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美国国家科学院院刊。2001年3月27日；98(7): 3762–3767.
数字对象标识：10.1073/pnas.071057198
预防性维修识别码：PMC31126型
PMID：11274393

RAC是酵母中一种稳定的核糖体相关复合物，由DnaK-DnaJ同源物Ssz1p和zuotin

马蒂亚斯·高奇,* 豪克·莉莉,† 乌苏拉·范菲林（Ursula Fünfschilling）,* 安德烈·蒙,* 苏珊·罗斯,* 特雷弗·利思戈,‡ 彼得·吕克纳格尔,*和萨宾·罗斯伯特*§
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

酵母胞浆含有DnaK和DnaJ的多种同源物陪护家庭。我们目前对哪些同源物的理解功能交互是不完整的。Zuotin是DnaJ同源物，与酵母核糖体。我们现在已经鉴定出DnaK同源物Ssz1p/Pdr13p作为佐廷的伴侣伴侣。Zuotin和Ssz1p形成一个核糖体相关复合物（RAC），通过左肽亚基。RAC在真核生物DnaK-DnaJ系统中是独一无二的，因为1:1的复合物即使在ATP或ADP存在下也是稳定的。体外，RAC刺激核糖体结合的线粒体前体蛋白进入线粒体，为其对新生链的伴侣效应提供证据。在同意功能复合体的存在，删除每个RAC亚单位导致类似表型体内。然而，zoutin的过度表达部分挽救了Δssz1型菌株，而Ssz1p的过度表达不影响Δ左1应变，表明关键DnaJ同系物的功能。

蛋白质合成于细胞溶质核糖体折叠或移位到其最终位置共同翻译或翻译后。移位和折叠需要经常服务于多种和重叠功能。真核生物中的复杂伴侣网络目前对细胞的了解还不够(1——三)。

大多数翻译后易位事件都需要易位待展开的蛋白质。这一要求至少在一定程度上由胞质伴侣与新翻译的蛋白质的结合。酵母DnaK/Hsp70同源物Ssa1/2p及其伙伴蛋白DnaJ同源物Ydj1p参与多种隔间(4). 除了在易位中的作用外，Ssa1/2p和Ydj1p参与细胞溶质蛋白折叠，很可能在翻译后方式(5——7). 其他陪同人员协助真核细胞溶质中的翻译后折叠是伴侣蛋白CCT和Hsp90(2,8,9)。

一些伴侣与多肽协同翻译相互作用。在两者中真核生物和原核生物、可溶性DnaK和DnaJ同源物与新生链，随后协助其折叠(2,10,11). 这个核糖体结合的DnaK同源物Ssb1/2p可以交联到新生的链，为功能重要的交互提供证据(12)。

有长期以来共同翻译的间接证据导入线粒体(13). 最近的数据表明前体蛋白甚至需要一种共翻译机制导入线粒体(14——16). 然而，没有专门的组件线粒体共翻译易位系统，与信号识别粒子或信号识别粒子受体，已确定(17)。

在之前的研究中，我们引入了在体外线粒体蛋白质导入法鉴定细胞溶质成分参与共翻译易位或与新生的前体蛋白以类似伴侣的方式存在。分析，基于核糖体结合的新生链的易位线粒体，导致了新生细胞的鉴定多肽相关复合物（NAC）作为一种刺激因子线粒体蛋白输入在体外(18). NAC还被发现影响人工前体蛋白的传递线粒体体内(19)并参与导入内质网(20,21). 然而，编码基因的缺失酵母中的NAC不会显著影响生长，这表明功能冗余(19,22). 确定可以我们利用携带中断EGD1型和EGD2型对两个NAC进行编码亚单位（ΔNAC）。我们现在已经从这个菌株中纯化了一个刺激易位的核糖体相关复合体（称为RAC）进入线粒体在体外复合物是异二聚体由DnaJ同源物zuotin和DnaK同源物组成Ssz1p/Pdr13p，基本上都是定量参与复杂结构中的伴侣。单个亚单位具有以前被他人描述过；然而，它们之间的稳定相互作用尚未检测到(23——26). 我们的体内数据表明RAC的两个亚单位重叠但不相同功能和服务于细胞中的多个角色。

