人细胞NAD生物合成的途径和亚细胞间隔

细胞培养

细胞在Ham’s F-12培养基中培养用于培养HeLa S3和Dulbecco’s改良Eagle’s培养基（DMEM）用于培养293和HepG2细胞。媒体补充了10%（v/v）FCS，2 m米 我-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。将稳定转染的293mitoPARP细胞保存在添加100μg/ml G418的293培养基中。使用效应基因试剂（Qiagen）对真核细胞进行瞬时转染。

真核表达载体的克隆与制备

为了表达标记蛋白，将其相应的开放阅读框插入pFLAG-CMV-5a（Sigma）、pcDNA3.1（+）-PARP1cd中(33)，或pCMV/myc公司/丝裂原（Invitrogen）。所有克隆的DNA序列均经DNA序列分析验证。

药物治疗

抑制剂（2μ米FK866，2米米3-AB，10μ米NBTI，2μ米双嘧达莫，2 m米CMP，25μ米磷酸吡哆醇-6-唑苯基-2′，4′-二磺酸和1 m米Ap4A）或代谢物（100μ米北美⁺, 100 μ米NAAD，100μ米NMN，100μ米NAMN，100μ米NA和100μ米如图所示，将NR）添加到细胞培养基中。NR的生成如前所述(34). 在分析PAR形成和细胞活力之前，用抑制剂和代谢物处理24–48小时（293mitoPARP细胞72小时，HeLa S3细胞96小时，HepG2细胞120小时）。使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物测定法测定细胞活力。

用PARAPLAY鉴定线粒体基质蛋白

这个第页奥利(一DP公司-第页ibose）-一助理第页蛋白质我局域化一ssa公司年（PARAPLAY）建立管腔蛋白定位(33). 这里，PARAPLAY被用于鉴定线粒体基质蛋白。分析蛋白（NMNAT3、NamPRT和NAPRT）在HeLa S3细胞中以N末端融合到PARP1cd表达。因为[NAD低⁺]和/或细胞溶质和线粒体膜间隙中PAR的高降解活性，如果融合蛋白位于这些腔室中，则未检测到PAR。相反，基质定位很容易通过PAR积累建立。即使大多数融合蛋白存在于胞浆中，蛋白的可能管腔部分也会产生足够的免疫可检测PAR。如果没有检测到PAR，则通过测试融合蛋白PARP1cd部分的功能来验证蛋白在基质外的定位。这是通过向融合蛋白添加一个N末端线粒体靶向序列来实现的，该序列将引导其进入基质并导致PAR积累。

蛋白质测定、SDS-PAGE和蛋白质印迹

使用BCA试剂（Pierce）测定蛋白质浓度。在裂解缓冲液（50 m米Tris/HCl，pH 6.8，2%（w/v）SDS，10%（v/v）甘油）或直接在SDS样品缓冲液中（50 m米Tris/HCl，pH 6.8，2%（w/v）SDS，10%（v/v）甘油，100 m米β-巯基乙醇和0.01%（w/v）溴酚蓝）。按照标准程序进行凝胶电泳和免疫印迹。ECL用于免疫检测。通过β-微管蛋白或AIF免疫检测证实蛋白质负载量相等。

免疫细胞化学

用PBS中4%（v/v）甲醛固定细胞，并用PBS中0.5%（v/v）Triton X-100透化。用DAPI染色细胞核，用MitoTracker Red CMXRos（Invitrogen）染色线粒体。使用配备×10、×40和×100物镜的徕卡DMI6000B外荧光显微镜（徕卡微系统）拍摄图像。

检测NAD的变化⁺线粒体内PARP活性含量

293mitoPARP细胞表达一种融合蛋白（“mitoPARP”），该融合蛋白由增强的GFP和靶向线粒体基质的PARP1cd组成⁺作为底物，这些细胞组成性地生成蛋白结合的PAR，这是免疫化学显示的。因此，检测到的PAR范围的变化反映了线粒体NAD的变化⁺内容。同样，在HepG2和HeLa S3细胞中瞬时表达丝裂原活化蛋白。

