材料和方法
动物
这些动物是根据北卡罗来纳州立大学机构动物护理和使用委员会的规定和批准使用的,并被安置在兽医学院的实验动物研究设施中。福克斯J1EGFP公司(Ostrowski等人,2003年),福克斯J1-/-(Brody等人,2000年)和福克斯J1-/-EGFP公司在多个发育阶段处死小鼠及其窝友对照组。对于胚胎研究,阴道堵塞的日期被视为胚胎第0天(E0)。为了对组织进行固定分析,用4%多聚甲醛在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中经心灌注动物。灌注后,取下大脑并固定至少24小时。
对于微阵列实验,通过PCR扩增Y染色体上的性别决定区,对处于多个发育时间点的小鼠进行性别基因分型(斯里; 正向引物,5′-TGGGACTGGTACAATTGTC-3′;反向引物,5′-GAGTACGGTCAGCTCT-3′)。提取并处理雄性小鼠的RNA用于微阵列分析。
组织加工和免疫组织化学
为了进行免疫组织化学,在震动器(徕卡VT 1000 S)上以50μm的深度对大脑进行切片。将出生后第0天(P0)新生小鼠的E10胚胎和整个头部固定过夜,在PBS中的30%蔗糖中冷冻保存(含0.05%叠氮化钠),在-80°C下在TissueTek中冷冻过夜,并在低温恒温器(徕卡)上以15-20μm的厚度切片。在PBS中用10%的山羊血清或10%的驴血清(用于涉及山羊初级抗体的实验)和1%的Triton X-100(Sigma,S26-36-23)阻断脑切片,然后在4°C下与初级抗体孵育过夜。使用与Alexa 488、Cy3和Alexa 647结合的合适的山羊或驴二级抗体进行可视化(均稀释为1:1000,室温下培养1小时)。使用的主要抗体包括:兔抗Dlx2(D.Eisenstat,加拿大马尼托巴大学;1:1000)、鼠抗FoxJ1(1:200)、鼠防Gfap(Milipore;1:1000,小鼠抗Lhx6(Novus Biologicals;1:200)、兔抗S100β(Sigma;1:1000,大鼠抗CD31(BD Pharmigen;1:500)、大鼠抗CD133(eBioscience;1:1000)、小鼠抗nestin(Chemicon;1:1000。一些切片用Alexa-647结合Nissl染色(Invitrogen;1:1000)进行复染,以对标记组织进行细胞结构评估。
对于原位杂交,与GenBank序列的核苷酸784-1368对应的探针{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“NM_008240”,“术语id”:“226693375”}}NM_008240号(福克斯J1)通过PCR扩增福克斯J1cDNA(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯,美国)。使用DIG RNA标记试剂盒(Roche Diagnostics)生成地高辛(DIG)标记的反义和正义核糖探针。成人大脑的冷冻切片与核糖探针在55°C下杂交30小时。清洗和封闭后,用与碱性磷酸酶(1:1000)结合的抗DIG抗体在4°C下培养切片过夜。DIG标记使用硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸展开剂进行可视化。
脑室内慢病毒和细胞注射
确定了有效的FoxJ1-特异性shRNA序列(参见补充材料中的图S7)。这个shFoxJ1型-如前所述,通过将病毒构建物转染到人类293细胞中来生成lent和control-lenti载体(奥尔森,1998;O'Rourke等人,2005年;Jacquet等人,2009年). EGFP报告子在鸡β-肌动蛋白启动子下表达,用于追踪转导。对于细胞移植研究,福克斯J1-/-EGFP公司或福克斯J1+/+EGFP公司将细胞注射到野生型和福克斯J1-使用立体定向仪使动物无效。使用荧光激活细胞分选(Dako Cytomation MoFlo;NCSU流式细胞术和细胞分选实验室)获得细胞制剂,然后在人工脑脊液中重新悬浮(Ghashghaei等人,2007b)补充10ng表皮生长因子(Egf)和成纤维细胞生长因子(Fgf2),最终浓度为1×106EGFP公司+细胞/微升。
对于移植和慢病毒注射,新生幼崽(P0)按照前面描述的低温方法进行麻醉(Ghashghaei等人,2007b). 对于shFoxJ1型-lent和control-lenti载体注射,每个载体1μl(1010感染单位/ml)通过立体定向手术注入P0幼崽的前外侧脑室(n个=每个构件3个)。对于细胞移植研究,将1μl再悬浮细胞注射到每个半球(106EGFP公司+细胞/μl)。野生型幼鼠脑室内注射对照载体(n个=3),shFoxJ1型-透镜矢量(n个=3)或福克斯J1-/-EGFP公司单元格(n个=3).福克斯J1-/-给幼崽注射福克斯J1+/+表皮生长因子单元格(n个=3). 手术后,将注射的幼崽放在加热灯下快速苏醒。每只幼崽的整个手术过程持续不到15分钟。恢复15-20分钟后,将幼崽放回母体,并在第21页处死。
FoxJ1非依赖性脑积水模型
P0野生型B6/C57小鼠用于高岭土诱导脑积水。如前所述,在人工脑脊液中将高岭土(Sigma,K1512-500G)溶解至25%的工作浓度(Ghashghaei等人,2006年). 将幼犬置于冰上1分钟,通过低温诱导麻醉,并在不到3分钟的时间内将3μl高岭土溶液注入其大池。将注射的幼崽置于加热灯下,直到在20分钟的恢复期内呼吸稳定。将恢复的幼崽送回其母亲身边,并在P6和P21时处死那些出现脑积水的幼崽,以分析SCN的分化。
Dnaic1号机组-/-老鼠(Ostrowski等人,2009年)作为一个遗传模型,用于评估脑积水对脐部SCN发育和出生后神经发生的影响。脑积水的发育时间进程Dnaic1号机组-/-小鼠与福克斯J1-/-小鼠,从P1和P6之间开始,心室容积逐渐增加P21。Dnaic1号机组-/-如前所述,在P6和P21处灌流野生型窝鼠(n个=每个年龄组每个基因型3个)。如上所述,对大脑进行切片并评估SCN细胞类型。
