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生物化学杂志。2011年6月10日；286(23): 20500–20511.
2011年4月21日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M10.162404
预防性维修识别码：下午3121473
PMID：21511949

神经元中谷氨酰胺转运蛋白SLC38A7（SNAT7）的鉴定*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

玛丽亚·G·A·哈格隆德,‡ Smitha Sreedharan公司,‡ 维克多·C·O·尼尔森,‡ 贾法尔·沙伊克,‡ 英格丽德·阿尔姆克维斯特,‡ 索菲·巴克林,‡ 厄尔詹·朗格,§和罗伯特·弗雷德里克森‡,1,2
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补充材料

摘要

SLC38转运蛋白家族在人类中总共有11个成员，它们编码被称为钠偶联氨基酸转运蛋白（SNAT）的氨基酸转运蛋白。迄今为止，已对五种SNAT进行了表征，并在功能上细分为系统A（SLC38A1、SLC38A2和SLC38A4）和系统N（SLC38 A3和SLC38 A5），显示谷氨酰胺和丙氨酸的最高转运。在这里，我们鉴定了一种新的谷氨酰胺转运体，该转运体由Slc38a7系列我们建议将其命名为SNAT7。这个运输机我-谷氨酰胺作为首选底物，但也可通过极性侧链运输其他氨基酸，以及我-组氨酸和我-丙氨酸。SLC38A7的表达模式和底物分布与已知系统N转运蛋白的相似性最高。因此，我们建议SLC38A7是该系统的一个新成员。我们使用就地用定制抗体进行杂交和免疫组化，显示SLC38A7在小鼠脑中的所有神经元中表达，但在星形胶质细胞中不表达。SLC38A7是第一个在GABA能神经元和其他神经元中表达的系统N转运蛋白。SLC38A7在突触间隙附近的选择性底物和轴突定位表明，SLC38A对谷氨酸的再摄取和再循环具有重要作用。

关键词：氨基酸转运、谷氨酸、谷氨酰胺、神经生物学、爪蟾、SLC38、SNAT、SNAT7、系统A、系统N

介绍

溶质载体（SLCs），三是人类基因组中最大的转运蛋白(1,2). 许多SLC是耦合转运蛋白，在细胞过程中具有重要功能，包括作为氨基酸和神经递质循环的转运蛋白，而其他SLC是被动转运蛋白或交换蛋白(2–4). 有人建议，人类基因组中有近100个氨基酸的SLC转运体，其中大约60个已被确定为底物，其余被假定为可能的氨基酸转运体(5). 这一大量数据表明，在细胞膜以及线粒体膜和囊泡膜上调节氨基酸的膜转运具有重要意义。SLC被分为至少46个不同的家族，具有不同的生化特性(5)最近又发现了两个家庭(6). 在哺乳动物中，SLC的系统发育分类表明，SLC蛋白质形成四个主要的系统发育类群，称为α、β、γ和δ，每个类群中的蛋白质都有共同的进化起源。β-群包括SLC32、SLC36和SLC38家族，是第二大氨基酸转运蛋白系统发育簇。已知β组的一些成员在大脑中表达，大多数位于质膜中，而SLC32A1存在于神经元囊泡中。然而，其他人仍然是孤儿，对他们的组织分布、功能特征或底物特异性知之甚少(5,7).

SLC38系列由11个成员组成。苦海孤雏SLC38A7–11型是最近才发现的，到目前为止还没有关于其运输基质的特征(7)，而其他成员，SLC38A1–6型，在功能上被归类为钠偶联中性氨基酸转运蛋白，也称为钠偶联氨基酸转运蛋白（SNAT）。SNAT1(SLC38A1型(8–9))、SNAT2(SLC38A2型(10–13))和SNAT4(SLC38A4型(14,15))被进一步分类为系统A，而SNAT3(SLC38A3型)和SNAT5(SLC38A5型)属于N系统运输机(16–18). 系统N/A分类取决于底物识别的功能特性和模式。SNAT6(SLC38A6型) (19)其他最近发现的家族成员尚未根据N/A系统进行分类。所有SNAT基因，SNAT4除外(14)，在大脑中表达，具有SNAT1(8,20)和SNAT2(21)在星形胶质细胞和神经元中表达，而SNAT3(16)和SNAT5(22)位于神经胶质细胞中。SLC38家族孤儿的蛋白质或底物分布没有确切的细胞定位报告。我-谷氨酰胺是SLC38家族中大多数成员最喜欢的底物，并且建议转运蛋白是中枢神经系统中谷氨酰胺-谷氨酸循环的一部分(16,18,23,24).

非必需氨基酸谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质。谷氨酸-谷氨酸循环涉及神经元和胶质细胞中突触递质谷氨酸的合成、释放和再循环，以维持谷氨酸神经递质库，另一个关键功能是规避谷氨酸的神经毒性特性(25–27). 许多已知和未知的谷氨酸和谷氨酰胺转运体都参与了这一代谢循环。然而，SLC38蛋白在谷氨酰胺-谷氨酸循环中的确切作用尚不清楚。最近的几行证据表明，主要在神经末梢缺乏表达，表明已知的SNAT均不参与神经元的谷氨酸-谷氨酰胺循环(28,29).

在本研究中，我们报道了SLC38A7转运蛋白的功能特征，该转运蛋白是SLC38家族中以前的孤儿成员之一，我们建议将其命名为SNAT7。发现SLC38A7在大脑和脊髓中GABA能神经元和其他神经元的大多数神经元中表达。功能特征，通过过度表达非洲爪蟾卵母细胞，表明SLC38A7最好介导我-谷氨酰胺和我-组氨酸等底物。基于底物分布、其钠依赖性转运和组织表达模式，我们发现SLC38A7具有类似于已知系统N转运蛋白的分布。我们还表明，SLC38A7在神经元的轴突上表达，这与底物分布一起表明，SLC38A7可能在通过谷氨酸-谷氨酸循环维持大脑中的谷氨酸神经递质库中发挥作用。