酶活性测量

使用抗FLAG M2亲和凝胶基质（Sigma），在293细胞中表达并从全细胞提取物中免疫沉淀后，测量FLAG标记的NADS的活性。NAAD对NAD的酰胺化⁺通过酶在50米内进行过夜米Tris/HCl，pH 8.0，60 m米氯化钾，2米米ATP，8米米氯化镁₂，20米米 我-谷氨酰胺和2 m米NAAD公司。生成的NAD⁺然后通过与1%乙醇和2单位乙醇脱氢酶孵育30分钟，将其转化为NADH。通过超滤（3 kDa）去除蛋白质，并通过HPLC分析样品。

为了测试NADS形成NMN，在NAMN而非NAAD存在下进行酰胺化反应。然后通过超滤（3 kDa）去除NADS。由于NMN和NAMN在随后的分析中没有充分分离，单核苷酸被腺苷酸化（生成NAD⁺或NAAD），添加1.5μg纯化NMNAT1并孵育1 h。然后通过HPLC分析核苷酸。

在293mitoPARP细胞提取物中或使用细菌表达和纯化的His检测PARP蛋白的自修饰₆-标记的PARP1cd（氨基酸652–1014，由德国汉堡F.Koch-Nolte博士善意提供）。将细胞提取物（1μg/μl总蛋白）或纯化的PARP1cd（40 ng/μl）在30°C的PBS中培养1 h，PBS补充10 m米氯化镁₂和NAD⁺或NAAD作为底物。然后通过Western blotting对样品进行分析。

细胞外NAD的鉴定⁺支持线粒体NAD的代谢物⁺生成

然后我们研究了哪些细胞外NAD⁺前体支持线粒体NAD⁺生成。显然，Nam起到了这一作用，因为它通常是唯一的NAD⁺细胞培养基中的前体。虽然色氨酸也存在于培养基中，但可以转化为NAD⁺，不足以维持细胞NAD⁺级别(囊性纤维变性。 补充图S1一). 将培养基中色氨酸的浓度提高到500μ米在FK866存在的情况下也不能提高细胞活力(补充图S1一).

因此，当NamPRT被抑制时，NAD需要存在替代前体⁺生成。向培养基中添加NA、NAMN或NMN可恢复线粒体NAD⁺含量和细胞存活(图2,一和B类). 细胞活力与线粒体NAD相关⁺水平，通过PAR形成测量。未转染的HeLa S3细胞对FK866表现出类似的敏感性，并通过NA、NAMN和NMN恢复存活(图2C类). 相反，在HepG2细胞中，NA不支持NAD的生成⁺和细胞存活(图2,D类和E类)证实该细胞系中缺乏NA磷酸核糖转移酶（NAPRT）活性(37). NAD之后⁺FK866处理293mitoPARP细胞，线粒体NAD⁺NA可以以时间依赖的方式补充水池(补充图S1B类).

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图2。

细胞外NAD⁺支持线粒体NAD的衍生物⁺生成和细胞存活。如图所示，添加FK866抑制了Nam的利用。色氨酸作为NAD不足⁺维持细胞活力的前体(补充图S1一). NA支持线粒体NAD⁺293mitoPARP细胞的合成(补充图S1B类). “NAD前体”指添加到培养基中的代谢物。一，NAMN和NMN都支持线粒体NAD⁺形成。NAMN和NMN保护293mitoPARP细胞(B类)和HeLa S3细胞(C类)NamPRT抑制（FK866）诱导的细胞死亡。D类和E类，单核苷酸前体，但不支持NA，支持线粒体NAD的生成⁺HepG2细胞的活性。酒吧，10微米。北美⁺和NAAD支持线粒体NAD⁺(F类)形成和细胞活力(G公司)293mitoPARP细胞。

