在成年小鼠中前瞻性分离一种双潜能克隆原性肝祖细胞

通过体外集落形成评估祖细胞活性

为了调查肝细胞亚群中是否存在祖细胞，开发了体外培养分析。为了限制成熟细胞类型（如肝细胞）的生长，并促进研究促进祖细胞生长/存活的个别因素，使用了完全定义的无血清条件。当CD45⁻/11亿⁻/31⁻/MIC1-C3型⁺/26⁻在该试验中培养了来自正常小鼠肝脏的细胞，出现了上皮细胞生长区域（示例如图2A-D). 起始细胞明显活动；当通过延时摄影观察时（数据未显示），在附着、扩散和启动菌落之前的24小时内，它们经常迁移数毫米。为了证实这种生长确实是克隆的，而不是细胞聚集的结果，在三个实验中，从βactin-EGFP转基因和野生型小鼠平行制备NPC，并在离体培养前以50:50混合。当通过荧光显微镜对产生的菌落进行评估时，100%（600个菌落中的600个）的菌落是均匀的EGFP⁺或EGFP⁻，表明所有生长都是克隆的（数据未显示）。

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图2。

小鼠肝细胞集落显示肝细胞和导管细胞类型的标记。(A–D)FACS-分类CD45产生的四个代表性单个菌落⁻/11亿⁻/31⁻/MIC1-C3型⁺/26⁻显示单元格；指出了每个群体的基因表达测量在下面表达数据表示为相对于GAPDH和β-actin管家基因平均值的qRT-PCR测量线性化ΔCt值。白蛋白和HNF4a是肝细胞分化的标志物，而CK19和CFTR是导管相关的。相位对比图像显示为100×。(E–H（E–H）)其他菌落生长在培养箱载玻片上，并用血统标记抗体标记。用Cy3荧光显示抗体标记，用Hoechst 33342标记细胞核。放大200倍。

单个菌落的基因表达谱显示，在导管和肝细胞谱系标记方面存在显著差异。然而，几乎所有菌落都含有肝细胞和胆管上皮细胞系。肝细胞标志物HNF4a的免疫荧光检测(图2E)结果表明，阳性细胞往往较小，且位于菌落边缘。胆道标志物细胞角蛋白19（CK19）标记后，在菌落中观察到相同的模式(图2F)这表明许多细胞同时存在肝细胞和导管谱系标记。泛细胞角蛋白标记显示正常组织中导管比肝细胞更强烈，在菌落上呈斑片状；大多数细胞明显呈阳性，但观察到暗/阴性细胞区域(图2G). Sca-1是造血祖细胞的标记物，也可能表明上皮细胞的原始性(克莱顿和福布斯2009)在朝向菌落中心的细胞上观察到(图2H)与HNF4a或CK19的模式相反。

在正常和DDC处理的非实质性肝细胞中检测到的集落形成祖细胞的频率列于表1为了捕获最强大的克隆形成细胞，只统计了含有50个或更多细胞的克隆，但也观察到了大量较小的克隆。在这些培养物中，肝细胞没有启动克隆。在MIC1-1C3抗体标记的三个亚组分中（M⁺)、M⁺133⁺26⁻到目前为止，含有最高频率的克隆形成细胞的部分。CD26缺失很重要；CD26型⁺导管细胞不形成菌落。CD133和MIC1-1C3的组合富集了菌落形成，与单独标记相比，这是另外两倍。接种1000个细胞的微孔中的菌落计数和通过限制稀释计算的频率都表明，DDC处理组分中祖细胞的频率略高于未处理组分。在卵圆细胞反应期间，各种导管周围细胞出现或频率增加，并且有几种抗体可用于标记这些NPC(Dorrell等人，2008年). 为了确定这些DDC诱导的人群中是否有克隆祖细胞，使用了六种不同抗体的组合（“OC2-combo”，包含OC2-1C6、OC2-2A6、OC2-3C5、OC2-3C7、OC2-4E8和OC2-6E10）。如所示表1，任何这些标记物标记的细胞都被显著耗尽以进行克隆形成活性。因此，卵圆细胞反应期间出现的大多数细胞都不是克隆原性的。

表1。

非实质性肝细胞表型定义亚群中集落形成祖细胞的定量

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通过二次集落形成试验检测集落形成细胞的自我更新能力。在第12天通过克隆环分离和胰酶消化法获得单个菌落，将其接种在新鲜培养基中的新孔中，并在12天后进行评估。当补充Wnt3A培养物时，初级菌落产生0-54个次级菌落（平均值9.8），第三级菌落的产生频率为每次级菌落0-53个第三级（平均值7.3）(Barker等人，2010年). 因此，祖先自我更新至少实现了三代。

