The sensory patches of the内耳为研究提供了一个极好的发育系统区域和细胞命运规范（参考文献。1). 在哺乳动物内耳有六个独立的感觉区。第五个这些区域执行前庭功能，而只有一个器官作为听觉传感器。确切地说，这些虽然存在，但感觉区域的具体情况仍基本未知现在有几个已知的基因从很早的时候就标记了这些区域发展(2–4). 感官区域由两个细胞类型：机械感觉毛细胞和支持细胞。这些细胞在上皮内排列成一个有组织的、不变的时尚，使每个毛细胞被支持细胞包围。在科尔蒂器官的模式更为明确，因为细胞进一步排列成组织严密的行。在鼠标中Corti器官有三排外毛细胞和一排内毛细胞。创建感官的拟议机制花叶病是一种侧向抑制，即细胞作为一个整体分化细胞类型（在这种情况下是毛细胞）可以防止周围的细胞从分化为相同的细胞类型，从而产生一个马赛克单元格类型(5,6). 已知Notch信号通路介导其他系统中的侧向抑制（参考文献。7)，以及两者表达式分析和微扰实验支持内耳内这条通路的作用。例如，槽口配体类似德尔塔1(Dll1号机组)和杰格德2(Jag2型)在新生事物中表达毛细胞，而槽口1最初表达贯穿始终毛细胞分化前耳蜗腹壁后来仅限于支持细胞(4,8). 类似地，两个的成员赫斯家庭(赫斯1和赫斯5)，它们是Notch激活的下游效应物，也在支持细胞和非感觉细胞中表达Corti器官周围的类型(9,10). 功能丧失研究涉及Jag2型,赫斯1、和槽口1显示毛细胞数量增加，这是破坏的预期结果侧向抑制机制(8,9,11,12).
然而，其中一种Notch配体的作用，Jagged1型(Jag1型)，仍然有点模糊，因为它没有显示与侧方作用完全一致的表达模式抑制。在鸡和小鼠中，Jag1型标记可能是在发育早期的感觉斑表示在感官区域规范中的作用(2,4). 作为分化在小鼠中进行，Jag1型表达式是然后降级到支持细胞，在那里它与槽口1(4). 根据早期的的表达模式Jag1型它在定义界限，例如指定感觉上皮与非感觉上皮在耳朵里(2)，尽管没有实验证据表明支持这一假设。此外，Notch的表达式调制器疯子边缘(Lfng公司)，是的成员已知参与定义边界的分子家族（参考文献中审查。13)，在类似于的域中Jag1型,进一步支持了Notch信号参与内耳边界形成。
在这里，我们证明了一种老鼠突变体，头特纳(Htu公司),显示壶腹部前后结构缺失或较小那里有感觉嵴。此外，还减少了33%在Corti器官中的外毛细胞的数量上，有趣的是内毛细胞数量和非典型毛细胞的存在。我们证明这一点Jag1型突变基因是导致这些缺陷是通过在Jag1型基因输入Htu公司突变体，通过展示Htu公司纯合子死亡子宫内在类似的时间，因为与其他缺陷类似的缺陷Jag1型功能丧失突变体。
方法
老鼠。
这个Htu公司大规模的突变N个-乙基-N个-亚硝基脲诱变程序德国纽黑堡(14). 这个Htu公司创始人已确定因为轻微的摇头行为。殖民地维持在C3HeB/FeJ背景。胚胎取自定时交配阴道塞的日期被视为第0.5天。科罗博马(厘米)小鼠是从杰克逊实验室获得的C3H/HeSnJ背景。杂合子和野生型厘米老鼠通过P3处是否有虹膜缺损来区分。
映射和序列分析。
Htu公司/+C3HeB/FeJ基因背景的小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，其突变后代为回交到C3HeB/FeJ；回传至C57BL/6J导致表型外显率降低，进行分类困难。共获得155个后代，其中56个可能是分类为Htu公司/+根据他们的表型。只有变种人当使用突变体映射到避免假阴性干扰分析。整个基因组扫描(15)，并且额外的2号染色体标记选择用于进一步基因分型和缩小区域。的ORFJag1型使用八个重叠扩增cDNA引物对（GenBankAF171092型; 引物序列可从作者）。使用Advantage GC cDNA PCR试剂盒（CLONTECH）。扩增子在ABI-377XL正向和反向DNA测序仪。