材料和方法

酵母菌株和质粒。

使用标准酵母遗传技术(27). MH272–3f型a/α(尿酸3/尿酸3,吕2/吕2,他的3/他的3,trp1型/trp1型,ade2/阿德2),本研究中所有衍生物的亲本野生型菌株是ade公司−JK9–3d a/α的变体(19,28). 16岁MATa公司(尿酸3,吕2,他的3,trp1型,ade2,表皮生长因子2∷ADE2型,表皮生长因子1∷URA3公司)，缺乏αNAC(EGD2型)和βNAC(EGD1型)亚单位，用于RAC.YRG16的提纯来自YRLG3(尿酸3,吕2,his3型,trp1型,ade2,表皮生长因子2∷ADE2型) (19)通过删除EGD1型基因（R.George和T.L.，未发表的观察结果）。国际开发协会1(马塔，乌拉3,吕2,他的3,trp1型,ade2,左1∷TRP1号机组)和IDA2(马塔，乌拉3,吕2,他的3,trp1型,ade2,ssz1型∷LEU2级,和IDA12(MATα，乌拉3,吕2,他的3,trp1型,ade2,左1∷TRP1 ssz1号机组∷LEU2级)是由二倍体菌株中相应基因的断裂产生MH272-3f a/α，然后进行四分体分析。左一（YRG285C）通过替换1.2kb PinAI/PshAI片段而被破坏编码区域的TRP1、SSZ1（YHR064C）中断通过更换1.2 kbBgl公司二/Hin公司dIII片段编码区域的LEU2级.对于酵母中的过度表达，SSZ1型克隆到pRS423（2μ，HIS3型) (29)和左一被克隆到YEplac195（2μ，URA3公司) (30),导致质粒2μ-左一和2μ-SSZ1型分别是。质粒转化为IDA12，产生菌株IDA12–2μ-SSZ1型(材料α，尿苷3,吕2,他的3,trp1型,ade2,左1∷TRP1号机组ssz1型∷亮氨酸2, 2μ-SSZ1型)和IDA12–2μ-左一(材料α，尿苷3,吕2,他的3,trp1型,ade2,左1∷TRP1 ssz1号机组∷LEU2级,2μ-左1)，并转化为MH272–3fα，导致重量-2μ-SSZ1型(材料α，尿苷3,吕2,他的3,trp1型,ade2,2μ-SSZ1型)和wt-2μ-左一(材料α，尿苷3,吕2,他的3,trp1型,ade2, 2μ-左一)。

RAC的纯化。

按说明制备的细胞质溶胶(18)YRG16的10升培养基中在1 vol缓冲液S1（25%蔗糖/20 mM）顶部分层Hepes·KOH，pH 7.4/120 mM醋酸钾，pH 7.4/5 mM醋酸镁/2mM DTT/0.5 mM PMSF）并在160000×克.核糖体颗粒悬浮在缓冲液S1中后将含有0.72M卡切特的悬浮液离心1小时200000×克.无核糖体上清液，称为核糖体盐水，用6 vol缺少的缓冲液S1稀释蔗糖、醋酸钾和DTT，并加载到ResourceQ阴离子交换上专栏（Amersham Pharmacia）。结合蛋白用100-800洗脱mM 30-ml线性醋酸钾梯度溶于40 mM Hepes●KOH中，pH 7.4。赛车类游戏以500–600 mM醋酸钾的浓度洗脱。包含RAC将部分混合，集中在Centricon-30设备中（Sartorius）最终体积为2 ml，并装入高负荷16/60 Supedex200预平衡的制备级凝胶过滤柱（Amersham Pharmacia）含40 mM Hepes●KOH、300 mM Kaceate，pH 7.4。包含RAC收集馏分并应用于MonoQ阴离子交换柱（Amersham Pharmacia）。结合蛋白用300-1200 mM洗脱在40 mM Hepes●KOH（pH 7.4）中加入25 ml线性醋酸钾梯度。赛车类游戏在800–900 mM醋酸钾溶液中洗脱。合并含有RAC的馏分，用20 mM Hepes●KOH、120 mM醋酸钾和5 mM醋酸镁清洗（pH 7.4），使用Centricon-30设备，浓缩，冷冻液氮，储存于−80°C。10升培养液的产量为≈0.3 mg RAC。