我们还测试了NAD⁺和NAAD作为细胞内NAD的潜在前体⁺两种二核苷酸都足以保护线粒体NAD⁺和细胞活力(图2,F类和G公司). 因此，除了Nam和NA外，当添加到细胞中时，它们相应的吡啶单核苷酸和二核苷酸支持线粒体PAR的形成。尽管已经提出了一些细胞摄取吡啶核苷酸的建议(38)，通常认为质膜不可渗透磷酸化分子。因此，我们测试了细胞内NAD的维持⁺通过外源核苷酸，它们需要在细胞外降解为中间产物，然后才能进入细胞。

细胞外核苷酸被降解成相应的核苷，然后作为NAD进入细胞⁺前体

研究表明，在质膜外表面存在核苷酸焦磷酸酶，也称为磷酸二酯酶(39). 这种活性裂解NAD⁺至NMN和AMP(40). 核苷酸焦磷酸酶抑制剂磷酸吡哆醇-6-唑苯基-2′，4′-二磺酸(41)阻止线粒体NAD的恢复⁺NAD时的池和细胞存活⁺被用作细胞外前体(图3一). 同样，添加Ap4A作为竞争性核苷酸焦磷酸酶底物(42)对293mitoPARP和HeLa S3细胞的细胞活力产生了类似的影响(补充图S2一). 因此，作为前体，细胞外NAD⁺需要降级为NMN。

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图3。

细胞外核苷酸前体被降解，只有合成的核苷进入细胞。如图所示，FK866添加抑制了293mitoPARP细胞对Nam的利用。按照“实验程序”中的描述，使用指定的抑制剂进行治疗。对线粒体NAD的影响⁺显示了含量（通过PAR形成检测）和细胞活力。一NAD的细胞外降解⁺被磷酸吡哆醇-6-唑苯基-2′，4′-二磺酸抑制(PPADS公司)，需要支持线粒体NAD⁺生成和细胞活力。B类，NMN必须去磷酸化为NR以支持线粒体NAD⁺合成。5′-核苷酸酶（CMP）或核苷转运蛋白（双嘧达莫）抑制剂(DIP公司)，NBTI），如图所示。C类，NAMN的利用需要去磷酸化至NAR。培养基中增加NAMN浓度用于克服NAD的抑制作用⁺通过DIP或CMP合成。D类，将NMN或NAMN用作NAD时⁺前体，细胞活力取决于单核苷酸的细胞外降解。培养基中增加NMN或NAMN的浓度用于克服NAD的抑制作用⁺通过DIP或CMP合成。使用NAMN作为细胞外前体的抑制作用较弱可能是由于NA的存在（见正文）。E类，细胞外NR通过核苷转运蛋白进入细胞并支持线粒体NAD⁺合成和细胞活力。核苷载体抑制剂（NBTI，DIP），而非CMP，可显著降低线粒体NAD⁺NR用作细胞外前体时的生成。F类，细胞外NAD⁺降解为NR，作为细胞内NAD的前体⁺CMP和核苷载体的抑制都能显著降低线粒体NAD的生成⁺当NAD⁺作为细胞外前体加入。G公司，结果的示意图。Ap4A的作用在补充图S2一.

然后我们研究了NMN作为细胞外NAD的命运⁺前辈。添加CMP，CMP与NMN竞争作为底物，通过外部5′-核苷酸酶进行脱磷酸化(39)，显著降低293mitoPARP细胞的细胞活力(图3B类)和HeLa S3细胞(补充图S2B类). 如所示图3B类，这与线粒体NAD减少有关⁺含量和剂量依赖性(补充图S2D类). NMN失去其作为细胞外NAD的能力⁺前体也存在双嘧达莫和NBTI，它们是质膜核苷转运蛋白的抑制剂(43). 293mitoPARP细胞中细胞活力的降低与免疫检测PAR的降低再次平行(图3B类)和HeLa S3细胞(补充图S2B类). CMP或核苷转运抑制剂单独对可检测PAR的数量或细胞活力没有任何影响(补充图S2C类)，当Nam可用作NAD时⁺前辈。