基因分型。
使用核苷酸位置的正向引物进行PCR1082（5′-GTCACGGCACCTGCAATG-3′）和反向引物（5′-GTGGAAATGGACTGAACCTC-3′）位于内含子169 bp内其前外显子在1154位结束。因为突变创建一个FokI公司酶切PCR产物，以便基因型可以区分：野生型产生单个240-bp波段；杂合子产生三个片段，分别为240bp、190bp、50bp、，纯合子只产生190-bp和50-bp的条带。
油漆填充。
耳朵的油漆填充是以类似的方式进行的用于胚胎鸡(16). 简单地说，老鼠被斩首并在Bodian的固定剂中固定过夜，然后在乙醇中脱水。头部被一分为二，并用水杨酸甲酯清除。内耳使用时通过小腿和/或耳蜗注射拔出的玻璃毛细管吸管（直径20–40μm）1%水杨酸甲酯光泽漆。
扫描电子显微镜。
耳蜗(n个= 6Htu公司/+，5+/+，20岁天；n个=4 Cm/+，2+/+，老化3天）采用所述四氧化锇-硫代碳酰肼法(17).对于毛细胞计数，蒙太奇是从耳蜗，每个耳蜗延伸600至1200μm。由于这些区域，没有在心尖区域进行计数更难保存，并且已知毛细胞的数量变化更多。然而，对这些领域的定性检查表明表型与基底中观察到的相似。
生理学。
老鼠(n个= 5Htu公司/+; 5 +/+; 60至83岁天）用氨基甲酸乙酯麻醉，打开中耳记录电极置于耳蜗圆窗上。A类外耳道内的封闭式声音系统用于传递校准的突发音调（15毫秒持续时间，1毫秒上升/下降时间，100毫秒刺激间隔，平均重复200次）。阈值检测耳蜗神经复合动作电位反应通过2-3-dB的步骤获得。测量耳蜗内电位(n个= 7Htu公司/+，5+/+，年龄60-83天）将微吸管电极插入基底旋转鳞片介质通过耳蜗外侧壁。
血小板内皮细胞粘附分子（PECAM）免疫组织化学。
胚胎和卵黄囊在甲醇/DMSO（4:1）中固定过夜，清洗，然后在4°C下在抗PECAM-1（1:100；PharMingen）。第二天，在孵化前清洗胚胎第二抗体在4°C下过夜，第二天检测。
结果
内耳缺陷Htu公司/+老鼠。
使用N个-乙基-N个-亚硝基脲诱变方法(14)我们发现了一只老鼠变种头像(Htu公司)显示出前庭的主要摇头行为缺陷。年内耳大体结构的研究Htu公司油漆填充杂合子(n个= 47)发现后壶腹缺失，有时前壶腹缺失截断这些各自的半规管（图。 B类和天). 这个两个壶腹都缺失的表型更常见(n个=29）的表型缺席(n个= 14). 当出现前壶腹时很小（图。天). 在少数情况下(n个= 4)后壶腹存在，但非常小。前庭区域（6个对照和八Htu公司/+耳朵）被解剖出来并由扫描电子显微镜。在一个突变耳朵中，前嵴是目前，检查显示，除了体积很小之外（约为对照嵴大小的一半；图。E类),感觉器官的形态也严重异常。这个突变器官比对照组扁平得多，而非感觉组织没有分开嵴（十字嵴）的部分（图。F类).
E16.5处涂满油漆的内耳显示缺失或较小的壶腹Htu公司/+突变体。(A–D)中间视图控制和Htu公司/+耳朵。(B类)两个安瓿都不存在的表型。(天)只有后部缺失的表型。星号B类和天指示壶腹不见了。注意小的前壶腹Htu公司/+突变体（箭头插入天).(E类和F类)扫描电子显微镜对照组的前嵴和P3突变。注意小的，外观平坦，十字嵴缺失（箭头所示E类)在突变体嵴中(F类). aa，前部壶腹；asc，前半规管；cd、耳蜗管；la，横向壶腹；lsc，外侧半规管；pa，后壶腹；psc、，后半规管；呃，胞果。（比例尺英寸B类=500μmA类和B类，英寸天=500μmC类和天中的、和F类=100μm用于E类和F类.)