抗体的产生。

针对纯化的αNAC、βNAC、Ssz1p、，zoutin和Rpl16a。Eurogentec对兔子进行免疫（布鲁塞尔）。每个抗体总共识别一个特定的带酵母提取物（见图。​图44和​和55和数据未显示）。特别地，αSsz1p不识别zootin，反之亦然。

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RAC与核糖体的结合。(A类)的主要部分RAC以盐敏感性的方式与核糖体结合。翻译竞争性胞浆（C）被分离成一个后核糖体上清液（S）和核糖体颗粒（P）120 mM醋酸钾（低盐）或700 mM醋酸钠（高盐）。(B类)RAC通过高浓度的盐。核糖体释放内源性RAC后（高盐P），核糖体颗粒在低盐下重新悬浮条件下，将纯化的RAC添加到最终浓度150nM（高盐P+RAC）。在冰上孵育5分钟后，核糖体（P2）与上清液（S2）进行第二次分离。作为对照组，RAC同样处理，但不含核糖体（RAC）。(C类)RAC与核糖体的结合需要zootin。MH272–3f（野生型）、IDA12–2μ-SSZ1和将IDA12–2μ-ZUO1分离到核糖体后上清液中含有120 mM醋酸钾（低盐）或700的核糖体颗粒mM醋酸钾（高盐）。请注意，Ssz1p和zootin都会部分降解在没有伴侣蛋白的情况下进行提取物制备。(A–C)相应数量的胞浆、上清液、，用SDS/PAGE分离核糖体颗粒，并用免疫修饰，使用特异识别抗体Ssz1p、左旋肽、Rpl16a、己糖激酶（己糖）、Ssa1/2p、Ssb1/2p和αNAC。

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中的删除SSZ1型和左一显示相似但不相同的表型。酵母菌株IDA1(Δ左)，IDA2（Δssz1型)，IDA12(Δ左1Δssz1型)，野生型（MH272–3fα），wt-2μ-SSZ1（MH272-3fα过度表达SSZ1型)，wt-2μ-ZUO1（MH272–3fα过度表达左一)，IDA12–2μ-SSZ1（IDA12过度表达SSZ1型)和IDA12–2μ-ZUO1（IDA12过度表达左一)在30°C条件下生长到早期测井阶段葡萄糖培养基。(A类)等量的总酵母蛋白在SDS/PAGE上分离，然后用针对Ssz1p、zuotin和的抗体，作为等量加载苹果酸脱氢酶（mMDH）。(B类)早期对数期培养物的连续5倍稀释液。含有相同数量细胞的稀释液从顶部到底部放在富含葡萄糖的培养基上（YPD，酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖）。孵育时间和温度给出了。RT，室温；d、 天；帕罗，75μg/ml巴龙霉素。