实验程序

组织采集和切片

C57Bl6/J成年雄性小鼠的动物护理程序得到乌普萨拉当地伦理委员会的批准，并遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）的指南。成年雄性C57Bl6/J小鼠（丹麦Taconic M&B）经腹腔注射Dormitor（盐酸美托咪定，70μg/g体重，芬兰Orion Pharma）和Ketalar（盐酸氯胺酮，7μg/g重量，辉瑞）的1:1混合物。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）通过左心室进行经心灌注，然后用4%甲醛进行灌注（瑞典组织实验室）。大脑被切除并保存在4%甲醛中过夜。对于自由漂浮组织切片，大脑在PBS中清洗，嵌入4%琼脂糖中，并在徕卡VT1000S震动器上切片（70μm）（徕卡微系统公司，德国）。然后通过一系列甲醇洗涤对切片进行脱水，并将其储存在−20°C的100%甲醇中，直至进一步处理。对于石蜡包埋组织切片，在脱水和石蜡灌注之前，将大脑在40°C的锌福尔马林（Richard-Allan Scientific）中固定18–24小时（tissue-Tek真空渗透处理器；Miles Scientistic）。使用Microm 355S STS冷切切片机切割切片（7μm），将切片附在Superfrost Plus载玻片上（德国Menzel-Gläser），在37°C下干燥过夜，并在4°C下保存直至使用。

RNA探针的设计与合成

反义探针由小鼠合成Slc38a7系列EST克隆ID 4009949（Invitrogen）。这个Slc38a7系列使用标准程序将该基因克隆到pcDNA3.1/FLAG载体中。利用铂Pfx校对DNA聚合酶（Invitrogen）的正向（5′-GATCGAATTCGGAGCCCAGCATCAA-3′）和反向（5′-GATCTCGAGTCAGGCACAAAA-3′）引物对编码序列进行简单扩增，用EcoRI和XhoI（Fermentas，Canada）消化，克隆到pcDNA3.1/FLAG载体(30)使用T4连接酶（Invitrogen）。这使得构造pcDNA3.1/FLAG/Slc38a7系列用JETstar 2.0质粒纯化Midi试剂盒/50（Genomed，Germany）制备质粒cDNA，使用NanoDrop ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies）测量浓度，并对克隆进行测序（Eurofins MWG Operon，Germany）并验证其正确性。质粒用SmaI（加拿大弗尔门塔斯）切割，探针用1μg裂解载体作为模板，在地高辛-11-UTP（Roche Diagnostics）存在下用SP6 RNA聚合酶合成。地高辛标记小鼠第38页第7页然后，在Experion自动电泳系统（Bio-Rad）上使用Experion RNA StdSens分析试剂盒对（742 bp）探针进行量化和完整性控制，并将其储存在−80°C下。

自由浮动段的原位杂交

非放射性就地通过将100%甲醇逐步复水至0.1%PBT（PBS与0.1%吐温20（Sigma））并用6%H漂白，在自由漂浮的小鼠脑切片上进行杂交2O（运行）2PBT中。用0.5%Triton X-100（Sigma）渗透切片，在20μg/ml蛋白酶K（Invitrogen）中消化，并在所有步骤之间用PBT洗涤液在4%甲醛（瑞典HistoLab）中固定。然后在55°C的杂交缓冲液（50%甲酰胺、5×SSC、pH 4.5、1%十二烷基硫酸钠、50μg/ml tRNA（Sigma）、50μg/ml肝素（Sigmi）和0.1%焦碳酸二乙酯处理过的水）中对切片进行预杂交。地高辛标记Slc38a7系列在杂交缓冲液中稀释的探针（1μg/ml）在80°C下热变性，在冰上冷却，并添加到切片中，在55°C下杂交过夜。在第一缓冲液（50%甲酰胺、2×SSC、pH 4.5、0.1%吐温20和0.1%焦碳酸二乙酯处理过的水）和第二缓冲液（50%甲酰胺、0.2×SSC，pH 4.5、0.1%吐温20以及0.1%焦碳酸盐二乙酯处理水）中，在55°C下反复清洗切片。TBST（Tris缓冲盐水中0.1%吐温20）用于额外清洗，然后在封闭溶液（TBST中1%封闭试剂（罗氏诊断））中培养2小时，然后在4°C封闭溶液中稀释1:5000过夜的抗地高辛抗体结合碱性磷酸酶（罗氏诊断）中培养。在TBST中用2 m重复清洗截面米左旋咪唑（赛默飞世尔科技公司），然后用2 m在NTMT中浸泡10分钟米左旋咪唑（100米米氯化钠，10米米三氯化氢，pH 9.5，50 m米氯化镁2和0.1%吐温20），然后在37°C下使用BM-Purple AP酶底物（罗氏诊断）进行显色。在使用防褪色剂（甘油和Tris中的二氮杂二环（2.2.2）辛烷）安装在DTG介质中后，使用连接到徕卡DFC300 FX相机（德国徕卡微系统公司）的徕卡MZ16F显微镜和徕卡FireCam软件对切片进行拍照。

石蜡切片的荧光免疫组织化学

切片在X-tra Solv（德国Medite Histotechnik）脱蜡，并通过一系列乙醇溶液（100、95、75、50和25%）在H中溶解进行再水化2O、 然后进行PBS清洗。通过将切片加热至100°C进行抗原提取米柠檬酸，pH 6.0，（Sigma）10分钟。然后将切片在PBS中清洗，置于加湿室中，并与一级抗体兔抗SLC38A7（1:200，Innovagen定制的多克隆抗体）、小鼠抗NeuN（1:400，瑞典Millipore）、鸡抗GFAP（1:400、英国Abcam）、鼠抗MAP2（1:500，Sigma，和小鼠抗突触素（1:200，BD Transduction Laboratories），在4°C下用超量混合液（Tris缓冲盐水、0.25%明胶、0.5%Triton X-100）稀释过夜。在PBS中清洗后，将切片在1:200稀释的二级抗体（驴抗兔-594、驴抗兔-488、山羊抗鼠-594、山羊抗小鼠-488和山羊抗鸡-488（Invitrogen））中培养2小时。切片在PBS进一步清洗，然后用DAPI（1:2500）染色在使用莫维醇防褪色介质（33.3%甘油、16.7%莫维醇4-88、0.02%硫柳汞和2%）进行安装前5分钟n个-PBS中的没食子酸丙酯（均来自Sigma））。使用与配备卡尔蔡司AxioVision 4.7版软件的摄像机（AxioCam HRm）相连的荧光显微镜（蔡司Axioplan2成像）拍摄切片。