神经层培养
来自P0和P21的大脑福克斯J1+/+EGFP公司快速收集小鼠,然后进行SVZ和RMS的显微切割和分离。使用Dako细胞学MoFlo对细胞进行分类,并立即在补充有生长因子的神经基底培养基中培养,如前所述(Jacquet等人,2009年). 获得的神经球每5天传代一次,分离成单个细胞,然后在Neurobasic培养基中培养。每次传代后,EGFP的百分比+通过计算每个孔中的神经球数量来计算神经球(n个=每条通道6)。神经球在层粘连蛋白和多聚体上分化-我-在不含生长因子的Neurobasic培养基中,将赖氨酸涂层玻片放置10天。分化培养物用4%多聚甲醛固定,并像组织处理一样进行免疫染色。
数据分析
使用共焦显微镜(尼康Eclipse C1)进行组织和细胞培养分析,并使用前面描述的标准体视学估计方法对数据进行量化(Ghashghaei等人,2006年). 使用Student’st吨-测试和所有数值均表示为平均值±标准误差。
激光捕获显微镜
从P1、P7和P14获得的大脑福克斯J1+/+EGFP公司将雄性小鼠收集在PBS中的10%RNA保存液(50%硫酸铵,10 mM EDTA,25 mM柠檬酸钠,无RNase水,pH=5.2)中,包埋在无RNaseOCT培养基中,并在−80°C下冷冻过夜。然后在10μm的低温恒温器上对大脑进行切片,并收集在膜玻片上(蔡司;NF 1.0 PEN;1mm,核酸酶和人类核酸游离)。在使用前30分钟对载玻片进行紫外线照射。带矢状面的幻灯片福克斯J1+/+EGFP公司切片被快速放置在蔡司Axiovert 200显微镜下,该显微镜与具有外荧光功能的PALM微激光系统耦合。使用355 NANAO激光进行显微切割福克斯J1+/+EGFP公司前脑中的域(激光光斑大小,7.5μm;脉冲功率,100 mW;脉冲持续时间,0.8-1.5毫秒)。将切除的组织捕获到含有10μl TRIzol(Invitrogen)的Eppendorf试管中。在TRIzol中通过组织匀浆提取RNA,然后进行RNA净化(美国加利福尼亚州巴伦西亚市齐根)。
微阵列实验
激光捕获提取的总RNA福克斯J1EGFP公司域用于微阵列实验。在北卡罗来纳大学神经科学中心功能基因组学核心设施使用Affymetrix基因芯片小鼠基因1.0 ST阵列进行表达谱分析,包括cRNA合成和芯片杂交。数据来源:福克斯J1EGFP公司+和福克斯J1EGFP公司-来自wild-type和福克斯J1-在三个发育时间点对空白大脑进行比较,选择平均fold-change为1.5或以上(三个年龄段的s.e.m.≤0.1)的大脑进行后续分析。根据日志上的标准化表达值计算出的fold-changes进行分层聚类2使用MeV Multi Experimental Viewer软件(4.1版)进行缩放。如下所述,通过定量实时PCR(qRT-PCR)证实了一组编码细胞骨架相关蛋白的基因在出生后三个发育时间点具有统计一致的折叠变化。已确定的基因在室管膜层中的表达已在艾伦脑图谱的切片中得到证实网址:http://www.brain-map.org(参见补充材料中的图S9)。本出版物中讨论的数据保存在NCBI的基因表达总览中(Edgar等人,2002年)并可通过GEO系列登录号访问{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE18678”,“term_id”:“18678”}}GSE18678标准.
逆转录酶(RT)-PCR
使用全脑TRIzol提取物分离总RNA,并使用Protoscript II RT-PCR Kit(新英格兰生物实验室)制备cDNA。使用基因特异性引物:5′-GAGCTGGAACCCAAAGC-3′和5′-GGAACATGGGTGGATAAAC-3′进行PCR扩增福克斯J1通过在94°C下变性30秒、在51°C下退火30秒和在72°C下延伸2分钟进行25个扩增循环。
协同免疫沉淀和western印迹
动物因过量使用异氟醚和野生型或福克斯J1-/-快速收集不同年龄段的小鼠并进行裂解以提取蛋白质。为了检测FoxJ1蛋白水平,将从E20和P0小鼠中提取的蛋白转移到膜上,并在4°C下与兔抗FoxJ1-抗体(亲和生物试剂;1:200)孵育过夜。为了进行免疫沉淀,将裂解产物与抗γ-微管蛋白(Sigma)的一级抗体在4°C下孵育过夜。然后根据制造商的说明(Invitrogen),使用蛋白G-琼脂糖珠纯化免疫沉淀蛋白。样品在还原性SDS-PAGE凝胶上进行,然后半干转移到硝化纤维素膜上。然后封闭膜(5%脱脂奶粉),接触针对Dnaic(Milipore)、Dnahc(Santa Cruz)和Kif6(AbCam)的初级抗体。将膜与与辣根过氧化物酶(Millipore;1:1000)结合的适当二级抗体(山羊抗兔或抗鼠)在室温下孵育1小时。所有的膜都是用ECL试剂盒(Pierce,32106)可视化标记带。
结果
叉头转录因子FoxJ1在成人SCN中表达
成年小鼠表达增强型GFP的检测福克斯J1发起人(福克斯J1EGFP公司) (奥斯特罗斯基等人,2003年)心室上皮和海马齿状回FoxJ1表达水平较高(; 参见补充材料中的图S1)。原位杂交和免疫组织化学证实了SVZ中转基因表达的有效性(). 高扩增标记物分析显示,大多数钙结合蛋白S100β阳性的室管膜细胞在SVZ中表达FoxJ1(). FoxJ1的子集+与心室接触的细胞共同表达表面蛋白CD133(Prominin 1-小鼠基因组信息学),最近研究表明,该蛋白标记成年SVZ室管膜细胞() (Coskun等人,2008年). 此外,SVZ中一个有趣的星形胶质细胞亚群表达FoxJ1,胶质纤维酸性蛋白(Gfap)阳性(). 相反,表皮生长因子受体(Egfr;). 大多数FoxJ1+星形胶质细胞有一个较长的接触CD31的突起+SVZ内的(Pecam 1-小鼠基因组信息学)血管() (Tavazoie等人,2008年).