体外试验核糖体的翻译、制备链复合物（RNC）和转运分析。

酵母翻译提取物按规定制备(31)来自任一方JK9-3dα(28)或YRG16。酵母线粒体苹果酸的翻译脱氢酶（Mdh1p）按所述进行(18). 线粒体从生长在基于乳酸的培养基上的JK9–3dα和按说明净化(32). 含有0.8的易位反应mg/ml进口缓冲液中的线粒体（20mM Hepes·KOH，pH7.4/120 mM醋酸钾，pH 7.4/5 mM醋酸镁/0.6 M山梨醇/0.05单位/μl核糖核酸酶抑制剂/2 mM DTT/2 mM ATP/2 mM NADH/2 mMKP公司我). 线粒体与进口预混缓冲液，通过添加12.5%开始反应20°C时RNC的（vol/vol）。化验量从100到500微升。12分钟后取出100μl样品通过离心分离线粒体。上清液重新分离含有该组分的线粒体后获得未与线粒体结合的RNC（数据未显示）。什么时候？添加1μg/ml会破坏膜电位缬氨霉素在对照反应中，易位被废除（数据没有如图所示）。换位效率的变化系数为2，取决于RNC准备。然而，相对易位效率在实验中具有很高的重现性。

免疫沉淀分析。

用蛋白A-琼脂糖珠进行免疫沉淀（CL-4B；Amersham Pharmacia）涂有抗Ssz1p或zootin的IgG或免疫前IgG如前所述(33)20 mM Hepes-KOH，240 mM醋酸钾、5 mM醋酸镁、200 mM蔗糖、1 mM乙二胺四乙酸二钠、1 mMPMSF、0.1%Triton X-100，pH 7.4。

核糖体结合试验。

在典型实验中，60μl酵母胞浆用1:2稀释低盐稀释缓冲液（20 mM Hepes●KOH/120 mM醋酸钾/2 mM DTT/5 mM醋酸镁/1 mM PMSF，pH 7.4）或高盐稀释缓冲液（20 mM Hepes●KOH/1.4 M醋酸钠/2 mM DTT/5mM醋酸镁/1 mM PMSF，pH 7.4）。去除等分（总量）后，将40μl样品分层在100μl低盐上蔗糖垫（20 mM Hepes●KOH/25%蔗糖/120 mM醋酸钾/2 mM DTT/5 mM醋酸镁/1 mM PMSF，pH 7.4）或100μl高盐蔗糖垫（20 mM Hepes●KOH，7.4/25%蔗糖/700 mM醋酸钾/2 mM DTT/5 mM醋酸镁/1 mM PMSF，pH7.4）。200000×离心后克在RC M120中GX超级离心机（Sorvall）在4°C下离心180分钟，样品分为上清液和颗粒，相应数量为SDS/PAGE分析，然后进行免疫印迹。

分析超速离心。

在80–200μg/ml的初始蛋白质浓度下分析RAC在20 mM Hepes KOH（pH 7.4）、120 mM醋酸钾、5 mM醋酸镁中Beckman Optima XL-a离心机和50Ti转子。沉淀进行了平衡测量（在230和280nm处的吸收）在10000 rpm和20°C的双扇形电池中。对数据进行了分析使用Beckman Instruments（加利福尼亚州帕洛阿尔托）提供的软件。

其他。

用该方法制备用于免疫印迹分析的总酵母蛋白Yaffe和Schatz的(34). 蛋白质浓度由Bradford试验（Bio-Rad），以BSA为标准。125I标记蛋白A用于开发免疫印迹(35). 量化125我和35S分别位于免疫印迹或SDS凝胶上是用Aida ImageAnalyzer（Raytest，Istopenmessgeräte GmbH，德国斯特劳本哈特）。识别转移到聚亚乙烯基后，通过测序对Ssz1p和zoutin进行测序氟化物膜。2.4 M醋酸钾（pH 7.4）的储备溶液根据亨德森-哈塞尔巴赫方程。

结果

RAC的标识。

当充满能量的线粒体与线粒体苹果酸脱氢酶（Mdh1p）附着在核糖体上一条新生链，前体的N末端到达基质其预序列被切断。然而，由于Mdh1p无法离开RNC，易位未完成，双膜跨越生成中间产物。新生Mdh1p的转移取决于核糖体相关蛋白，可通过高盐的浓度。主要易位刺激因子绑定到野生型RNC的是NAC(18). 与准备的RNC相比从野生型酵母中，ΔNAC RNCs的转运效率为减少；然而，转位效率可能会进一步降低高盐处理（数据未显示）。

