miR-9结合位点具有序列互补性（补充图S6，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). TSP包含MRE反义序列和侧翼序列，用于阻断3′UTR内的特异性miRNA-靶点相互作用。这些与抗miR不同，抗miR损害所有miRNA-靶相互作用。用REST 3′UTR报告质粒、mU6-miR-9/9*质粒和TSP+（靶向REST中的末端MRE）共转染HEK 293细胞（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)与mU6 miR-9/9*处理的细胞相比，mRNA介导的沉默具有保护作用(F类(2,9)= 38.395,对<0.0001）（补充图S6，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 与这些观察结果一致，HEK 293细胞中的REST水平在mU6 miR-9/9*转染后降低(图1D类,E类)被TSP+（学生的t吨测试，对<0.05），但不是对照TSP（TSP阴性）(图2D类).

miR-9*靶向CoREST

我们使用类似的方法来确定miR-9、miR-9*或两者在调节CoREST中是否起作用。CoREST 3′UTR报告质粒与5或15n的共转染米与对照组相比，前miR-9*表达减少(F类(2,11)= 41.612,对=0.0001和F类(2,11)= 7.423,对分别=0.0091），与miR-9不同(图3A类). 此外，只有前miR-9*显著降低HEK 293细胞内源性CoREST表达(F类(2,9)= 11.173,对= 0.0036) (图3B类,C类). 此外，用mU6 miR-9/9*转染HEK 293细胞后CoREST表达降低(图1D类,E类)在抗miR-9*共转染后缓解（补充图S7，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).

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miR-9*针对CoREST的3′UTR。A类在浓度增加（0.1、1.0、5.0或15.0 n）的情况下，用含有CoREST 3′UTR的荧光素酶报告子共同转染HEK 293细胞米)人工前miR-9*降低相对荧光素酶活性(n个= 5).B类,C类，转染带有前miR-9*（30 n）的HEK 293细胞后，CoREST水平降低米). 代表性的西方污点(B类)和密度计(n个= 4) (C类)归一化β-actin水平后。数据为平均值±SEM*对< 0.05, **对< 0.01.D类，TSP设计了CoREST（TSP+）预测的miR-9*结合位点，以挽救miR-9+介导的前敲除(B类). HEK 293细胞与前miR-9*共转染（15 n米)以及24小时后通过蛋白质印迹在细胞裂解物中测量的TSP+或TSP-Neg和CoREST水平。密度测定法n个=4个独立实验表明，与TSP阴性（0.565±0.08）处理细胞相比，TSP+（1.02±0.05）处理细胞中的CoREST增加。

接下来，我们针对CoREST中保守的预测miR-9*结合位点使用TSP来测试其功能（补充图S8，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 与mU6 miR-9/9*处理的细胞相比，在TSP+存在下共同转染mU6 miR-9/9*-可显著挽救报告基因表达(F类(2,6)= 32.882,对=0.0006）（补充图S8，可从网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 内源性CoREST蛋白表达在miR-9*转染前降低，在TSP+（Student’st吨测试，对<0.05），但不是TSP阴性(图3D类). 这些数据为miR-9*MRE调节CoREST提供了支持。

最后，我们测试了减少REST表达如何影响HEK 293和NT2细胞内源性miR-9水平。在这两种细胞系中，REST表达的短期减少导致miR-9表达增强(对<0.05）和通过测量成熟miR水平确定的加工（补充图S9，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 这些发现为之前的研究提供了支持，这些研究显示miR-9-1和miR-9-3的REST占用率(Conaco等人，2006年)并为REST复合物成分和REST调节miRNAs之间的负反馈研究提供功能证据。

讨论

转录抑制因子REST在HD患者的大脑中定位错误，与健康对照组相比，RE1位点的核定位和占有率增加(Zuccato等人，2003年,2007). REST与CoREST和其他转录阻遏物相互作用，通过直接控制mRNA和最近显示的miRNA转录物来调节神经元基因表达和谱系承诺(Vo等人，2005年;Conaco等人，2006年;Mortazavi等人，2006年;Visvanathan等人，2007年). 事实上，最近已将规范和非规范REST结合基序映射到人类基因组中22个miRNA位点的附近，包括其中几个位于富含神经元的miRNA附近(Bruce等人，2004年;Jothi等人，2008年).

在这项研究中，我们发现与健康对照组相比，从HD大脑中获取的RNA中有几个miRNAs被严重错误调节。其中，双功能miR-9/miR-9*靶向REST阻遏复合物的两个成分：miR-9靶向REST*，miR-9*靶向CoREST。MiR-132已被证明针对MeCP2(Klein等人，2007年)，可以与REST和CoREST相互作用以抑制转录(Lunyak等人，2002年). 双负反馈网络在其他系统中也有报道，其中多因素的临界平衡至关重要(Tsang等人，2007年).

最近对富含大脑的miR-9的研究揭示了其在发育和谱系承诺中的重要性(Sempere等人，2004年;Krichevsky等人，2006年). 在斑马鱼中，miR-9对中脑-后脑边界的定义很重要(Leucht等人，2008年). 在小鼠皮层发育中，miR-9似乎对Cajal-Retzius细胞的适当分化是必要的(Shibata等人，2008年). 除了miR-9/miR-9*外，HD皮质中成熟的miR-124a也显著减少。miR-124部分通过靶向剪接因子促进神经元分化(Makeyev等人，2007年). 此外，miR-124在非神经元细胞中的过表达可将基因表达谱诱导为神经元表型(Lim等人，2005年). 有趣的是，在HD患者大脑皮层（BA4）表达变化的基因中，与神经发生相关的基因比例过高(Hodges等人，2006年). 这可能反映了异常REST定位介导的脱分化，因为在HD中REST mRNA水平没有显著变化(Hodges等人，2006年)，以及miR-9/9*和miR-124a靶向水平的全球变化。HD皮层中miR-9/9*、miR-124a和其他miRNAs水平的降低是否是脱分化的结果或促成因素，目前正在研究中。

总之，我们发现在HD脑中，一些REST调节的miRNAs随着疾病进展而减少。我们证明，其中miR-9和miR-9*分别针对REST和CoREST。我们的发现以及最近的研究表明，REST可以通过泛素介导的蛋白水解进行调节(Westbrook等人，2008年)强调维持适当水平和细胞内定位的重要性(Zuccato等人，2003年)该阻遏物复合体用于适当的基因转录和谱系承诺。

脚注

这项工作得到了遗传病基金会和美国国立卫生研究院HD 44093和NS 050210的支持。A.N.P.设计并执行了实验，并撰写了这份手稿；Y.X.进行了实验并编辑了这份手稿；S.Q.H.提供了构建物并启动了REST调节的miRNA研究；L.J.提供了样本并编辑了这份手稿；B.L.D.发起了研究，设计了研究，并撰写了这份手稿。我们感谢G.Liu、S.Fineberg和B.Gilmore的技术专长，感谢Kathryn Chaloner博士（生物统计学教授兼总系）在统计分析方面的帮助。

作者声明没有竞争性的经济利益。

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