肝细胞亚群的转录分析

通过定量RT-PCR（qRT-PCR）对直接分拣到Trizol中的细胞群体FACS的RNA进行基因表达分析。正如预期的那样，与胆管、星状细胞或祖细胞相关的基因表达与CD45相关⁻/11亿⁻/31⁻NPC人群而非肝细胞，是否从未经治疗的患者中分离(图3A)或DDC受伤(图3C)肝脏。未经处理的肝脏NPC细分为MIC1-C3亚群⁺细胞表现出不同的基因表达模式(图3B). 在两组小鼠中均检测到CK19和囊性纤维化跨膜蛋白（CFTR）的大量表达⁺133⁺26⁻和M⁺26⁺人群，表明两者的胆管特性。然而，这两个群体的碳酸酐酶II（CAII）表达不同；只有M⁺133⁺26⁻导管数量包含可测量的CAII。另一个值得注意的区别是Sox9指数肝祖细胞相关转录因子(Furuyama等人，2011年;Kopp等人，2011年)仅在M中⁺133⁺26⁻细胞分数。福克斯J1，另一种与上皮细胞分化相关的转录因子(罗林斯等人，2007年)，显示了相同的模式。M中CD26/DPPIV mRNA的预期存在⁺26⁺分数及其在M中的缺失⁺133⁺26⁻该部分也通过qRT-PCR进行了确认（数据未显示）。第三个亚群，M⁺133⁻26⁻，含有很大比例的结蛋白mRNA，表明存在星状细胞。当从DDC治疗的肝脏中分离出这三个相同的抗原定义的NPC亚群时，观察到了某些差异。图3D显示DDC处理的M⁺133⁺26⁻和M⁺26⁺分数的轮廓与正常分数相似，但M⁺133⁻26⁻该组分含有CK19 mRNA和大部分CFTR mRNA；即管道。此外，该群体中的结蛋白相对较少，SOX9 mRNA约占一半⁺133⁻26⁻DDC处理后的组分非常不均一，含有导管细胞和星状细胞。

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图3。

小鼠肝细胞亚群分析揭示了具有祖细胞基因表达的导管亚群。从FACS分离的肝细胞和NPC人群中获得的qRT-PCR结果计算为相对于GAPDH和β-actin平均值的ΔCt值；指出了每个细胞亚群中的相对表达。检测到的给定基因的总信号在被比较人群中所占的比例显示在Y（Y）轴。(A类,C类)正常肝细胞和NPC中导管、肝细胞和祖细胞相关基因的表达水平(A类)或DDC受伤(C类)比较肝脏。(B类,D类)MIC1-C3三个亚群中导管、肝细胞和祖细胞相关基因的表达水平⁺正常NPC(B类)或DDC受伤(D类)比较肝脏。Sox9指数和福克斯J1表达仅限于MIC1-C3⁺/CD133型⁺/CD26型⁻导管亚群。使用了从三个单独的细胞分离实验中获得的材料的两次重复qRT-PCR分析数据。

含祖先群体的转录本

正常肝脏中克隆原双能祖细胞的鉴定为我们提供了机会，以确定卵圆形细胞激活期间该人群中哪些基因上调或下调。使用安捷伦全小鼠基因组阵列获得了正常和DDC处理的肝脏的祖细胞富集和祖细胞缺失非实质部分的mRNA谱。通过分析每个DDC处理的群体的四个生物重复来组装全局表达谱；对于未处理的群体，使用了5个富含祖细胞的样本和3个不完全的样本。此数据集可通过ArrayExpress获得（AE登录：E-MTAB-459）。我们对四种分类细胞群体获得的全球基因表达谱进行了聚类分析，重点是726个探针，这些探针在任何一对细胞类型之间的差异表达至少有三倍的变化。如所示图4，四组中的每一组都包含具有独特表达的大块基因。基于基因本体论（GO）的分布概述如补充图S2中的GO和Kegg分析所示。

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图4。

小鼠鼻咽癌亚群微阵列评估基因表达的层次聚类。使用726个不同表达的探针对全球基因表达谱进行分析，这些探针在任何细胞类型对之间的倍数变化至少为3。（UT）未处理；（DDC）卵圆细胞诱导。

导出了这些细胞群体中与潜在功能群相对应的具有特定差异表达模式的基因类别列表。补充表S2列出了M之间差异最大的类别⁺133⁺26⁻祖细胞分数和M⁻133⁻26⁻未处理组织（休眠祖细胞）的非祖细胞部分，补充表S3列出了DDC处理组织（损伤激活）的相应信息。活化的双潜能克隆形成肝细胞（BCLC）的基因表达谱与福克斯L1-相关研究中描述的阳性祖细胞(Shin等人，2011年)和特征差异表达促销1（CD133）,Epcam公司,抄送44,Sox9指数,和Trop2与肝脏的祖细胞功能有关。同样，氯化物3,Ncam1型、和一切2都是标记福克斯L1和M⁺133⁺26⁻祖先群体。来自未损伤肝脏的BCLC中也存在这些相同的因子，这表明它们在损伤前就存在于克隆祖细胞中。因此，很可能福克斯L1是活化祖细胞的早期标记。与非克隆性NPC相比，这两类祖细胞都具有与癌症和紧密连接相关的类别下调和肝细胞基因上调的特征。这与祖细胞具有双潜能并能够分化为肝细胞谱系的概念相一致，尽管它们在解剖学上是胆道树的一部分。当将DDC处理组织的活化祖细胞部分与未处理肝脏的休眠祖细胞部分进行比较时（补充表S4），发现活化的祖细胞部分具有较高的细胞周期相关基因表达和较低的锌指结构域基因表达。后者的一个例子是Z扫描12/Zfp449型，一种假定的转录因子，在M中的表达较低45倍⁺133⁺26⁻DDC处理细胞比未处理细胞的比例。因此，这些下调的锌指转录因子是在肝损伤期间控制祖细胞活化的候选者。