年Corti器官的研究Htu公司杂合子出生后第20天的扫描电子显微镜显示缺陷在这个感觉区域内。相反，在上皮的许多区域正常的三排外毛细胞中只有两排，在一些地区只有一行（图。). 毛细胞计数野生型和Htu公司/+耳蜗显示与对照组相比，突变体外毛细胞的数量（图。A类). 有趣的是内毛细胞数量略有增加，偶尔朝内沟第二排出现的细胞。我们也观察到“非典型”毛细胞出现束外毛细胞的形态，但位于内毛细胞行（图。C类)导致17%的内排毛细胞（内毛细胞和非典型毛细胞）（图。B类). 尽管科尔蒂，Htu公司/+突变体不是聋子，但有轻微的隆起复合动作电位阈值是耳蜗的一种指示神经反应（图。C类). 这些差异不是重要。两组的耳蜗内电位相同(Htu公司/+平均111.0±2.0 SEM；+/+平均112.7±2.9），表明血管纹功能正常。
Corti器官的扫描电子显微照片Htu公司/+小鼠表现出神经上皮模式这个器官内的缺陷。(A类和B类)从控制组Corti器官的基底旋转的低倍视图(A类)和杂合子(B类)，显示突变体中外毛细胞行（OHC）数量减少。异常内毛细胞（IHC）内的行也可以在B类和C类（更高功率），包括额外内毛细胞（脂肪箭头）和非典型毛细胞（细箭头）。（比例尺英寸B类=5μmA类和B类.比例尺输入C类=5微米）
大脑皮层器官基底部的毛细胞计数Htu公司/+突变体的数量大幅度减少外毛细胞（OHC）的数量和毛发数量的少量增加与控件进行比较时，内行中的单元格。计数因而异每个耳蜗平均约1000μm。(A类)外毛细胞总数减少重要的是，这主要是因为第三排。(B类)内毛细胞总数Htu/+突变体中略有增加（但显著增加）。这个细胞数量的增加是由于第二行（偶尔在控件中出现），而不是包装密度的变化，因为数量没有差异正常（第一）行内毛细胞内的毛细胞。非典型细胞，在对照耳蜗中从未观察到不包括在内毛细胞计数中，发生时间大致相同频率作为额外的内部毛细胞（*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001;学生的双尾t吨测试）。(C类)五个窝友对照的复合动作电位阈值（实线±SEM）和五个突变体（虚线±SEM），老化60-83天，显示阈值略高对于所有频率的突变体，尽管这些差异不是重要的(P（P）> 0.05; 学生的双尾t吨测试）。
映射和序列分析.
Htu公司被映射到老鼠身上一个6.6厘米的区域标记间第2染色体D2密特399和D2Mit280型分别位于60.1至66.7 cM着丝粒。我们考虑了Jag1型基因，也绘制了到该地区(18)，成为Htu公司因为众所周知，它在耳朵的感觉区域表达(2,4).此外，一项对四名患有颞骨肥大症患者的颞骨的研究Alagille综合征，由JAG1号机组(19)，显示这些患者存在半规管缺陷与Htu公司/+老鼠(20). 由于渠道缺陷的特殊组合和类型Htu公司看起来很独特（除了人类报告），我们认为这种相似性很重要。
编码区的序列分析Jag1型在里面Htu公司突变体在位置处显示G→a错义突变1134，导致非保守氨基酸替换天冬氨酸残基中的甘氨酸（图。A类). 我们有几个原因提出这种变化是诱因突变。首先，在与其他物种的序列比较，发现了这种甘氨酸残基在脊椎动物中发现的所有锯齿状/锯齿状分子中都是保守的（图。B类). 其次，氨基酸变化发生在Jag1的胞外结构域，在16种表皮生长中的第二种因子（EGF）样重复序列（图。A类). 这一秒重复，以及第一个，已被证明对与Notch形成高亲和力复合物(21). 此外，第二个EGF样重复序列的错义突变JAG1号机组在Alagille综合征患者中发现(22)、和氨基酸表皮生长因子样重复序列中保守甘氨酸残基的变化之前已经发现Notch及其配体导致几种不同物种的病理学(23–28). 最后，另一个突变体(回转)从单独的N个-乙基-N个-亚硝基脲诱变程序(29)已被确定具有与Htu公司/+突变体，并在Jag1型基因(30).
中的错义突变Jag1型导致Htu公司表型。(A类)的顺序Jag1型a中的基因Htu公司/+鼠标显示G→A突变、预测的蛋白质序列变化及其位置在蛋白质结构示意图中。信号肽（SP）Delta：Serrate:LAG-2（DSL）结构域，模式中的EGF-like重复序列插入序列在一个空白框中的框，富含半胱氨酸显示了区域（CR）和跨膜结构域（TM）。(B类)Jagged/Serrate的氨基酸序列比对来自不同物种的分子，显示了这种守恒性脊椎动物中的甘氨酸残留，尽管此处有精氨酸中的位置果蝇属.