FoxJ1在成人大脑中的表达。(A类)8周龄成人的Nissl(红色)染色矢状面切片福克斯J1EGFP公司小鼠大脑显示EGFP在海马体(Hipp)、小脑(CBL)、间脑核(DIEN)、SVZ、RMS和OB的子集中表达。(B类,C)原位杂交(B,蓝色)和使用单克隆FoxJ1抗体(FoxJ1-mAb;C,红色)的免疫染色证实了SVZ、RMS和OB中的转基因表达。(D-N型)高放大共焦显微照片福克斯J1EGFP公司-在SVZ(D-I)、RMS(J-L)和OB(M,N)表达细胞类型。单克隆FoxJ1抗体阳性的一小部分细胞福克斯J1EGFP公司,与多克隆Gfap抗体共同标记(G,pGfap,蓝色;箭头,三标记FoxJ1+星形胶质细胞;箭头,FoxJ1-星形胶质细胞)。许多FoxJ1+SVZ中的星形胶质细胞有一个细长的突起(I,箭头),与CD31阳性的血管接触(I,星号,蓝色)。在RMS中,许多福克斯J1EGFP公司细胞表达未成熟/放射状胶质标记物脑脂结合蛋白(Blbp;L,箭头)。少数还表达祖细胞特异性中间丝巢蛋白和配对同源盒域转录因子Pax6(L,箭头)。比例尺:A、B中为100μm;C-N中为10μm。
在RMS中,迁移神经母细胞表达多唾液酸化神经元细胞粘附分子(PSA-NCAM)、Gfap+星形胶质细胞与S100β+胶质细胞(未显示)缺乏福克斯J1EGFP公司表达式(). 然而,大多数福克斯J1EGFP公司RMS中的细胞对未成熟的放射状胶质细胞标记物脑脂结合蛋白(Blbp)和巢蛋白阳性(). 少数细胞也表达低水平的配对同源盒域转录因子Pax6(). 因此,福克斯J1EGFP公司细胞可能构成RMS中独特的祖细胞群。
在OB中福克斯J1EGFP公司细胞为Gfap+星形胶质细胞,但神经元缺乏福克斯J1EGFP公司表达式(). 总之,这种细胞特征表明FoxJ1主要由室管膜细胞和SVZ中的一小部分星形胶质细胞表达。我们还发现福克斯J1EGFP公司RMS中的细胞构成了潜在的Blbp群体+巢穴+第6页+祖先,而大多数福克斯J1EGFP公司OB中的细胞是星形胶质细胞的一个子集。
室管膜细胞和FoxJ1+星形胶质细胞在出生后的两个不同时间点出现在SVZ中
基于FoxJ1在大脑中的细胞和区域特异性定位,我们接下来绘制了福克斯J1EGFP公司出生前的表现。福克斯J1EGFP公司在头侧前脑中的表达包括脉络丛、外侧神经节隆起(LGE)心室表面及其附近的放射状胶质细胞和嗅室(; 参见补充材料中的图S2)。围生期绘图和量化显示,与出生前相比,FoxJ1在出生时显著上调(P0)(E20;). 在P1福克斯J1EGFP公司细胞沿着脑室壁在整个大脑中增加,新细胞在形态上呈立方形而不是拉长,类似于福克斯J1表皮生长因子+LGE中的放射状胶质细胞(). 到了P6,许多正在扩张的FoxJ1+细胞开始表达S100β,明显类似室管膜细胞()与之前报道的室管膜细胞成熟时间相匹配(Spassky等人,2005年). 值得注意的是S100β的出现+胚胎区室管膜细胞延迟福克斯J1EGFP公司表达(例如LGE的心室区)。因此,室管膜细胞在心室区的非传入区域,如室间隔的心室区和胼胝体下方的心室背表面,似乎分化较早(P1和P6之间)。
FoxJ1的出现+出生后SCN中的细胞。(A-E公司)福克斯J1EGFP公司E20小鼠胚胎中的巢蛋白表达+侧神经节隆起(LGE)、嗅室(RMS)和OB壁上具有放射状胶质细胞形态(A,插图)的细胞。在SVZ中,转换福克斯J1EGFP公司+巢穴+放射状胶质细胞(B,插图)开始失去其均匀的极化过程。通过实时PCR(C)、逆转录酶(RT)-PCR(D)和western blotting(E)定量FoxJ1在出生时的上调。(F类,F类′)P1,FoxJ1+放射状胶质细胞持续存在于SVZ和RMS的深处(F,箭头),而室管膜细胞开始出现在靠近心室腔的SVZ(F′,立方细胞,红色箭头)。(G-J)在P6,室管膜层扩张(G)福克斯J1表皮生长因子+S100β+细胞变得明显(H)。虚线表示G。室管膜细胞中的SVZ不表达放射状胶质标记物Blbp(H,插图)。独特的人口福克斯J1EGFP公司+Blbp公司+细胞存在于SVZ的深部区域(G中标记为放射状胶质的方框区域在I中放大)和RMS(J)中。(K(K))P14、P19和P21矢状截面的低倍显微照片福克斯J1EGFP公司大脑mGfap(红色)和S100β(蓝色)染色。高放大面板是从相应的矢状截面制备的扁平内嵌室管膜层的共焦显微照片。新发现的狐狸J1到达+星形胶质细胞(用虚线表示)出现在P19和P21之间。(L(左))不同类型FoxJ1的密度+多个出生后时间点的细胞。L中的数据是从三个标记的组织中获得的体视学估计值(细胞密度=细胞数量×104/毫米三,n个=每个年龄组3人)。