我们使用易位分析作为功能测试来纯化来自ΔNAC菌株的核糖体相关刺激因子。作为考马斯染色判断，两种蛋白质60kDa和55kDa的分子量分别构成了超过90%的活性制剂（图。​（图11A类). 更高的频段分子量被鉴定为DnaK同源物Pdr13p(24)（称为Ssz1p），并且较低分子质量的谱带为鉴定为DnaJ同源物zuotin(23,25,36). 两者之间的比率Ssz1p和zootin在纯化过程中是恒定的，这表明两种蛋白质形成了核糖体相关复合物。RAC没有核糖体结合的DnaK同源物Ssb1/2p（图。​（图11B类)。

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RAC的纯化(A类)酵母RAC纯化为中描述的材料和方法.纯化SDS/PAGE监测，考马斯蓝染色。车道代表通过700 mM处理从核糖体释放的蛋白质醋酸钾（盐洗）；分离后的活性组分池ResourceQ（ResourceQ）上的盐洗；活动的池在Superdex200（Superdex200）上分离后的分数；还有游泳池在MonoQ（MonoQ）上分离后的活性部分。分子的质量标准显示在左侧。(B类)纯化的RAC不含Ssb1/2p。所示样品的等分试样A类用抗体进行免疫印迹分析针对Ssz1p、zoutin和Ssb1/2p。

RAC刺激高盐洗涤RNCs向线粒体的易位以浓度相关的方式（图。​（图22A类). The concentration of标准易位分析中的核糖体≈100 nM，as用纯化核糖体定量免疫印迹法测定蛋白质Rpl16a作为标准。尽管此估计可能会因因子2-5，表明RAC刺激达到稳定当RAC与核糖体的比值≈1:1时（图。​（图22A类和数据未显示）。

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RAC刺激RNC向线粒体移位。核糖体结合Mdh1p是在以下情况下生成的[35S] 蛋氨酸源自ΔNAC菌株YRG16的酵母翻译提取物。RNC（注册护士）在高盐条件下分离得到，具有刺激因子移位被移除，然后用分离的线粒体。反应后线粒体被重新分离，相等含有线粒体结合RNC的小份线粒体颗粒，再悬浮，用三氯乙酸沉淀，并进行分析SDS/PAGE，然后进行荧光成像。STD 10%，RNC的10%每次分析添加。p、 Mdh1p前体；m、 成熟的Mdh1p。(A类)纯化的RAC刺激剂量依赖性方式。预培养高盐度洗涤的ΔNAC-RNC在没有（−）或存在纯化RAC的情况下RAC的浓度作为分析中的最终浓度。换位效率以总量的百分比表示添加到分析中的RNC数量(下部). (B类)RAC和NAC协同刺激易位。易位按中所述进行测定A类，除了在没有（−）或在存在纯化的RAC（RAC），RAC和NAC的组合（RAC+NAC）或NAC（NAC）。易位分析中的最终浓度RAC和NAC分别为100 nM和40 nM。

RAC和NAC的比较表明，这两种蛋白质有效在相似条件下，高盐度RNC的刺激易位浓度（图。​（图22B类和数据未显示）。在实验如图所示。​图22B类，易位效率在RAC或NAC单独存在的情况下约占20%。增加的RAC或NAC的浓度没有进一步增加易位效率（数据未显示）。然而，当这两个复合物结合，转运效率提高到38%，表明这两种复合物在与新生的链，但实际上是协同作用的（图。​（图22B类)。

Ssz1p与佐丁的复合物是一种稳定的异二聚体。

Ssz1p或zuotin免疫沉淀RAC特异性IgG从盐洗释放的蛋白质混合物中有效核糖体。两个亚单位的免疫共沉淀不受添加2 mM ATP或ADP（图。​（图3三A类). 综合体的稳定性在存在腺嘌呤核苷酸的情况下，强烈表明左旋肽不会以类似子表的方式绑定到Ssz1p。DnaK同系物核糖体盐洗液中的Ssa1/2p和Ssb1/2p残留未与分别针对Ssz1p或zuotin的IgG结合（图。​（图3三A类). 小球中回收的少量Ssa1/2p在免疫前对照组中也检测到，表明Ssa1/2p未经特别说明就绑在珠子上（图。​（图3三A类，PI）。