纯合子表型Htu公司突变体。
基因纯合子的小鼠Jag1型德尔塔：塞拉特：LAG-2（DSL）结构域已被移除的基因(Jag1型数字用户线)或纯合子缺失(厘米)小鼠，该小鼠的区域包括Jag1型基因(31)，无法生存超过胚胎期（E）11.5，因为血管重塑缺陷(18). 因此，我们有兴趣确定Htu公司由于类似的缺陷，纯合子正在死亡。14窝Htu公司/+X（X）Htu公司/+交配在E10.5和E11.5之间检查(n个=104个胚胎；23个纯合子）。Htu/Htu（Htu）胚胎通过以下方法鉴定基因分型（参见材料和方法)看起来像是在E11.5附近死亡，与另一个相似Jag1型突变体。令人惊讶的是，在E11.5检查的所有纯合子中大量血液的缺乏或大量减少卵黄囊中的血管和胚胎本身都有出血（图。)，与血管系统。E11.5检测的几乎所有纯合子胚胎发育似乎延迟了一天半。在一些4例患者的心包扩张或神经管扭结纯合子胚胎（数据未显示），也有异常在Notch突变体中检测到(32,33). 整体免疫组化抗体识别内皮细胞表面标记细胞（PECAM-1）证实大血管减少突变体的卵黄囊，并显示在突变体胚胎头部与对照的比较（图。 E类和F类).
纯合子Htu公司突变体因缺陷死亡血管重塑。(左侧)野生型胚胎；(赖特)Htu/Htu（Htu）胚胎。(A类和B类)卵黄囊（仍含胚胎）E11.5显示在纯合子中没有大血管。(C类和天)E11.5胚胎显示在突变胚胎中观察到出血。(E类和F类)E10.5胚胎加工用于抗PECAM免疫组织化学检测胚胎血管缺损。箭头表明头部的一条大血管较厚突变体中的分支较少。[比例尺=1 mm in天（用于A–D)和500μm英寸F类（用于E类和F类).]
由于纯合子表型不同于杂合子表型，这种差异使得互补试验使用执行回转突变体，另一个N个-乙基-N个-亚硝基脲诱导的突变表现出与Htu公司、和显示第二个类EGF重复序列中的不同错义突变预测的Jag1蛋白(30). 24个胚胎E12.5的分析Htu公司/+ ×斯里兰卡/+显示的垃圾所有五个携带这两种突变的胚胎都没有发育完成[通过基因分型确认；参见材料和方法(30)]显示卵黄囊和胚胎中没有血管它们要么坏死（4/5），要么出血（1/5），表示等位性。
疣内耳缺损(厘米/+)老鼠。
我们有兴趣检测已知的功能丧失等位基因Jag1型看看他们是否表现出类似的内耳缺陷显示的内容Htu公司/+突变小鼠。因为Jag1型敲除小鼠的背景为C57BL/6J据报道，缺乏前庭缺陷的行为，我们认为该菌株的耳表型可能发生了改变因为Htu公司/+老鼠也丢了与C57BL/6J菌株回交（参见材料和方法). 因此，我们检查了厘米/+以C3H为背景的小鼠通过油漆填充和扫描显示行为缺陷P3的电子显微镜(n个= 4厘米/+; 2+/+). 这项分析的结果表明，所有四项厘米/+耳道前后截断壶腹附近，而侧管正常各自的壶腹较小或缺失，类似于Htu公司/+突变体（数据未显示）。在厘米/+表型与Htu公司/+耳朵是在两个突变体耳朵有壶腹（虽然很小），但运河仍然被截断。在Htu公司/+耳朵当壶腹运河总是完整的。
科蒂器官的检查厘米/+突变体显示出与Htu公司/+突变体，但也差异。在内毛细胞行中观察到额外的毛细胞在底部和顶部厘米/+突变体，类似于Htu公司/+突变体（图。). 在基底和中间区域厘米/+耳蜗，区域只有两行OHC（类似于Htu公司/+突变体），但这些区域仅偶尔出现并延伸至短距离（5–40μm），当与…相比Htu公司/+突变体（图。 A类和B类). 与…对比Htu公司/+然而，突变体耳蜗最顶端的10–35%厘米/+突变体显示OHC行数增加，显示为4-5行OHC正常三个（图。 C类和天).