联合原位杂交/免疫组织化学

现场在石蜡切片上，杂交与荧光免疫组化相结合。如前所述，将切片脱蜡、再水化、后固定并在蛋白酶K中消化。在PBS中重新固定和洗涤后，将载玻片乙酰化（1.3%三乙醇胺（Sigma）、0.06%盐酸（Sigma-）和2%醋酸酐（瑞士福禄卡）在水中稀释）。然后将切片在1%Triton X-100中渗透，然后在PBS中冲洗，然后在杂交缓冲液中预杂交（50%甲酰胺（Sigma），5×SSC，pH 4.5，5×Denhardt’s，250μg/ml酵母转移RNA（Sigma-），500μg/ml剪切鲑鱼精子DNA（Ambion）在0.1%焦碳酸二乙酯处理过的水中），在55°C下保持2 h。变性的Slc38a7系列加入探针（0.7μg/0.5 ml）在55°C下杂交过夜。第二天，切片在温的5×SSC中清洗，在0.2×SSC在55°C下孵育1小时，在0.2 x SSC中冲洗，并在封闭溶液（0.1）中预先封闭米三氯化氢，pH 7.5，0.15米NaCl和10%白蛋白牛血清（Sigma））中孵育1小时，然后在封闭溶液中以1:2500稀释的碱性磷酸酶缀合的抗地高辛Fab片段（Roche Diagnostics）中孵育过夜。第二天，用2 m厚的TBST冲洗节段米左旋咪唑和2米NTMT米如前所述，左旋咪唑的颜色是在快速红色溶液（罗氏诊断）中形成的。在颜色显影后，按照石蜡切片的荧光免疫组织化学方案处理切片，在抗原检索步骤后开始。主要抗体稀释液为：1:400山羊抗GAD67（Santa Cruz Biotechnology）、1:400鸡抗GFAP、1:400兔抗NeuN（Chemicon/Millipore）和1:2500 DAPI（Sigma）。二级抗体（Invitrogen）被稀释：1:200驴抗羊-488、1:200山羊抗鸡-488和1:200山羊抗兔-488。如前所述，对切片进行拍照和分析。

pβ/RN3P表达载体的克隆

的全长克隆Slc38a7系列基因是由小鼠合成的Slc38a7系列克隆（Invitrogen编号4009949）并插入pcDNA3.1/FLAG载体，如“RNA探针的设计和合成”所述。使用Platinum Pfx校对DNA聚合酶（Invitrogen），使用正向（5′-GATCCGAATTCACAGCCACCGGAATGCCAGGTCAGCATCAA-3′）和反向（5′-GATCCGGCCGCTCAGGCCAAGAGATCCACAAAAA-3′）引物扩增编码序列，使用EcoRI和NotI（Fermentas，Canada）消化，并克隆到pβGFP/RN3P载体中(31,32)通过使用EcoRI和NotI删除原始GFP，并插入Slc38a7系列使用T4连接酶（Invitrogen）进入相同的位点。如上所述提取质粒并测序。这给出了构造pβ/RN3P/Slc38a7系列准备并测序（Eurofins MWG Operon，德国）以确保完整性。

细胞溶胶注射液的mRNA合成

pβ/RN3P/Slc38a7系列用SfiI（加拿大发酵剂）消化表达载体，并使用NanoDrop ND-1000分光光度计（NanoDrot Technologies）测定浓度。根据制造商的说明，使用mMessage Machine T3试剂盒和Megaclear试剂盒（Ambion）进行封盖RNA转录和纯化。在−80°C下储存样品之前，使用Experion自动电泳系统（Bio-Rad）上的Experion RNA StdSens分析试剂盒对浓度进行量化和控制。

卵母细胞制备和微量注射

成年未受精雌性非洲爪蛙，X·莱维斯（Nasco），被安置在一个受控环境中（21°C，12:12光/暗循环），可以接触到鲑鱼丸（Aller Aqua，丹麦）。所有动物实验均由卡罗林斯卡研究所北斯德哥尔摩动物实验伦理委员会批准。手术期间，通过低温进行的物理麻醉用于麻醉青蛙，以移除约3 ml卵巢组织。卵巢组织在OR2缓冲液（82 m）中冲洗米氯化钠，2.5米米KCl，1米米氯化钙2，1米米氯化镁2，1米米纳2高性能操作4和5米米HEPES，pH 7.8）并切成小块。卵母细胞在去绒毛前用7单位研究级的利伯ase进行冲洗TM（TM）（Roche Diagnostics）在19°C慢速旋转期间，在～12.5 ml OR2缓冲液中稀释1小时50分钟。在额外冲洗后，将V–VI期卵母细胞分类，并在19°C下用10μg/ml庆大霉素（Sigma）在OR2缓冲液中孵育过夜。卵母细胞被微注射到细胞质中，注入约36.8 nl的在体外转录的Slc38a7系列mRNA（～25 ng），微操作器（德国莱卡微系统公司）连接至微注射移液管Nanoject II自动纳升注射器（Drummond Scientific Co.），使用莱卡MZ75显微镜，该显微镜的工作台可双向移动。将注射和未注射的卵母细胞作为对照，在19°C的OR2缓冲液中培养48小时，以通过翻译过度表达SLC38A7蛋白。

注射卵母细胞的免疫组织化学

SLC38A7过度表达和对照卵母细胞被植入Killik（意大利Bio-Optica）并冷冻至-80°C，然后在低温恒温器（HM 560，德国Microm International）中切成12μm的薄片。首先将卵母细胞在4%多聚甲醛中固定15分钟，进行免疫组织化学染色。然后用PBS冲洗切片3次，并在超级混合液中预封闭1小时。卵母细胞与我们定制的初级SLC38A7抗体在4°C的超级混合液中将其稀释1:200过夜。第二天，卵母细胞在PBS中清洗，并在次级驴抗兔488（Invitrogen）中以1:400的比例在超级混合液中培养2小时。按照石蜡切片上荧光免疫组化的描述，安装卵母细胞并拍照。