有趣的是,FoxJ1的一个子集+Blbp公司+在LGE中发现的放射状胶质细胞(参见补充材料中的图S2)在P6持续存在于SVZ中,在解剖学上与成熟的FoxJ1不同+和S100β+细胞。福克斯J1+Blbp公司+细胞主要位于TAP层()和RMS()室管膜细胞间只有少量插入。因此,通过P6,FoxJ1中分化的初始波+细胞对室管膜细胞的成熟具有特异性。然而,我们无法检测到任何FoxJ1+在这一阶段,SVZ中的星形胶质细胞,但发现在出生后早期发育过程中,似乎在SVZ和RMS中持续存在放射状胶质细胞亚群。
确定FoxJ1的出现时间+成人SCN中发现的星形胶质细胞()我们标记S100β作为室管膜细胞的标记物,并使用针对SVZ星形胶质细胞的Gfap(mGfap)单克隆抗体。大多数FoxJ1+P19之前的细胞是新生的S100β+mGfap公司-室管膜细胞与Blbp+百万加法郎-放射状胶质样细胞(). 有趣的是,在P19和P21之间,FoxJ1的一个子集+室管膜细胞间的细胞开始表达mGfap(). 这些FoxJ1+S100β-百万加法郎+在出生后6周(SVZ中所有星形胶质细胞的1.6±0.5%)和6个月(SVZ的2.1±0.6%)之间,细胞变得更加丰富(n个=每个年龄组3人;). 因此,出生后前脑中FoxJ1显著上调后+室管膜细胞在出生后第一周分化。随后在出生后第三周末出现第二波分化,此时FoxJ1的一小部分+SVZ星形胶质细胞在出生后的前6个月开始分化,密度逐渐增加。
FoxJ1是室管膜细胞出生后分化所必需的+SVZ中的星形胶质细胞
大脑中FoxJ1的时间和空间表达的变化启发了这样一种假设,即在出生后,FoxJ1的两个分化波+在LGE-到SVZ的转变过程中,SCN成熟需要细胞。为了验证这个假设,我们使用了福克斯J1敲除小鼠(福克斯J1-/-)表现出与整个发育过程中缺乏活动纤毛相关的随机不对称缺陷(Brody等人,2000年).福克斯J1-/-没有表现出异常左/右不对称的小鼠存活到成年早期,但其脑室表面缺乏活动纤毛,并出现脑积水(). 重要的是,P21的多个脑区和福克斯J1-/-OB最显著(体积减少66±12%;; 参见补充材料中的图S3)。
福克斯J1-/-小鼠未能建立SCN。(A类,A类′)从野生型(A)和福克斯J1-/-(A′)室友。箭头指向OB,箭头指向小脑。(B类,B类')野生型和福克斯J1-/-室友。箭头指向均方根值,方框区域划分了E-G′高倍共聚焦图像中显示的区域。(C,C′)P21野生型(C)和福克斯J1-/-(C′)室友。彩色细胞是根据先前研究的描述进行分类的(Doetsch等人,1997年). 红色箭头指向内部异常聚集福克斯J1-/-未分化室管膜细胞。(D类,D类')从SVZ心室表面获得的扫描电子显微照片显示福克斯J1-/-但它们在野生型动物中明显存在。(E-F公司′)S100β+和CD133+野生型小鼠室管膜细胞及其缺失福克斯J1-/-SVZ。(G公司,G公司')剩余Blbp+放射状胶质细胞位于室管膜细胞的位置福克斯J1-/-SVZ公司。
生长迟缓福克斯J1-/-小鼠OB,以及福克斯J1EGFP公司在LGE和嗅室中,这些结构中的特定事件可能发生改变,OB神经发生在胚胎期和围生期(Hinds,1968a年;Hinds,1968b年;拜耳,1983年;Gong和Shipley,1995年). 令人惊讶的是,我们只发现出生前LGE和嗅室区(参见补充材料中的图S4)、胚胎和新生儿中已知祖细胞结构域的模式、密度和增殖发生细微变化福克斯J1-/-这些动物的大小和大脑组织都非常正常。此外,初生纤毛以与野生型动物相似的方式表达在胚胎心室区内衬的放射状胶质细胞顶面上福克斯J1-/-LGE,表明FoxJ1不是初级纤毛发生所必需的(参见补充材料中的图S4)。这些发现,再加上出生时FoxJ1的显著上调,促使我们假设FoxJ1的表达可能在出生后SCN的建立中具有时间集中作用。为了检验这种可能性,我们首先询问是否在P6中适当指定了产后SCN的成分福克斯J1-/-SVZ使用S100β标记。事实上,我们发现S100β+P6心室壁中立方细胞未出现福克斯J1-/-小鼠(参见补充材料中的图S5),表明FoxJ1是室管膜细胞分化所必需的。
为了确定成年SCN是否在福克斯J1-/-小鼠,在P21检测星形胶质细胞和室管膜细胞的细胞完整性,此时成年期SCN为已建立。透射和扫描电子显微镜清楚地显示,在皮肤表面没有活动纤毛福克斯J1-/-SVZ,以及这些小鼠室管膜层组织的破坏(). 尽管没有活动纤毛,原发纤毛仍存在于福克斯J1-/-SVZ(参见补充材料中的图S6)。如怀疑的那样,S100β+百万加法郎-室管膜细胞几乎缺失()CD133的表达在福克斯J1-/-SVZ公司(). 这些发现表明,在没有FoxJ1表达的情况下,室管膜细胞在任何发育阶段都无法成熟。取而代之的是,我们发现了大量残留的未成熟Blbp+单元格(),表明福克斯J1-/-桡侧胶质细胞可能处于未分化状态。
FoxJ1是SCN分化所需的细胞自主性