Corti器官的扫描电子显微照片厘米/+小鼠表现出一些神经上皮在中观察到的缺陷Htu公司/+耳蜗。A类和B类是来自基本线圈的显微照片耳蜗，以及C类和天是从耳蜗的顶端线圈。内毛细胞的位置（IHC）并且在左侧指示外部毛细胞行的数量。头发在第二个IHC行中观察到的单元格用箭头指示。（比例尺英寸天=20μmA–D.)
因此，内耳缺陷在Htu公司/+和厘米/+突变体进一步证明错义突变Jag1型基因输入Htu公司突变体是使役。有趣的是，耳蜗的差异神经上皮缺损Htu公司/+和厘米/+表明错义突变的影响可能在某些领域比简单的单倍体不足更复杂（参见讨论).
讨论
我们的研究结果表明Jag1型发挥了重要作用在几个感官的规范和/或维护中内耳器官，包括前嵴和后嵴和Corti的器官，与它在这些组织中的早期表达一致感觉区域。整个壶腹是否由Jag1型或者它的缺失是由于克里斯塔还有待确定。然而，因为Jag1型是主要表达于嵴而非壶腹(4)，间接可能在壶腹发育中起作用。它也是不清楚为什么前嵴和后嵴最严重受影响的感觉器官Jag1型已知表达在所有的感觉区域，但可能这些感觉器官对功能性Jag1级别最敏感。
总的来说Htu公司突变体与其他假定的功能丧失Jag1等位基因(Jag1型数字用户线和厘米突变体）提示在Htu公司突变体。例如，纯合子表型为与两者相似Jag1型数字用户线和厘米纯合子突变体，半规管表型为类似于抄送/+突变体和只有两行OHC和内行额外的毛细胞类似于在基础和中间转弯处观察到的表型厘米/+耳蜗。的确，因为第二个类EGF重复研究表明，Jag1对具有高亲和力的复合物很重要Notch受体(21)，该蛋白质区域的突变可能破坏配体/受体结合的稳定性。然而，事实上年Corti器官基底和中间弯的表型厘米/+就OHC数量而言，突变体要比Corti器官Htu/+器官的表型表明Htu公司突变可能在这方面引起显性负效应上下文。为了支持这种可能性另一种Notch配体斑马鱼的第二个类EGF结构域增量A也有报道称其行为呈显性-负面方式(34,35).
在厘米/+变异耳蜗很有趣，因为在Htu公司/+变异耳蜗。有趣的是，有报道称使用反义寡核苷酸Jag1型培养物中的mRNA导致内外毛的增加Corti器官中的细胞行(12). 一种可能性是Jag1可能有两个角色：早期角色，其中Jag1指定或维护感觉器官，以及后来的感觉器官，在其中它在侧面发挥作用抑制[可能通过增加支持单元格(36)]. 的确，它在耳朵里的表达模式暗示了两种角色的可能性，因为它从表达在整个感觉区域的早期发育到毛细胞分化过程中的支持细胞(2,4). 在反义实验Jag1型水平只是在分化前后减少（E18-P0大鼠），因此可能仅影响Jag1在横向抑制。同样，在发育早期耳蜗可能对Jag1水平的变化不太敏感，因此可能只有第二个Jag1角色在较温和的厘米/+等位基因。Jag1的双重角色也可以解释为什么我们观察到内部毛细胞数量增加毛细胞行Htu公司/+和厘米/+突变体，如这种增加也可能反映出对以后的功能的干扰Jag1。或者，Corti表型的器官可以用未能保持内侧和外侧的边界，导致毛细胞区域扩张的未知原因在一个边界（内侧）和一个减少（有时是增加）。A类先前的研究已经表明，这两个边界可能是以不同的方式控制：双重淘汰Jag2/Lfng型抑制了Jag2型击倒内毛细胞行而非外毛细胞行的扩张毛细胞排(11). 然而，重要的是要记住表型厘米/+内耳可能会因以下原因而变得复杂另一个或多个基因的缺失，如至少一个已知的其他基因已在中删除厘米突变(快照25)表示为在耳朵里(37). 此外厘米和Htu公司突变体略有不同这种差异可能导致观察到的一些差异在两种表型之间。因此，比较这个Htu公司/+突变体Jag1型数字用户线/+类似基因的突变体背景。
我们的结果为Notch信号的作用提供了实验证据在内耳中除了其已知的调节外侧抑制。基于Htu公司/+和厘米/+突变体，已知的表达模式Jag1型(2,4)以及已知在边界中很重要的分子(Lfng公司) (三)，我们表明Notch信号可能在创建或内耳感觉/非感觉边界的维持。