运输分析

将SLC38A7过表达和对照卵母细胞转移到具有一个卵母细胞/孔的96孔板上，并在KRH缓冲液（118m米氯化钠，4.8米米KCl，1.2米米硫酸镁4，2.5米米氯化钙2，10米米HEPES，调节至pH 7.8）15分钟我-最大转运分析的谷氨酰胺浓度为0.2、0.4、1.2、5.2、25.2和125.2μ米 我-其中谷氨酰胺0.2μ米是我-[三H] 谷氨酰胺（PerkinElmer Life Sciences）在固定浓度下，剩下的是冷的我-谷氨酰胺。屏幕带有三H标记我-氨基酸我-谷氨酰胺，我-精氨酸，我-丙氨酸，我-丝氨酸，我-赖氨酸，以及我-天冬氨酸，将卵母细胞孵育60分钟，总浓度1.2μ米氨基酸（0.2μ米 三1μH标记氨基酸米未标记氨基酸）。在时间过程中，卵母细胞在0.2μ米 我-[三H] 谷氨酰胺（PerkinElmer Life Sciences）在KRH缓冲液中稀释2、5、10、20、30、40、60和120分钟我-通过添加0.2μ米 我-[三H] 谷氨酰胺在三种不同的缓冲液中稀释至卵母细胞：KRH缓冲液和118 m的KRH米NaCl被等摩尔LiCl（Sigma）或氯化胆碱（BDH，英国）取代。在一项竞争研究中测量了底物偏好分析，其中0.2μ米 我-[三H] 谷氨酰胺与1μ米未标记的我-存在0.12 m数量的谷氨酰胺米无标签竞争我-氨基酸、α-（甲基）氨基异丁酸（MeAIB）或神经递质（pH调节至7.8，所有底物均来自瑞士Sigma或Fluka）。在所有测试中，卵母细胞都在三除时间过程外，H标记底物保持1小时，并用冰镇KRH缓冲液清洗停止运输。细胞在10%十二烷基硫酸钠中溶解，并转移到带有闪烁溶液的闪烁管中（德国Zinsser分析公司），用于在Packard 1900CA Tri-carb液体闪烁分析仪（Beckman）中计算放射性衰变。所有功能分析均在29°C下进行，每组7–12个卵母细胞，底物偏好分析除外，每组使用12–52个卵母。所有实验重复至少3次。这个第页收集数据的值显示为未配对t吨在SLC38A7过度表达卵母细胞的摄取和对照卵母细胞（非注射）的内源性摄取之间的95%置信区间为平均值±S.D。为了将SLC38A7的底物偏好可视化为特定传输，通过除以1.2μ米无线电标记的我-谷氨酰胺对照没有竞争底物，每个卵母细胞的竞争底物的实际值。

西部印记

我们对成年雄性C57Bl6/J小鼠（Taconic M&B，丹麦）脑组织中的SLC38A7进行了Western blot分析。简单地说，组织在均质缓冲液（50 m）中均质米特里斯，150米米氯化钠，4米米氯化镁，0.5米米EDTA、2%Triton X-100和1 m米蛋白酶抑制剂PMSF（Sigma）在异丙醇中稀释）。根据制造商的说明，通过蛋白质分析DC（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。在运行缓冲液（0.1%十二烷基硫酸钠、0.025 Tris碱和0.192）中的Mini-Protan TGX凝胶（4-10%，Bio-Rad）上分离等量的蛋白质（200μg或13μg/μl），以及PageRuler预处理蛋白阶梯（加拿大发酵剂）米甘氨酸）。将蛋白质转移到转移缓冲液（0.025 Tris碱，0.192）中的Immobilon-P PVDF膜（Millipore）中米甘氨酸和20%甲醇），并在封闭缓冲液（5%脱脂奶粉（Bio-Rad）中预先封闭1h米氯化钠，0.1米Tris，0.05%吐温20，pH 8.0）。将膜从中间切开，得到两个具有相同负载蛋白质样品的膜。将一份膜与抗SLC38A7的一级抗体杂交（稀释1:200，兔抗SLC39A7，瑞典Innovagen）。将膜的另一半与预先用过量的相同合成肽（序列（NH）阻断的SLC38A7一级抗体杂交2-)CVMSKEPDGASGSPW（-CONH2）），用于生成抗体。然后在4°C下过夜进行杂交。在水中清洗后，将膜与辣根过氧化物酶结合二级抗体（稀释为1:10000，羊抗兔，Invitrogen）孵育1 h，然后使用增强化学发光（ECL）方法进行检测。将膜在鲁米诺/增强剂和过氧化物酶缓冲溶液（Immun Star HRP，Bio-Rad）的1:1混合物中孵育3分钟，并在高效化学发光膜（GE Healthcare）上显影。

FLAG-SLC38A7在转染细胞中的定位

两个50%融合HEK 293细胞的细胞培养皿瞬时转染5.3μg pcDNA3.1/FLAG/第38页第7页载体（如“实验程序”所述）和模拟载体作为对照，根据制造商的说明使用Attractene转染试剂进行快速正向转染（Qiagen）。转染48 h后用免疫组化和Western blot证实转染成功。聚乙烯-我-转染前将赖氨酸（Sigma）涂层（10μg/ml）载玻片添加到细胞培养皿的底部，通过首先在PBS中冲洗载玻片进行免疫组织化学。然后将细胞固定在4%多聚甲醛中，预先封闭在超混合液中（Tris缓冲盐水、0.25%明胶、0.5%Triton X-100），并在一级抗体兔抗SLC38A7（1:200，瑞典Innovagen）和小鼠抗FLAG M2（1:200（Sigma））中孵育，在4°C下在超量混合液中稀释过夜。第二天，细胞在PBS中反复冲洗，并在二级抗体山羊抗兔-594和山羊抗鼠-488（Invitrogen）中孵育2小时。在PBS洗涤后，用DAPI（1:2500）染色细胞，并将其安装在DTG DABCO/Tris/甘油（pH 8.6）或1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷/Tris/丙三醇（PH8.6）中。图像在蔡司LSM 510 Meta共焦显微镜（德国蔡司）上拍摄，并用ImageJ进行分析(33). 按照“实验程序”下的“Western blot”进行Western blot，并进行以下更改。在500μl裂解缓冲液（50 m米Tris，pH 8.0，1%Triton X-100，150 m米氯化钠和1 m米PMSF（Sigma）在异丙醇中稀释10分钟，温度为4°C。细胞从培养皿中刮下，转移到试管中，然后用移液管将其打乱。然后将被破坏的细胞以13000×克在4°C下保持15分钟。收集上清液和颗粒，测定浓度并用于Western blot。简单地说，蛋白质的粗提取（50μg）在凝胶上分离并转移到膜上。将膜从中间切开，得到两个具有相同负载蛋白质样品的膜。其中一部分膜与一级抗体兔抗SLC38A7（1:200，Innovagen）杂交，而另一半膜与小鼠抗FLAG（M2，1:1500，Sigma）杂交。膜在二级抗体山羊抗兔HP或山羊抗鼠HP（1:10000，Invitrogen）中孵育，然后用增强化学发光（ECL）法检测。

结果

Slc38a7在脑中有丰富的mRNA表达

A详细就地探针杂交组织定位Slc38a7系列在小鼠脑内进行mRNA检测。cDNA3.1/FLAG mRNA探针合成的探针设计和质量控制/Slc38a7系列矢量如“实验程序”所示补充图1，一和B类分别是。地高辛标记的反义Slc38a7系列mRNA探针杂交序列特异性为742bp，对应该基因的5个外显子。mRNA探针受到控制，在～750 bp处显示出一个低级mRNA的单峰。这个就地杂交方法证实高水平的Slc38a7系列表达为灰质，但不表达为白质。筛查结果显示，海马整体表达模式较高，尤其是齿状回细胞颗粒层、海马锥体细胞层、杏仁核、丘脑、下丘脑、小脑浦肯野细胞层和皮质层。在下丘脑腹内侧部、杏仁核基底外侧部、腹被盖区和蓝斑的神经元中发现了特别强的表达，参见图1,A–M.