基于扰动的细胞特异性表型,我们开始明确评估福克斯J1成年SCN细胞成分的缺失。为了实现这一点,我们越过了福克斯J1EGFP公司记者老鼠进了福克斯J1-/-要获取的背景福克斯J1-/-EGFP公司动物。总密度福克斯J1-/-EGFP公司细胞数高于福克斯J1+/+EGFP公司SVZ中的对照组,它们明显小于野生型细胞(). 正如所怀疑的,几乎所有福克斯J1-/-EGFP公司细胞表达Blbp,表明它们未能成熟(). 此外福克斯J1-/-SVZ包括mGfap密度的显著增加+类似反应性星形胶质细胞的细胞,其突起密集分布于福克斯J1-/-表皮生长因子单元格(,星号)。然而福克斯J1-/-EGFP公司SVZ中的细胞为Gfap+与中的相比福克斯J1+/+EGFP公司小鼠(分别为9±0.3%和19±0.8%;). 因此,FoxJ1在一定程度上是区分FoxJ1+P21在野生型SVZ中出现的星形胶质细胞。
细胞分化中断福克斯J1-/-SVZ公司。(A类)来自SVZ心室表面的共焦显微照片福克斯J1+/+EGFP公司和福克斯J1-/-EGFP公司老鼠。福克斯J-/-EGFP公司在SVZ(红色虚线)中追踪细胞。利用体视学细胞计数(细胞数×10)估算细胞密度4/毫米三). 细胞直径被定义为每个细胞两端之间的最长距离,单位为μm(每个基因型三个个体中的33个细胞;平均值±标准差;星号,P(P)<0.01,学生的t吨-测试)。(B类)福克斯J1+/+EGFP公司和福克斯J1-/-EGFP公司评估小鼠SVZ表面Blbp和mGfap的表达。反应性星形胶质细胞增生福克斯J1-/-EGFP公司SVZ与EGFP没有重叠+域包含福克斯J1-/-细胞,但位于邻近的TAP结构域和纹状体组织的深处(星号)。右侧的mGfap面板显示福克斯J1+/+EGFP公司和福克斯J1-/-EGFP公司带有mGfap的P21 SVZ中的细胞+高倍镜下的星形胶质细胞(箭头)。条形图显示了福克斯J1+/+表皮生长因子和福克斯J1-/-EGFP公司Blbp和mGfap阳性细胞(每个基因型3只小鼠;n个=每只老鼠50个细胞)。(C)福克斯J1-/-EGFP公司心室完全缺乏玫瑰花结/钉轮组织,β-catenin和γ-tubulin的表达大量中断。γ-微管蛋白的大聚集体位于福克斯J1-/-单元格(箭头)。(D类)基底体(红色箭头)组织的TEM图像福克斯J1+/+和福克斯J1-/-SVZ公司。在P6,在野生型SVZ中发现的氘体在福克斯J1-空鼠标(红色箭头)。通过P21,基底体成功地运输到野生型室管膜细胞的顶面并停靠在其上,而在福克斯J1-/-细胞只有基底体的聚集体才能以无组织的方式被发现。比例尺:1μm。
接下来,为了检查侧脑室表面室管膜和星形细胞的玫瑰花结/钉轮结构,我们获得了室管膜层的完整制剂,并对Gfap、β-连环蛋白和γ-微管蛋白进行了免疫染色(). β-catenin是Wnt信号通路的重要组成部分(Schlessinger等人,2009年)在野生型室管膜细胞的侧面和顶面表达。γ-微管蛋白是位于纤毛基底部的微管组织复合体的一种成分,对纤毛的生长和维持至关重要(奥克利,1992年)并清楚地修饰多毛室管膜细胞的顶面(Mirzadeh等人,2008年). 室管膜细胞和星形胶质细胞的花环/针轮组织是表面上没有福克斯J1-/-心室,伴随连接β-catenin表达中断(). 为了确定连接蛋白β-catenin表达的中断是否是由于连接复合体的丢失所致福克斯J1-/-SVZ,我们进行了透射电子显微镜(TEM)分析。突变细胞壁上的连接复合体很容易被检测到,尽管它们的方向和定位被严重破坏(参见补充材料中的图S6)。因此,β-catenin在福克斯J1-/-SVZ并不是由于沿着心室的突变细胞内连接复合体的完全丢失。
福克斯J1-/-EGFP公司细胞胞质中含有异常大的γ-微管蛋白聚集体(,箭头),表明在没有FoxJ1表达的情况下,γ-微管蛋白无法分布并停靠在分化室管膜细胞的顶面。P21 SCN的TEM分析显示,在福克斯J1-/-心室壁细胞(). 这表明γ-微管蛋白免疫反应颗粒的聚集物可能与细胞浆内的基底体相对应福克斯J1-/-细胞。为了确定基底体的聚集是否与出生后早期纤毛发生期间的复制有关,我们对P6 SVZ进行了TEM分析。我们发现含有基体的结构,称为氘核体(Spassky等人,2005年)在分化的野生型室管膜细胞中可见,但在福克斯J1-/-心室壁细胞(). 相反,在P6的细胞质中发现了无组织的基底体聚集体福克斯J1-/-细胞,表明中脑体的形成,可能还有基底体的运输,在FoxJ1表达缺失的情况下被破坏。
为了排除全身敲除FoxJ1的潜在旁观者效应,我们克隆并测试了一个短发夹RNA(shRNA)序列,用于急性敲除Fox J1表达(参见补充材料中的图S7)。我们发现与福克斯J1-/-EGFP公司细胞,表明FoxJ1在SCN分化中具有细胞自主作用(参见补充材料中的图S7)。