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RAC是一种稳定的异二聚体。(A类)RAC在存在腺嘌呤核苷酸。核糖体释放的蛋白质在2mM ATP（ATP）或2 mM ADP（ADP）或在缺乏核苷酸（−）的情况下具有针对zuotin（αzuotin）或Ssz1p（αSsz1p）或免疫前血清（PI）。在以下温度下孵育3小时后4°C，结合蛋白在颗粒（P）中被回收，未结合蛋白上清液（S）中的蛋白质和两个组分通过以下方法进行分析SDS/PAGE和用Ssa1/2p特异性抗体进行免疫印迹，如图所示，Ssz1p、zoutin或Ssb1/2p。核糖体总量左侧（T）显示了添加到每个反应中的盐洗。(B类)RAC的分子质量测定由在10000rpm和20°C条件下的沉积平衡测量分析超离心机。实验数据可以拟合到表观质量为126kDa的均匀粒子群。(上部)实验数据和拟合（−）。(下部)拟合和实验数据的偏差。

复合物中Ssz1p和左旋替丁之间的化学计量比为通过分析超速离心测定。预测的分子左肽和Ssz1p的质量分别为49kDa和62kDa。在在平衡状态下，RAC表现为均匀粒子群126000 Da的分子质量（图。​（图3三B类). 无高级低聚物或在沉降速度实验中检测到骨料（数据未显示）。结果与浓度范围无关0.7至1.8μM RAC，与稳定的异二聚体复合物。

左肽将Ssz1p锚定于胞质核糖体。

测定Ssz1p与佐丁的络合分数并进行分析与胞质核糖体相关的蛋白质分布，酵母胞浆被分离成核糖体后上清液和低或高浓度盐存在下的核糖体颗粒。核心核糖体蛋白与盐浓度无关Rpl16a在颗粒中被回收，己糖激酶是一种细胞溶质标记物，在上清液中回收。Ssa1/2p的分布，Ssb1/2p和NAC在高盐和低盐条件下是一致的已发布数据(12,19,22,37)（图。​（图44A类). RAC几乎在低浓度的盐。在高浓度盐下，RAC从核糖体并在上清液中回收（图。​（图4）。4). 发布时间为可逆：当高盐洗核糖体与低盐浓度下纯化的RAC和核糖体随后再分离，RAC在核糖体颗粒中被回收（图。​（图44B类). 在对照反应中，RAC在没有核糖体的上清液。我们的结论是RAC与核糖体结合并能有效地重新结合高盐洗涤的核糖体。

含有Ssz1p或zootin，但不含其他亚单位的细胞质，由缺乏Ssz1p或zootin的酵母菌株制备而成。在缺乏Ssz1p，左旋肽的主要部分在核糖体颗粒和高盐处理导致其释放到上清液（图。​（图44C类，IDA12–2μ-ZUO1）。如果没有然而，zootin在核糖体后上清液中被回收即使在低盐条件下（图。​（图44C类，IDA12–2μ-SSZ1）。数据组合表明Ssz1p与核糖体需要它的伴侣蛋白zoutin。

删除Ssz1p或Zuotin导致类似但不相同的表型。

我们生成了其中一个的单个删除左一（IDA1）或SSZ1型（IDA2），双重删除左一和SSZ1型（IDA12）和过度表达单个或两个亚单位。免疫印迹证实了预测的不同菌株中Ssz1p和zootin的水平；的级别与野生型相比，IDA2中的左奥汀显著降低，这表明在没有Ssz1p的情况下zoutin是不稳定的（图。​（图55A类和数据未显示）。（对于单缺失菌株的特征也与参考文献进行了比较。23和24.)