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Slc38a7系列mRNA在小鼠脑中的表达。浮动就地用1μg/ml地高辛标记的小鼠进行杂交Slc38a7系列用bregma数进行冠状切片的探讨(A–F)，近景照片(H–M)和具有耳间侧数的矢状截面(G公司). 缩写和描述的大脑区域是从富兰克林和帕西诺斯收集的(59). 高Slc38a7系列表达式位于G公司; 齿状回细胞(GrDG公司)，海马锥体细胞层(派伊)，丘脑核(AD公司)，下丘脑外侧区(左心室)，丘脑束旁核(PF公司)，丘脑中央旁核(个人计算机)，腹侧苍白球(副总裁)，丘脑腹内侧核(虚拟机)，丘脑前内侧核(调幅)，不确定地带(邮编)，下丘脑腹内侧核(VMH公司)，腹外侧部(VMHVL公司)，下丘脑外侧前核(洛杉矶)黑质致密部(SNC公司)，腹侧被盖区(悉尼威立雅运输公司)，红核，大细胞部分(RMC公司)、红核、小细胞部分(RPC（RPC）)侧背被盖核(LDT克)巴林顿核(酒吧)、前庭内侧核、大细胞部分(MVeMC公司)、前庭内侧核、小细胞部分(MVePC公司)，孤束核(溶胶)和孤束(溶胶)指示。H（H）皮质层3–5、6a和6b。我，正中视前核(锰PO)，隔下丘脑核(SHy公司)，斜带水平肢的核(硬盘驱动器)，Calleja群岛(Icj公司和室周前中央核(平均值).J，丘脑前背核(AD公司)，外侧缰核(左侧b)，丘脑内侧核(医学博士)，室旁丘脑核(光伏)，中央丘脑内侧核(厘米)，丘脑腹内侧核(虚拟机)，不确定地带(邮编)，重新聚合丘脑核(重新)，丘脑剑突核(Xi（希）)和外侧大细胞部分(PaLM公司).K（K），下丘脑腹内侧核，中央部分(虚拟硬盘管理)，下丘脑腹内侧核，腹外侧部(VMHVL公司)，基底外侧杏仁核，前部(BLA公司)和外侧杏仁核，背外侧部(LaDL公司).L（左），中脑导水管周围灰色(PAG公司)，腹侧被盖区(悉尼威立雅运输公司)和乳头后核(马来西亚令吉).M（M）、浦肯野层、臂旁外侧核(低压断路器)臂旁内侧核(主生产线)，蓝斑(信用证)巴林顿核(酒吧)，被盖背核，中央周围(DTgP公司)和背侧被盖核(低密度脂蛋白).

SLC38A7 mRNA和蛋白在兴奋和抑制神经元中的表达

现场杂交结合免疫组织化学显示Slc38a7系列带有神经元标记的mRNA，指示Slc38a7系列在小鼠大脑的兴奋和抑制神经元中。与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体协同训练，GFAP是一种主要在胶质细胞中发现的标记物(34)，未显示与的重叠Slc38a7系列mRNA表达(图2一). 联合本地化Slc38a7系列mRNA和神经元标记物NeuN，大多数神经元细胞类型的神经元特异性核蛋白标记物(35)另一方面，表现出高度重叠的表情(图2B类). 所有NeuN染色的细胞均与Slc38a7系列，但并非所有表达Slc38a7系列使用神经元标记物对mRNA进行染色。我们使用GAD67，一种抑制GABA能神经元的标记(36)，与结合第38页第7页mRNA表达证实神经元表达(图2C类). 这个Slc38a7系列与GAD67联合表达显示高度重叠表达。

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神经定位Slc38a7系列. 现场杂交结合免疫组织化学在7μm小鼠脑石蜡切片上的联合定位Slc38a7系列mRNA和已知的细胞标记物。与胶质细胞标记GFAP共表达于第一排(一)，神经元蛋白标记NeuN显示在第二排(B类)，和上的GAD67第三排(C类). 细胞核标记物DAPI染色于蓝色，的Slc38a7系列mRNA输入红色，而其他标记标记在绿色. The mRNA expression ofSlc38a7系列仅与兴奋性和抑制性神经元标记物（×20目标）重叠，而与胶质细胞标记物（x 40目标）不重叠。这个粗箭头指示表达标记和细箭头Slc38a7表达细胞。

我们制备了一种兔多克隆抗体，并使用Western blot分析来研究特异性，参见补充图S2一通过免疫组织化学和Western blot对表达FLAG-SLC38A7融合蛋白的转染细胞进行了额外的特异性研究，参见补充图S2，B类和C类.

我们对小鼠大脑和脊髓进行双重免疫组化，以确定SLC38A7蛋白在中枢神经系统中的定位（参见图3). 用SLC38A7抗体和神经元标记物NeuN、神经元特异性细胞骨架蛋白标记物微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞、GFAP标记物和囊泡、轴突神经终末和突触突触素标记物进行蛋白质共定位(37,38). SLC38A7蛋白在大脑中显示神经元表达，并与MAP2和NeuN共同定位(图3,一和B类). 脊髓中与突触素缺乏共定位表明SLC38A7与脊髓中的神经终末没有重叠，但SLC38A蛋白存在于神经元轴突中(图3C类). SLC38A7的表达与GFAP阳性细胞没有重叠，无论是在大脑中（数据未显示）还是在脊髓中(图3D类).图4显示SLC38A7蛋白的细胞定位，在体细胞和轴突中高表达。

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神经元中SLC38A7蛋白的表达。成年小鼠脑的免疫组织化学(A行和B行位于bregma−1.82）和脊髓(C行和D行使用SLC38A7抗体染色的腰椎L1）节段绿色和蓝色4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）细胞核染色(A–D). 抗体标记在红色;一，微管相关蛋白2(地图2);B类，神经元核蛋白(NeuN公司);C类突触素；和D类、GFAP。一，的第一排显示了SLC38A7和MAP2在大脑皮层的共同定位，显示了神经元染色（×63客观）。B类，的第二排设想SLC38A7主要在神经元中表达。NeuN用于染色大多数神经元细胞类型，表现为高度重叠染色（×20客观）。C类，的第三排显示突触前囊泡蛋白突触素，发现于所有神经末梢。SLC38A7标记细胞存在于运动神经元和神经元轴突中，但不存在于脊髓的神经末梢中（×63目标）。D类在最后一行中，GFAP用于胶质细胞染色，胶质细胞在心室壁和整个脊髓壁周围显示出一条线。图示SLC38A7转运体和GFAP的图像没有显示共同定位（×20客观）。粗箭头指示标记的单元格，并细箭头表示SLC38A7蛋白表达细胞。