最后,为了确认FoxJ1是否具有细胞自主功能,以及野生型或敲除环境是否影响观察到的表型,我们在新生小鼠中进行了移植研究。P0(P0)福克斯J1+/+EGFP公司和福克斯J1-/-EGFP公司将细胞交叉移植到没有EGFP报告基因表达的P0野生型和敲除小鼠中,并允许宿主小鼠存活到P21(). 我们发现野生型EGFP+细胞移植到福克斯J1-/-心室并入宿主SVZ并分化为多毛室管膜细胞福克斯J1-/-环境().福克斯J1-/-EGFP公司注入野生型心室的细胞也并入野生型室管膜层,但未能成熟为多细胞室管膜细胞(S100β;箭头)或星形胶质细胞(mGfap;星号),并维持Blbp+身份(n个=3;). 同时,CD133+纤毛在80±16%以上福克斯J1+/+EGFP公司移植到敲除宿主脑中的细胞(n个=3),而CD133在福克斯J1-/-EGFP公司移植到野生型宿主脑中的细胞(). 与其他实验一样,在移植的小鼠体内不断发现γ-微管蛋白聚集体福克斯J1-/-表皮生长因子细胞,而相邻的EGFP-野生型室管膜细胞顶端表面有γ-微管蛋白斑点(,箭头)。总之,基因敲除、shRNA和交叉移植实验的结果最终表明,FoxJ1是室管膜细胞分化所必需的,FoxJ2的一个子集+大脑心室区的星形胶质细胞以细胞自主的方式。
FoxJ1是室管膜和星形细胞分化所需的细胞自主性。(A类)交叉移植福克斯J1-/-EGFP公司击倒(KO)和福克斯J1+/+EGFP公司野生型细胞转化为EGFP-野生型和福克斯J1-/-KO主机。(B类)野生型细胞分化为室管膜细胞(箭头,S100β+; CD133型+)和星形胶质细胞亚群(星号,Gfap+)尽管他们的KO主机环境。KO细胞保持未成熟(Blbp+),尽管它们的宿主环境是野生型的。(C)γ-微管蛋白聚集物存在于KO细胞或EGFP内-KO主机SVZ(箭头)。(D类)EGFP的百分比+SCN中表达不同标记的细胞(n个=每个基因型3只小鼠,50 EGFP+每只老鼠的细胞数)。数据为平均值±标准误差。;星号,P(P)<0.01,学生的t吨-测试。
福克斯J1-/-表型与脑积水无关
P21中缺陷的可能原因福克斯J1-/-脑室区可能是由于脑积水。我们通过检测两种独立的脑积水模型(一种是遗传性脑积水,另一种是梗阻性脑积水)的室管膜细胞和星形细胞完整性来探讨这个问题。首先,运动纤毛中轴突动力蛋白主要成分的基因缺失[轴突中间链1(德奈1)]导致纤毛运动改变和随后的非梗阻性脑积水(Dnaic1号机组-/-; 参见补充材料中的图S8)。这些小鼠脑积水的发生和发展与福克斯J1-/-老鼠。在另一个模型中,注入高岭土(Marlin等人,1978年)进入P0野生型小鼠的大脑大区导致P6的显著脑积水。的SCNDnaic1号机组-/-在P6和P21处对注射高岭土的小鼠进行分析。与S100β缺失形成对比+室管膜细胞福克斯J1-/-两种脑积水模型的脑室表面都排列整齐(参见补充材料中的图S8)。然而,这两种模型在P21处均显示不同程度的反应性星形胶质细胞增生,这也存在于福克斯J1-/-小白鼠和其他患有脑积水的小白鼠(Kuo等人,2006年). 因此,室管膜细胞的缺失和星形胶质细胞亚群分化的中断福克斯J1-/-SVZ似乎与脑积水引起的脑室内压升高无关。
的发展潜力福克斯J1EGFP公司SCN中的单元格
我们发现FoxJ1的一小部分+SCN中的星形胶质细胞提出了一个问题,即它们是否具有神经干细胞的特性。为了解决这个问题,从显微解剖的P0和P21 SVZ中分离细胞福克斯J1EGFP公司老鼠。EGFP公司+和EGFP-细胞经FACS分类并在生长因子存在下培养数天(). 这两个群体都产生了神经球,这是神经干细胞的克隆(Reynolds and Weiss,1992年). 有趣的是,EGFP中的细胞-神经球开始表达福克斯J1EGFP公司1周后(,红色箭头),表示转化或分化为FoxJ1+来自EGFP的细胞-体外培养期间的神经球祖细胞池。EGFP之间神经球的数量和大小相似+和EGFP-这两个组都可以被传递至少十次,这表明福克斯J1EGFP公司细胞具有自我更新能力(). 然后将两组神经球镀在层粘连蛋白和聚乳酸上-我-赖氨酸作用10天及其子代分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元(). 在两种EGFP中都注意到向胶质生成的优先转移+-和EGFP--来源于神经球,但在培养物中也发现了许多神经元。这一发现表明福克斯J1表皮生长因子细胞在体外具有自我更新和神经生成潜能,这些细胞可能在成人SCN中起到干细胞的作用。
分化潜能福克斯EGFP公司出生后SCN中的细胞。(A类,B类)P21 SCN衍生福克斯J1EGFP公司细胞经FACS分类(A)培养形成神经球(B)。福克斯J1来自EGFP的浮动神经球保持启动子活性+分数,并在一些EGFP中可见--体外生长7天后衍生出的神经球(箭头)。(C)福克斯J1EGFP公司+和福克斯J1EGFP公司-神经球在第21页产生了相似数量的神经球。包括福克斯J1EGFP公司+EGFP中细胞逐渐增多--衍生细胞,表明至少福克斯J1EGFP公司来自SCN的细胞可以自我更新。神经球的数量是每10毫米2培养井。(D类)福克斯J1EGFP公司-衍生的神经球产生神经元(TuJ1+)、星形胶质细胞(mGfap+)和少突胶质细胞(NG2+)层粘连蛋白和多聚体分化10天后-我-赖氨酸。的子集福克斯J1EGFP公司细胞在分化培养物(绿色细胞)中持续存在。条形图中的单元格数为每10个5微米2.