线粒体NAD⁺添加NAMN产生的产物对这些抑制剂也很敏感(图3,C类和D类)尽管强度不如NMN作为前体。增加NAMN的浓度可以克服抑制作用。使用NAMN（和NAAD，见下文）降低抑制剂敏感性的一个可能解释是，可能降解为NA，即NAD⁺绕过NamPRT（FK866）和核苷转运体（DIP）抑制的前体。同样，Nam是NMN和NAD的降解产物⁺，但FK866的存在阻碍了其利用。因此，在CMP存在下，NR支持线粒体PAR的形成和细胞活力，而双嘧达莫和NBTI均抑制NR的利用(图3E类). 因此，抑制核苷摄取或NMN去磷酸化也应影响NAD的使用⁺作为细胞外前体。的确，如所示图3F类，北美⁺在NBTI、双嘧达莫或CMP存在的情况下，维持线粒体PAR形成和细胞活力的效率要低得多。对HeLaS3细胞的类似处理对细胞活力具有相同的影响(补充图S2E类). 当使用NAAD作为细胞外NAD时⁺前兆，发现了类似的趋势(补充图S2F类). 然而，NA的存在（见上文）可能提供了NAD合成的另一个来源，从而导致不太明显的效果。总之，这些结果证明，除了NA和Nam外，只有核糖体前体NR和NAR作为细胞内NAD的细胞外前体⁺而单核苷酸（NMN和NAMN）和二核苷酸（NAD⁺和NAAD）需要处理成相应的核苷(图3G公司). 这种解释假定细胞外NAD的进入⁺进入细胞的前体实际上可以使用线粒体内的探针mitoPART进行监测。如下所示，NAD的所有已知中间体⁺代谢，包括NAD⁺自身可以转化为线粒体NAD的前体⁺在细胞溶质中。因此，所有细胞外NAD⁺前体确实有助于线粒体NAD⁺合成。

所有NAD⁺生物合成酶定位于细胞质或细胞核，线粒体NMNAT异构体除外

了解NAD的细胞内途径⁺生物合成，我们接下来对人体酶的亚细胞分布进行了全面分析。当在HeLa S3细胞中用C末端FLAG表位表达时(图4一)，除NMNAT3外，所有酶均定位于细胞质或细胞核。如预期，NMNAT3与Mitotracker共定位(23). 此处未显示的另外两种NMNAT亚型是已知的核亚型(23)或高尔基体的细胞溶质表面(23,44).

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图4。

NAD的亚细胞定位⁺生物合成酶。 一，所有已知NAD⁺生物合成酶定位于细胞质或细胞核，线粒体NMNAT3除外。用编码所示酶的载体瞬时转染HeLa S3细胞（C-末端标记FLAG）。荧光显微照片显示细胞核（DAPI）、表达的重组蛋白（FLAG）和线粒体(机器翻译).酒吧，20微米。NAPRT潜在变异体的线粒体定位被排除(补充图S3一).B类和C类NMNAT3是一种线粒体基质蛋白，但不是NamPRT或NAPRT。使用PARAPLAY在HeLa S3细胞中过度表达后进行线粒体下蛋白定位(33).B类，分析蛋白（NMNAT3、NamPRT和NAPRT）过度表达，并赋予C末端PARP1cd和Myc标记（参见顶部). 如果融合蛋白存在于基质中，PAR积累并通过免疫细胞化学检测（如NMNAT3所示）。定位于膜间间隙或胞浆的融合蛋白不支持PAR积累(33).酒吧，20微米。C类，为了验证PARAPLAY测定法对阴性结果（NamPRT和NAPRT）的功能，相应的构建体还被赋予了已建立的N-末端线粒体靶向序列（MTS，见顶部). 这些构建体的过表达导致线粒体PAR积累，这表明NamPRT-或NAPRT-PARPcd融合构建体具有催化活性。然而，真正的蛋白质（未添加MTS）不会定位于线粒体基质，因此未观察到PAR积累(B类).