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SLC38A7的细胞定位。SLC38A7的细胞定位通过免疫组织化学和SLC38A的主要抗体显示，如绿色上右侧面板(细箭头)和蓝色DAPI染色左边和右侧面板(粗箭头)在bregma−1.82的12μm石蜡包埋小鼠脑切片上进行。高倍（×100物镜）荧光显微镜图像显示了SLC38A7蛋白在细胞体神经元膜、轴突和DAPI染色细胞核周围细胞质皮质中的表达。

SLC38A7在非洲爪蟾卵母细胞中的过度表达

通过在卵母细胞中过表达SLC38A7来进行功能表征，以确定偶联的转运特性和优选的转运底物。克隆的pβ/RN3P/Slc38a7系列该载体含有一个β1-珠蛋白核糖体结合位点，可提高蛋白质表达效率，用于合成信使核糖核酸(补充图S1C类)并进行质量控制，以验证mRNA是否纯净且未降解(补充图S1D类). 将mRNA微注射到卵母细胞中并转化为SLC38A7蛋白。免疫组织化学Slc38a7系列-注射和未注射的带有SLC38A7抗体的卵母细胞显示，过度表达的转运体位于注射卵母细胞的细胞膜附近，表明SLC38A 7在细胞膜中表达(补充图S1E类).

我-SLC38A7对谷氨酰胺的摄取量随时间增加

我们通过测量表达SLC38A7的卵母细胞和对照卵母细胞的放射性标记底物摄取来研究SLC38A 7的特性。带有的屏幕三H标记我-氨基酸(我-谷氨酰胺，我-精氨酸，我-丙氨酸，我-丝氨酸，我-赖氨酸，以及我-天冬氨酸）表明SLC38A7的摄取对我-谷氨酰胺，我-精氨酸，以及我-丙氨酸(图5一). 氨基酸我-谷氨酰胺被选为后续实验的放射性底物。时间进程显示我-表达SLC38A7的卵母细胞对谷氨酰胺的摄取(图5B类). 至少2分钟我-需要摄取谷氨酰胺才能看到显著差异(第页<0.05）。我们发现我-随着培养时间的延长，表达SLC38A7的细胞对谷氨酰胺的摄取量增加，但在60至120分钟的培养时间内未发现明显增加。具体我-2分钟时谷氨酰胺的摄取量仅为60分钟时特定摄取量的4%。为了在测量特定摄取量时有一个较大的动态范围（通过将对照卵母细胞的计数从Slc38a7系列-注射卵母细胞），选择60分钟的孵育时间进行所有摄取分析。这表明SLC38A7是一种容量相对较低的运输工具。

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SLC38A7的时间进程、钠依赖性和底物分布。 一，第个屏幕，共个三H标记我-表达38A7和对照卵母细胞的氨基酸摄取（平均值±S.D。，n个=9–11个卵母细胞）。这个第一排显示我-谷氨酰胺，我-精氨酸，以及我-丙氨酸，而第二排显示我-丝氨酸，我-赖氨酸，以及我-天冬氨酸。未付款t吨平均值95%置信区间的测试表明我-在SLC38A7摄取分析中，谷氨酰胺是最稳定的底物(n个=3），并在以下实验中选择作为基底（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001).B类，吸收0.2μ米 我-[三H] 谷氨酰胺进入表达38A7的卵母细胞。使用不同的培养时间；2、5、10、20、30、40、60和120分钟（平均值±标准差。，n个=6–8个卵母细胞）。SLC38A7表现出随时间增加的可饱和转运。未成对的t吨当比较表达SLC38A7的卵母细胞和对照卵母细胞（未注射）的内源性摄取时，平均值的95%置信区间的测试表明，60分钟我-谷氨酰胺摄入差异最大(第页= 0.0011).C类，对我-[三H] 谷氨酰胺（0.2μ米)测量单位为Slc38a7系列-注射的卵母细胞和未注射的对照卵母细胞（平均值±S.D。，n个=10–22个卵母细胞）。将平均计数与Slc38a7系列-注射卵母细胞和对照卵母细胞以及未配对卵母细胞t吨试验表明SLC38A7的特异性摄取是钠依赖性的(第页<0.0001），可部分替换为胆碱(第页=0.0067），但不是锂。D类，在最后一个图形中我-[三H] 谷氨酰胺（1.2μ米)用于底物偏好分析，其范围高出100倍（1.2米米)竞争性氨基酸、神经递质和MeAIB。SLC38A7蛋白表现出氨基酸的最佳运输，表现为最具竞争力我-所有测试底物的谷氨酰胺（平均值±S.D。，n个=8–52个卵母细胞）。单字母氨基酸缩写表示我-谷氨酰胺，我-组氨酸，我-丝氨酸，我-丙氨酸，我-天门冬氨酸，我-天冬氨酸，我-谷氨酸，我-蛋氨酸，我-亮氨酸，我-甘氨酸、精氨酸、，我-酪氨酸，我-苯丙氨酸，我-脯氨酸和我-赖氨酸、多巴胺(陆军部)，乙酰胆碱(ACh公司)，和γ-氨基丁酸(GABA公司). 氨基酸侧链上的色码是极性不带电的(紫色)，带电(蓝色)，疏水(绿色)，特殊情况(黄色的)，神经递质如所示浅灰色和MeAIB深灰色.具体我-SLC38A7的谷氨酰胺转运以每分钟计数表示A–C，作为的标准化响应我-谷氨酰胺转运通过将实际转运除以阳性对照（无竞争底物），然后计算特定转运D类.

SLC38A7介导钠依赖性氨基酸转运

研究了钠离子依赖性和锂或胆碱离子替代耐受性，以表征SLC38A7的耦合传输特性(图5C类). 在钠离子存在的情况下我-SLC38A7高表达卵母细胞对谷氨酰胺的摄取显著高于对照卵母细胞(第页< 0.0001). 用锂离子取代钠离子表明，锂不能驱动我-谷氨酰胺（SLC38A7）。用胆碱离子替代钠离子表明，胆碱能够在较低程度上（23%的钠驱动转运）驱动我-与对照卵母细胞相比，SLC38A7对谷氨酰胺的摄取显著增加(第页= 0.0067).