IDA1、IDA2和IDA12增长缓慢天和3天）、感冒敏感性和过敏性蛋白合成抑制剂巴龙霉素（图。​（图55B类)。这种生长缺陷的组合与核糖体结合因子被认为有助于新生链的通过通过核糖体通道进入胞浆(23,38)。

IDA1、IDA2和IDA12的表型相似性与由Ssz1p和zuotin形成的单一功能复合物。然而，zoutin的过度表达部分缓解了生长缓慢、寒冷敏感性、，和对IDA12的巴莫霉素超敏反应，而对IDA12的过度表达Ssz1p没有（图。​（图55B类). 数据表明删除左一对新的合成蛋白质比缺失SSZ1型还有那个左一是Δ的多拷贝抑制器ssz1型（同时比较讨论)。

讨论

Ssz1p和Zuotin之间的物理相互作用。

左肽以前被发现是一种核糖体相关蛋白(23),有人建议将一部分Ssz1p与核糖体结合最近(26,39). 这里我们通过各种方法展示了酵母胞浆中包含的所有Ssz1p和zootin形成稳定的，核糖体相关复合物，是溶液中的异二聚体。

DnaK和DnaJ同系物相互作用已被证实其他(40,41). 然而DnaK的N末端ATP酶结构域和保守的J结构域是高度瞬态。最近的研究结果表明，之前报告的DnaJ和DnaK之间的稳定相互作用可能是由于DnaJ与DnaK的底物样结合(42——44). 稳定的复合体因此，在Ssz1p和zoutin之间是不寻常的，但并非没有优先权。嗜热菌DnaK和DnaJ形成稳定的3:3复合体含有8-kDa蛋白Daf的另外三个亚单位(45)。

我们只能推测哪些域介导稳定Ssz1p和佐丁之间的相互作用。The transient interaction of the具有J结构域的DnaK同源物的ATP酶结构域可能在此中稳定特殊情况。然而，这种稳定性意味着RAC和其他DnaK-DnaJ合作伙伴之间的机械差异(40)。我们认为这种可能性不大可能，并支持Ssz1p模型和zuotin通过尚未表征的结构域稳定地相互作用，促进Ssz1p-ATP酶的瞬时功能相互作用和zootin J结构域存在于底物蛋白中。在这个背景zootin的一个缺失突变体令人感兴趣。在这个突变体中N末端，直至J结构域，产生非功能蛋白仍然能够与核糖体结合(23). 此N端子与任何其他已知J蛋白没有同源性的片段是绑定到Ssz1p的良好候选域。

两个核糖体结合的DnaK系统参与细胞溶胶翻译。

酵母的发现表明RAC在翻译中的作用缺乏功能性RAC的菌株对巴龙霉素和G418等非抑制性氨基糖苷类药物（图。​（图55B类和数据未显示）。同样的表型有以前曾报道过核糖体结合的DnaK同源物Ssb1/2p，这与翻译有关(23,38). 虽然DnaK同源Ssb1/2p和Ssz1p在蛋白质早期的作用生物成因，它们在许多机械重要性方面有所不同性质：Ssz1p是异二聚体复合物的一个亚单位，而Ssb1/2p不是。RAC（Ssz1p和zuotin）几乎与核糖体结合定量，而只有一小部分Ssb1/2p与核糖体。Ssz1p和核糖体之间的化学计量约为1:1（未显示数据），而Ssb1/2p的稳态水平为2-至比核糖体高4倍。Ssz1p与核糖体结合独立于新生链，而Ssb1/2p结合更稳定翻译核糖体。最后，Ssz1p仅与核糖体结合在佐丁的存在下，而Ssb1/2p与核糖体结合直接（比较结果本研究和参考文献。12,25、和38). 最有趣的是了解两个核糖体结合的DnaK系统具有重叠的功能，act在新生链上顺序排列，或在其基底上不同特异性。