FoxJ1表达影响的靶基因鉴定
FoxJ1在出生后SCN分化中的作用自然导致了FoxJ1.如何实现其发育功能的问题。为了确定FoxJ1调节的大脑中的候选基因,我们比较了福克斯J1+/+EGFP公司和福克斯J1-/-表皮生长因子使用激光捕获显微解剖技术研究成年SCN发育期间(P1、P7、P14)前脑的区域()和微阵列转录组分析。该分析显示,198个基因在P1、P7和P14以一致的方式改变了1.5倍以上。我们使用了一个严格的统计标准,仅包括s.e.m.小于或等于三个年龄段表达平均fold-change 0.1的基因(误差<10%)。在已鉴定的基因中,197个在福克斯J1-/-EGFP公司结构域,而只有一个符合上述统计标准的基因在P1、P7和P14处持续上调。
确定在SCN出生后成熟期间由FoxJ1调节的候选基因。(A类)福克斯J1EGFP公司对吻侧前脑的区域进行激光捕获显微解剖,并进行微阵列分析。(B类)野生型和福克斯J1-/-阵列数据鉴定出16个编码微管相关蛋白的基因,这些蛋白在福克斯J1-/-EGFP公司域。(C)P6小鼠免疫沉淀γ-微管蛋白复合物的免疫印迹显示,野生型小鼠与Dnahc、Dnaic和Kif6蛋白存在潜在的相互作用,而在野生型小鼠中,这些复合物不存在福克斯J1-/-大脑。
接下来,我们使用艾伦脑图谱询问哪些已识别的基因具有已知的细胞或分子功能,并在成人大脑的室管膜区表达。该分析将列表缩小到55个具有已知功能和室管膜区表达的基因,所有这些基因在福克斯J1-/-EGFP公司大脑(见补充材料中的表S1)。值得注意的是,在55个已知下调基因中,24个编码细胞骨架相关分子马达和精子/鞭毛相关蛋白(43%的已鉴定基因编码具有已知功能的蛋白)。第16页,共16页这24个基因编码微管相关蛋白,包括6种不同的动力蛋白轴突重链亚型和3种动力蛋白中间链样蛋白(). 此外,运动蛋白驱动蛋白家族(Kif6/9/27)三个成员的基因在福克斯J1-/-SCN公司。名单中还包括一个放射状辐条样基因(Rshl3型),一个编码微管相关蛋白Tekt4的基因,另一个编码小管蛋白酪氨酸连接酶样家族成员6的基因(Ttll6号机组). 为了测试微阵列数据的有效性,通过qRT-PCR在三个来自福克斯J1-/-P1、P7和P14的野生型大脑().
候选基因在室管膜细胞活动纤毛生成中的潜在作用
已鉴定基因的功能分类表明,FoxJ1在驱动小鼠大脑纤毛内运动装置的表达方面起着主要调节作用,如爪蟾和斑马鱼(Yu等人,2008年;Stubbs等人,2008年). 阐明动力蛋白和驱动蛋白运动蛋白的显著下调是否与γ-微管蛋白在细胞浆中的聚集有关福克斯J1-/-我们分析了室管膜细胞在大脑中的表达和生化相互作用。首先,我们发现大多数已鉴定的轴突动力蛋白和驱动蛋白在成年SVZ的室管膜层中表达受限(见图补充材料中的S9)。
接下来,为了确定确定的蛋白质与γ-微管蛋白、P6野生型和福克斯J1-提取空白前脑,免疫沉淀γ-微管蛋白。然后对免疫沉淀蛋白进行蛋白质印迹,以确定Dnahc、Dnaic和Kif6是否与γ-微管蛋白形成复合物。在免疫沉淀的野生型提取物中检测到这三种蛋白,表明它们在室管膜细胞分化高峰时与γ-微管蛋白形成复合物(). 相比之下,所有三种蛋白质的水平在福克斯J1-/-γ-微管蛋白免疫沉淀物质的提取和检测福克斯J1-/-大脑(). 这些发现表明,γ-微管蛋白、轴索动力蛋白和驱动蛋白运动蛋白的特定异构体之间的物理相互作用可能是在运动纤毛发生之前基底体向室管膜细胞心室表面的运输和分布的原因().
FoxJ1在室管膜细胞活动纤毛发生中的细胞自主功能的工作模型。γ-微管蛋白、动力蛋白和驱动蛋白运动蛋白之间的物理相互作用可能调节室管膜细胞顶部(心室)表面上γ-微管蛋白环(基底体)的运输。在缺乏FoxJ1的情况下,这些运动蛋白的表达严重减少,导致γ-微管蛋白环聚集在福克斯J1-/-放射状胶质细胞。
讨论
出生后干细胞壁龛的室管膜成分被认为对OB的神经发生至关重要,但其在神经发生调控中的确切作用仍鲜有研究。我们发现,心室区不同解剖区域的室管膜细胞似乎在出生后心室壁内不同的时间点发生分化。纹状体壁中的室管膜细胞是神经干细胞龛的组成部分,在出生后的时期,与侧脑室内侧壁或背侧壁中的其他室管壁细胞相比,其分化较晚。这一发现表明心室壁内可能存在区域性不同的室管膜亚型;然而,我们发现,在没有FoxJ1表达的情况下,侧脑室内的所有室管膜细胞在出生后时期都无法分化,无论其位置如何。我们还发现了一小部分表达FoxJ1的星形胶质细胞,它们在SCN分化的后期出现,并且它们在出生后SVZ中的细胞组织明确依赖于Fox J1的转录活性。
FoxJ1属于最近注释的一类转录因子,至少有30个家族成员共享一个共同的叉头(Fox)DNA-结合域(Lehmann等人,2003年;加藤和加藤,2004年). FoxJ1在活动纤毛的发育中起着直接作用(Brody等人,2000年;Yu等人,2008年;Stubbs等人,2008年)和活动纤毛是室管膜细胞分化和中枢神经系统功能的重要因素(Spassky等人,2005年;Sawamoto等人,2006年). 我们的分析表明,室管膜细胞中FoxJ1依赖性分化包括大量与活动纤毛相关的细胞骨架蛋白的表达,并表明它们在调节含γ-微管蛋白的基底体向分化室管膜的顶面转运方面的潜在作用。尽管本研究的重点是微管相关蛋白的FoxJ1依赖性表达及其在基底体转运中的潜在作用,但已确定的基因列表包括其他功能家族(见补充材料中的表S1)。这一发现表明,SCN中FoxJ1依赖性分化的功能可能比运动纤毛的发生更广泛。大多数已鉴定基因在SCN分化中的功能尚待阐明。