SLC38A7转运极性氨基酸和丙氨酸

对氨基酸、神经递质和系统A的特异性抑制剂MeAIB进行竞争分析，以检查SLC38A7的底物分布。首先，要找到产生最高比吸收的总浓度我-谷氨酰胺进入卵母细胞并进行饱和动力学，我们进行了不同总浓度谷氨酰胺的实验我-谷氨酰胺。在可用浓度的我-[三H] 谷氨酰胺(补充图S3)并试图获得V（V）最大值和K（K）米从这个数据可以看出，在5μ米。这表明K（K）米显著高于5μ米可能与其他SNAT的测量范围相同，200–1000μ米(24,39,40). 然而，测试表明，总浓度为1.2μ米 我-谷氨酰胺，含0.2μ米 我-[三H] 谷氨酰胺与1.0μ米未标记的我-谷氨酰胺的比吸收率最高(第页=0.0003）进入表达SLC38A7转运体的细胞。因此，固定总浓度为1.2μ米 我-谷氨酰胺（含0.2μ米 我-[三H] 谷氨酰胺）被用于竞争分析，竞争底物的浓度高出100倍(图5D类). 竞争实验表明，SLC38A7能够运输我-[三H] 谷氨酰胺可以被带有极性不带电侧链的氨基酸抑制，例如我-谷氨酰胺，我-丝氨酸，和我-天门冬氨酸，带正电我-组氨酸以及带负电的我-天冬氨酸和我-谷氨酸。带有疏水侧链的氨基酸，如我-丙氨酸的竞争程度较低。多巴胺、乙酰胆碱和组胺等神经递质在一定程度上抑制了我-[三H] SLC38A7对谷氨酰胺的摄取，但系统A的类似物MeAIB或GABA没有抑制我-谷氨酰胺。通过抑制我-[三H] 谷氨酰胺摄取量排名：我-谷氨酰胺>我-组氨酸>我-丝氨酸>我-丙氨酸>我-天冬氨酸>我-天冬氨酸>我-谷氨酸>我-蛋氨酸>我-亮氨酸>我-甘氨酸。

讨论

我们之前已经确定Slc38a7系列作为一种似乎编码与SNAT类似的新蛋白质的基因(7). 在本研究中，我们阐明了SLC38A7的详细CNS表达模式，并将该蛋白鉴定为我-谷氨酰胺转运体。我们还对衬底轮廓进行了表征。我们证明SLC38A7是一种N型钠偶联氨基酸转运蛋白，我们建议将该蛋白命名为SNAT7，以符合SNAT命名法。

我们使用就地杂交扫描第38页第7页mRNA在小鼠脑中的表达，以确定特定细胞群的定位。我们发现Slc38a7系列在腹内侧下丘脑、基底外侧杏仁核、腹被盖区和蓝斑，这些区域已知与进食有关(41,42). 在皮层内Slc38a7系列该基因在海马中表达于齿状回细胞颗粒层和海马锥体细胞层，这些区域都支持神经元的选择性表达。这个Slc38a7系列该基因也在小脑浦肯野细胞层中表达，称为GABA能(43). 这种表达模式表明Slc38a7系列在兴奋性和抑制性神经传递途径中都有作用。

先前特征SNAT定位于神经元或星形胶质细胞(16,22)，或在某些情况下两者兼而有之(8,20,21)，使我们对研究表达SLC38A7的细胞类型的性质感兴趣。我们使用mRNA表达Slc38a7系列与神经特异性蛋白标记物NeuN结合(35)和胶质细胞标记GFAP(34). 所有NeuN染色的细胞均与第38页第7页但并非所有细胞都表达Slc38a7系列用神经元标记物染色，表明Slc38a7系列在GABA能和谷氨酸能神经元以及可能是神经元前体细胞的其他细胞中。因此，Slc38a7系列共定位于NeuN染色的细胞，在星形胶质细胞中不表达。通过与GAD67（抑制GABA能神经元的标记物）共同定位，进一步证实了GABA能的表达(36).

我们还使用定制抗体检测SLC38A7蛋白。mRNA表达模式Slc38a7系列SLC38A7的类似蛋白表达模式证实了多克隆SLC38A抗体的表位特异性。Western blot研究证实了这一点(补充图S2一). Western blot检测到的～70 kDa蛋白比预期的49.91 kDa大。对此的一个可能解释是在棕榈糖基化或糖基化位点的翻译后修饰。对表达FLAG-SLC38A7融合蛋白的细胞进行免疫组织化学和Western blot研究，进一步证明定制SLC38A抗体的特异性(补充图S2，B类和C类). SLC38A7蛋白和FLAG标签的标记在转染细胞中共同定位，并在Western blot上检测到相同的带，表明抗体的表位特异性。

神经细胞标记物（NeuN）的免疫组织学双重标记证实了SLC38A7在神经元中的定位，总重叠显示了中枢神经系统中所有神经元的表达，包括谷氨酸能神经元和GABA能神经元。SLC38A7的细胞分布显示在胞体和细胞轴突上表达。为了研究SLC38A7是否在神经元末端表达，我们使用SLC38A 7和突触素（突触前囊泡蛋白的标记物）进行了双重标记研究(38). 标记物和SLC38A7没有共同定位，这表明转运体在神经元终末没有表达，而脊髓表达在运动神经元和神经元轴突中有明确表达。

已知SNAT被分类为属于系统N或系统A。已知经典系统A转运蛋白在哺乳动物组织中普遍表达。SNAT1属于系统A，在许多外周组织和中枢神经系统中表达，高度集中于神经元(8,9). 然而，系统N转运蛋白SNAT3在大脑、肝脏和肾脏中强烈表达，并位于大脑的星形胶质细胞上(16). 经典系统N转运体的表达模式比系统a转运体更为受限，通常在肝脏中高表达。我们之前展示过Slc38a7系列在肝脏中高度表达(7)使用定量实时PCR和本研究的结果显示，神经元SLC38A7在大脑中的谷氨酸能神经元和GABA能神经元中均有表达。

众所周知，SNAT家族的特征成员使用钠来耦合传输氨基酸。系统N转运蛋白的一个特点是，它们可以部分地使用锂作为钠的替代物，而经典系统A转运蛋白最初被认为不能容忍锂的替代(44,45). 然而，所有属于系统A的已知SNAT后来被证明能够耐受锂替代(46,47)因此，对锂替代的敏感性不是系统a或N的良好诊断标准。这里我们研究了SLC38A7转运体介导的我-谷氨酰胺、钠和/或锂离子进入细胞。结果表明，这种依赖于钠的传输不能被锂取代。如果有什么区别的话，这可能是系统a转运蛋白的指示，但考虑到相互矛盾的数据，我们建议不应将锂敏感性视为分类的标准。这些发现鼓励进一步的详细研究，以调查运输是否依赖于pH，并澄清我-谷氨酰胺SLC38A7转运刺激钠氢交换，表明SLC38A属于系统N/A分类，而不是ASC系统。