NamPRT和NAPRT都为NMNAT生成基板(图1一). 如果它们存在于基质中，它们可能会促进线粒体NAD⁺合成提供的NMNAT3是一种基质蛋白。为了解决这个问题，我们应用了PARAPLAY，一种专门用于解决亚器官蛋白定位的新方法(33). 该方法包括与PARP1cd融合的分析蛋白的过度表达。对于线粒体蛋白，只有当融合蛋白存在于基质中时，才能观察到PAR的积累。我们在与PARP1cd融合的情况下表达NMNAT3、NamPRT和NAPRT。这些结构的本地化(图4B类)与相应的FLAG标记蛋白相似(图4一). NMNAT3-PARP1cd蛋白支持PAR在线粒体中的积累，证明NMNAT3确实是一种基质蛋白(45). NamPRT-和NAPRT-PARP1cd融合蛋白均未导致任何可检测的聚合物形成，从而证明这些不是人类细胞中的线粒体基质蛋白(图4B类). 为了排除PARP1cd的催化活性在与NamPRT或NAPRT融合后受损，我们在融合构建物的N末端添加了一个已建立的线粒体靶向序列，以迫使其进入基质。由此产生的蛋白质现在定位于线粒体并生成PAR(图4C类). 我们还排除了截短的NAPRT（可能起源于替代翻译起始点）导致线粒体亚型的可能性(补充图S3一).

因此，我们确定NMNAT3是NAD的唯一酶⁺存在于人类细胞线粒体中的合成。人类NAD的所有其他酶活性⁺生物合成存在于细胞核和/或细胞质中。因此，核/细胞溶质NAD⁺可由所有已鉴定的细胞外前体、Nam和NA及其相应的核糖体合成。

NMN是线粒体NAD的细胞前体⁺合成

基质中仅存在NMNAT3强烈表明NMN是线粒体NAD的细胞溶质前体⁺线粒体中NADS的缺失排除了细胞器内酰胺化NA前体的可能性(图4一). 此外，NRK亚型在线粒体外的定位(图4一)表明NR的磷酸化不发生在细胞器内。尽管如此，线粒体基质亚型胸苷激酶2（TK2）的一种可能的副作用可能会介导NR的磷酸化(图5D类)，因为NRK与嘧啶核苷激酶同源(17). 但是，如所示图5一当NMN是唯一的细胞外NAD时，TK2的过度表达对线粒体PAR水平没有明显影响⁺前体（转化为NR后导入细胞，参见图3). 证实了过度表达的TK2蛋白的线粒体定位(补充图S3B类). 因此，NR进入细胞后，必须在胞浆中转化为NMN。事实上，NRK1（即细胞质，参见图4一)显著增加线粒体PAR的数量(图5一)但仅当细胞外前体（如NMN）可提供NR时(图5B类). 因此，NR是线粒体NAD的有效前体⁺，如果在胞浆中磷酸化为NMN(图5D类). 因此，NMN已被证实是线粒体NAD的细胞溶质前体⁺NRK1的过表达显著改善了细胞外NAD的使用⁺或NMN或NR本身用于线粒体PAR的形成(图5C类). 这些观察强烈地强化了细胞外NMN和NAD的概念⁺不被吸收到细胞中，而是必须首先降解为NR。

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图5。

NMN是线粒体NAD的细胞溶质前体⁺293mitoPARP细胞合成。 一，细胞质NRK1的过度表达，而不是线粒体基质TK2的过度表达增加线粒体NAD⁺内容。用编码FLAG标记的人NRK1或TK2的载体瞬时转染293mitoPART细胞。证实了TK2的线粒体定位(补充图S3B类).B类和C类线粒体NAD增加⁺过表达NRK1的水平取决于细胞外NR的来源（NAD和NMN在细胞外降解为NR，图3).D类，细胞溶质NMN是线粒体NAD的前体⁺胞浆中NRK活性增加可增强线粒体NAD⁺NR、NMN或NAD时的内容⁺作为细胞外NAD提供⁺前体。排除了线粒体胸苷激酶2（TK2）活性将NR转化为NMN的可能性(虚线).