FoxJ1在室管膜细胞活动纤毛发生中的细胞自主功能
我们证明,在缺乏FoxJ1的情况下,胚胎晚期大脑心室区的放射状胶质细胞无法分化为室管膜细胞。独特的分子特征福克斯J1-空细胞包括γ-微管蛋白在细胞内的积累,这与之前在多毛类中发现的未结合γ-微管蛋白的基底体一致福克斯J1-/-肺上皮细胞(Brody等人,2000年;You等人,2004年). 这些发现表明,多毛上皮和室管膜细胞中多个基底体的生成与FoxJ1活性无关。FoxJ1依赖的基底体对接与Ezrin相关信号传导有关(Gomperts等人,2004年)和Rho介导的肌动蛋白富集(Pan等人,2007年)在气道上皮细胞的顶面。然而,对接前基体运输的机制在很大程度上仍然未知。目前认为,这种转运是通过基底体与小泡的融合介导的(Vladar和Axelrod,2008年),并且在产生活动纤毛的基底体的运输与初级纤毛之间没有区别。我们的发现是原发性纤毛在福克斯J1-/-大脑高度暗示了活动纤毛和初级纤毛形成的基础体运输的不同机制。
γ-微管蛋白在福克斯J1-/-细胞进一步表明,利用参与细胞内转运的蛋白质,复制的基底体可能分布到室管膜细胞的顶面,其表达取决于FoxJ1活性。这种转运的潜在机制的提示来自我们的转录组比较福克斯J1-/-和野生型大脑。在候选基因中福克斯J1-空白大脑中,大量是微管相关蛋白。特别是,运动蛋白的三种亚型(Kif6/9/27)可以预测为负责γ-微管蛋白和轴突蛋白向分化室管膜细胞的顶部(心室)表面的运输。为了支持这种可能性,我们发现Kif6存在于一种包含γ-微管蛋白、Dnahc和Dnaic的复合物中。最后,大多数已鉴定基因在SVZ室管膜层的有限表达高度暗示了FoxJ1在已鉴定基因的表达及其在运动纤毛生成中的潜在功能中起着直接作用。因此,我们认为Kif6,以及潜在的Kif9和Kif27运动蛋白可能负责基底体向分化室管膜细胞表面的转运(). 确定是否有任何囊泡蛋白是这个复合物的一部分将是一件有趣的事情。纤毛发生过程中由FoxJ1-依赖性转录活性驱动的信号和分子事件的序列尚待阐明。
福克斯J1+SCN中的星形胶质细胞
我们还发现了FoxJ1的一小部分+小鼠出生后SCN中P21左右出现的星形胶质细胞,在野生型SVZ中6个月大时密度逐渐增加。P19和P21之间的星形胶质细胞的出现依赖于FoxJ1的表达,因为它们的密度在福克斯J1-/-SVZ公司。最近的研究描述了一组独特的星形胶质细胞在老年室管膜层中的扩张(Luo等人,2006年)这一现象后来被证明与老年小鼠室管膜细胞的修复有关(Luo等人,2008年). 居民FoxJ1的小人口可能+星形胶质细胞可能参与老化室管膜层的修复。为了支持这一点,最近的研究表明福克斯J1椎管和SVZ中的启动子活性细胞参与受损脊髓的神经发生和胶质生成,并对中风做出反应(Meletis等人,2008年;Carlen等人,2009年). 室管膜细胞和一小部分星形胶质细胞共同表达FoxJ1是否是成人SCN固有可塑性的基础,这将是一个有趣的问题。
尽管成年SCN的细胞室特征相当清楚,但成年神经干细胞的身份仍然很难确定。我们的体外研究结果表明福克斯J1EGFP公司从P21 SVZ收获的细胞产生神经球,可以自我更新,并有可能产生星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元,从而在功能上类似于成人神经干细胞。再加上之前的研究表明室管膜细胞不能产生神经球(Doetsch等人,1999年a;Laywell等人,2000年;卡佩拉和坦普尔,2002年),我们的体外实验结果表明FoxJ1的小亚群+SVZ和FoxJ1中的星形胶质细胞+RMS中的祖细胞样细胞可能是我们在神经圈实验中检测到的干细胞特性的来源。因此,FoxJ1+P21和FoxJ1之前的放射状胶质样细胞+P21之后的星形胶质细胞可能在围生期直接参与LGE和SVZ中的祖细胞群体,从而在体内发挥成体干细胞的亚群作用。为了进一步支持这种可能性,我们发现了FoxJ1的一个子集+海马齿状回中的星形胶质细胞,在那里它们也可能作为成人神经干细胞的一个子集发挥作用。尽管最近的一项研究试图追踪FoxJ1+使用病毒载体的细胞(Carlen等人,2009年),需要进行遗传谱系追踪以最终确定是否有任何FoxJ1+我们研究中确定的细胞类型参与出生后早期和成年神经发生。
总之,本研究证明了FoxJ1在中枢神经系统室管膜层分化中的细胞需求。这种独特的分化过程在大脑所有心室区的时间并不一致。与其他心室区相比,沿着心室纹状体壁的室管膜分化延迟,神经发生在心室终生持续。奇怪的是福克斯J1在胚胎发生期间,启动子似乎在LGE和嗅室区的低水平上优先激活,而在胚胎脑的其他神经原生态位中则不激活。本研究中确定的FoxJ1依赖基因簇似乎高度关注基于微管的细胞内转运的调节。我们的研究结果表明,已鉴定基因的表达可能与活动纤毛发生期间复制的基底体向分化室管膜细胞顶面的转运有关。SCN的FoxJ1依赖性分化在出生后神经发生中的作用尚待在体内确定。