系统A转运体显示氨基酸类似物MeAIB穿过细胞膜的底物选择性(48)，以及广泛的氨基酸，如我-甘氨酸，我-丙氨酸，我-半胱氨酸，以及我-谷氨酰胺(11,49)，而系统N具有我-谷氨酰胺，我-组氨酸，和我-天门冬氨酸作为首选底物(44,46,50). 我们进行了一项竞争性研究，其中各种非放射性标记物质影响我-[三H] 评估谷氨酰胺。竞争试验表明我-[三H] 谷氨酰胺被我-组氨酸和我-丙氨酸，也可以通过具有极性侧链的氨基酸我-谷氨酰胺，我-丝氨酸，和我-天门冬氨酸。此外，在与MeAIB竞争时，系统A的特点(51)和神经递质，如多巴胺、乙酰胆碱、组胺和GABA，我们发现这些不是SLC38A7的首选底物。这表明SLC38A7具有系统N的特征，优先选择我-谷氨酰胺，我-组氨酸，和我-与其他已知的系统N转运体相比，SLC38A7的首选底物分布异常广泛。根据SLC38A7的表达谱、在肝脏的高表达和底物选择性，我们认为SLC38A是一种新的系统N氨基酸转运蛋白。SLC38A7的基底轮廓与SNAT3的基底轮廓最为相似(16,18)和SNAT5(22)，两个运输工具我-谷氨酰胺被归类为系统N亚科。然而，我们发现SLC38A7在大脑中的谷氨酸能神经元和GABA能神经元中都有表达，就像SNAT1一样(8,9)和SNAT2(10,12)而SNAT3和SNAT5的表达仅限于大脑中的胶质细胞以及肝脏和肾脏。总之，这表明SLC38A7是在大脑所有神经元中发现的第一个系统N转运蛋白。另一方面，SLC38A7不允许锂替代钠，并且底物分布异常广泛，这一事实使我们相信SLC38A 7转运蛋白具有经典N和A系统的一些生理特征。

谷氨酰胺是核酸和核苷酸的前体，用于蛋白质合成，也是神经递质谷氨酸的前体物，是谷氨酸-谷氨酰胺循环的中间产物(23,52). 谷氨酰胺大量存在于脑脊液和血浆中，不仅在大脑中发挥重要作用，而且对肝脏中的氨解毒也至关重要(4,53). 研究表明，星形胶质细胞中由谷氨酰胺合成的谷氨酸主要由谷氨酸能神经元释放到突触中(54). 此外，谷氨酸可以通过GAD67或GAD65酶进一步转化为GABA，GAD67和GAD65由GABA能神经元表达。摄取星形胶质细胞释放的谷氨酰胺对神经元提供谷氨酰胺至关重要(55)因此，谷氨酰胺转运体显然是所有神经元的关键蛋白。系统A转运蛋白已被证明在调节神经元摄取谷氨酰胺方面起重要作用(8,46)而系统N转运体通过星形胶质细胞或胶质细胞释放谷氨酰胺(16,18). 分类为类N系统的活动也在神经元中进行了研究(56). SLC38家族中的大多数系统A/N谷氨酰胺转运体，因为它们更喜欢我-谷氨酰胺作为底物，被认为是神经递质谷氨酸合成的一部分，因此可能参与改变GABA和谷氨酸水平以及谷氨酸循环(4,8,18,46). 松德贝里等。(7)之前在一系列大鼠大脑和外周组织中进行了详细的实时定量PCR分析，以建立β-组所有成员的mRNA表达谱。大多数SLC38家族成员都有相对广泛的表达Slc38a7系列在几乎所有被调查的组织中检测到低或中等水平，包括CNS，但在肝脏中检测到较高水平的除外(7).

中枢神经系统和肝脏是谷氨酰胺和谷氨酸代谢对正常细胞功能至关重要的组织(25,52,57). 然而，SLC38蛋白在谷氨酸-谷氨酸循环中的确切作用尚待阐明(28,29). 我们显示了SLC38A7转运蛋白在大脑中细胞体膜和轴突中的高表达神经元定位，并且有利的底物是我-谷氨酰胺。对于SNAT1，其他SNAT蛋白成员的神经元定位仅在谷氨酸能神经元和GABA能神经元的体细胞和树突分支（体细胞）之间(20,24)SNAT2的体脂蛋白和轴突(21). 然而，SNAT1转运体先前被证明位于突触(58). SLC38A7的首选底物和轴突定位靠近突触间隙，突触间隙是递质合成和囊泡包装的地方，这表明SLC38A 7可能在谷氨酸循环中起重要作用。一个重要的相关问题是，特征SNAT是否独立于突触间隙中的间接定位，负责维持谷氨酰胺和GABA神经递质库，或者SLC38A7和其他孤儿转运蛋白是否在循环中发挥更直接的作用。

总之，这些发现表明，SLC38A7是SLC38家族的一个新成员，其功能是脑内谷氨酸能神经元和GABA能神经元中的钠偶联氨基酸转运。更好的运输基质，我-谷氨酸>我-他的>我-序列>我-阿拉>我-Asn>我-天冬氨酸、组织表达模式和钠依赖性转运表明，SLC38A7是系统N氨基酸转运系统的新成员。这种转运体很可能在谷氨酰胺-谷氨酸循环中发挥作用。新型氨基酸转运体（如SLC38A7）的表征可能为深入了解神经生物学中的关键事件提供了线索，包括神经元代谢和神经递质循环。

补充材料

补充数据：

鸣谢

我们感谢Sahar Roshanbin协助进行转运分析，感谢Victoria Gridlund协助进行双原位杂交，感谢Mari-Anne Carlsson协助进行脑组织石蜡包埋。

*这项工作得到了瑞典研究委员会Grant VR-NT 2008-3228（致R.F.）、艾伦斯基金会、诺和诺德基金会、戈兰·古斯塔夫森基金会、恩克维斯特基金会和马格努斯·伯格瓦尔基金会的部分支持。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1-S3和数据S1-S3.

三使用的缩写如下：

SLC公司
溶质载体
墨西哥国际银行
α-（甲基）氨基异丁酸
GFAP公司
胶质纤维酸性蛋白
国民账户体系
钠偶联氨基酸转运蛋白。

参考文献

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会