这个在体内Ssz1p和Zuotin的功能相似但不完全相同。

虽然IDA1、IDA2和IDA12菌株的表型为相似的是，它们的差异对左旋肽的功能有影响和Ssz1p：(我)zootin是一种多拷贝抑制剂Δssz1型，而过度表达SSZ1型不会拯救Δ左1表型；(ii（ii）)的zootin的稳态水平在Δssz1型张力，表明左旋肽在其伴侣蛋白的缺失。两种不同的模型可能会说明对于这种结果组合。在第一个模型中，观察到表型主要由左旋肽缺乏引起。Δssz1型导致相同的表型，因为作为结果zootin稳态水平降低。根据这个模型zuotin可能在没有其伴侣蛋白的情况下具有功能。这个假设与结果一致，表明DnaJ同源物不仅作为DnaK的同系物，但也与基底相互作用蛋白质本身(10,46——50). 在第二个模型中，函数Ssz1p的部分可被一个（或多个）DnaK同系物取代，而zoutin的功能是非冗余的。在没有Ssz1p的情况下，zoutin的过度表达将导致蛋白质，因此允许结合一个尚未识别的与核糖体同源的DnaK。在这个模型中，zootin服务于功能是将其伴侣招募到核糖体并启动核糖体与天然基质的相互作用(40,44)。

RAC也有靶向线粒体的功能吗？

我们最初鉴定RAC是为了寻找细胞溶质刺激蛋白质转运到线粒体的成分分享刺激线粒体蛋白质移位的能力与NAC(18). 虽然我们的在体外数据表明RAC和NAC参与共翻译蛋白转位线粒体，相应的敲除菌株没有表现出典型的线粒体特异性缺陷：(我)在没有RAC的情况下酵母没有失去呼吸能力（数据未显示）；此外，我们无法检测到累积的线粒体稳定状态下细胞溶质中的前体蛋白（数据未显示）。(ii（ii）)四链缺失菌株Δ表皮生长因子1/Δ表皮生长因子2/Δssz1型/Δ左1，缺乏NAC和RAC-，表现出不比Δssz1型/Δ左1双重删除应变。(三)RAC的稳态水平不是ΔNAC应变增加（数据未显示）。这个在里面体外因此，易位分析可能无法明确识别参与线粒体共翻译易位的成分。然而，数据组合仍然与函数兼容线粒体易位中的RAC。共同翻译涉及的因素蛋白质移位到线粒体可能是高度冗余的，例如即使没有NAC和RAC，功能替换可能。在这种情况下，有趣的是ΔNAC核糖体除RAC刺激高盐度RNC的易位（数据不如图所示）。或者，线粒体前体蛋白易位通过共同翻译途径可能会转换为翻译后在缺乏RAC和/或NAC的情况下发生易位。A可比存在易位到酵母内质的情况网状物。缺乏功能性信号识别颗粒的酵母可行；蛋白质转位到内质网这些条件必须在翻译后发生(51)。

是否涉及RAC、NAC和潜在的其他细胞溶质蛋白线粒体的共翻译易位尚未被证实已确定。无论结果如何，易位分析用于这项研究为鉴定提供了一个有用而可靠的工具核糖体结合蛋白对伴侣类新生链的影响方式。

致谢

Ssb1/2p抗体是伊丽莎白·克雷格赠送的礼物（威斯康星大学）。菌株MH272–3f和JK9–3d来自Mike Hall（巴塞尔大学）。我们感谢丽贝卡·乔治的批评对原稿的评论以及对酵母菌株YRG16和Rudi Glockshuber为M.G.提供了工作机会实验室。在项目的所有阶段，最有帮助的是与Yves Dubaquié的讨论。这项研究是由瑞士国家科学基金会和化学工业基金会（致S.R.）。

缩写

NAC公司新生多肽相关复合物
赛车类游戏由Ssz1p和zootin组成的核糖体相关复合物
RNC公司核糖体上升链复合物
Mdh1p公司线粒体苹果酸脱氢酶

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院