免疫荧光成像

使用Reichert 2800 Frigocut（Reichert-Scientific Instruments）制备小鼠肝脏冷冻切片（5μm），并在−20°C的丙酮中固定10分钟。非特异性标记通过在2%山羊血清（Hyclone）中孵育10分钟而被阻断。所使用的血统标记抗体包括抗HNF4a（Santa Cruz Biotechnology）、抗CK19（X.Wang赠送）、抗panCK（Abcam）和Sca-1（BD Biosciences）。初级标记使用混合瘤上清液在DPBS中稀释1:20，持续30分钟，二级标记使用1:200稀释的DyLight488-或Cy3-结合抗鼠Ig预吸附小鼠血清蛋白（Jackson ImmunoResearch），持续20分钟。用Hoechst 33342（分子探针）观察细胞核。使用蔡司Axioskop 2 plus显微镜（卡尔蔡司）进行成像。

流式细胞术和流式细胞仪

分离的细胞以1×10的速度重新悬浮⁶在添加1:20稀释度的MIC1-C3杂交瘤上清液或1:200稀释度的纯化MIC1-1C3抗体（Novus Biologicals）并在4°C下孵育30分钟之前，每毫升DMEM+2%FBS中的细胞数。用冷DPBS洗涤后，将细胞重悬于DMEM+2%FBS中，DMEM+2%FBS含有1:200稀释的APC缀合的山羊抗大鼠第二抗体，该抗体吸附在小鼠血清蛋白上（Jackson Immunoresearch）。再次清洗后，将细胞重新悬浮在DMEM+5%大鼠血清（Serotec）中，并在冰上保持10分钟，以阻止二次抗体。最终用FITC-偶联抗CD26（BD Biosciences）、PE偶联抗CD133（eBiosciency）和PE-Cy7-偶联抗CD45⁺和CD11b⁺)和内皮细胞（CD31⁺)单元格。碘化丙啶染色用于标记死亡细胞以排除。细胞用FluxV-GS（Becton-Dickenson）中的Cytopeia进行分析和分类；对于FSC，使用脉冲宽度门控从分析和采集中排除细胞加倍。

集落形成分析

细胞的播种密度通常为10²–10⁴Primaria（BD Falcon）组织培养塑料器皿预涂鼠尾胶原蛋白每平方厘米（取决于预期的菌落形成频率）。涂层由1 mg/mL鼠尾胶原蛋白在0.1%冰醋酸中的储备液制成，在DMEM中以1:10稀释，涂在平板表面10分钟，然后在添加细胞+培养基之前抽吸。按照说明制备无血清培养基，包括规定浓度的游离脂肪酸(Macdonald等人，2002年)并补充50 ng/mL小鼠表皮生长因子、25 ng/mL鼠肝细胞生长因子（Chemicon）和10μM溶解Y-27632（EMD Chemical）。在某些实验中，培养基中添加了Wnt3A（100 ng/mL；干细胞技术）。在第12天对集落进行评分，集落定义为由至少10个细胞组成的大致圆形簇。由于仅通过相位对比识别这些（极平坦）菌落的挑战性，除非菌落通过免疫荧光标记进行分析或收集用于RNA分析或重新种植，否则使用亚甲蓝染色。

移植试验

如前所述，将分选的细胞群注射到脾脏并退出NTBC以诱导肝细胞选择(Overturf等人，1996年). 在3周内停药，然后再次给药，直到受体动物恢复正常体重。

限制稀释分析

为了限制体外菌落形成的稀释分析，应用了单次撞击模型的泊松统计。以每孔5到100的密度播种细胞，并在第12天进行菌落计数。

微阵列分析

使用WT-Ovation Pico扩增系统（NuGEN Technologies）从五个样本的RNA中为每个分选的细胞群样本制备扩增的cDNA。扩增的cDNA（2μg）使用生物素阵列CGH基因组标记系统（Invitrogen）和Cy3标记的核苷酸（GE Amersham Biosciences）直接标记。将标记的样品与安捷伦4X44全鼠基因组阵列杂交过夜。清洗阵列，然后用G2565B型安捷伦DNA微阵列扫描仪（安捷伦技术公司）进行扫描。使用安捷伦特征提取版本10.5.1.1（安捷伦技术）捕获阵列上每个元素的中位数强度。为每个阵列准备了质量控制诊断图，那些未能表现出高质量杂交的阵列被排除在进一步分析之外，从而得到最终数据集。

使用R中LIMMA（微阵列数据线性模型）包中的“normalizeBetweenArrays”函数，通过分位数归一化方法对数据进行归一化(绅士2005). 为了进行统计分析，使用微阵列显著性分析（SAM）一级响应包将基因称为差异表达，错误发现率为10%，最小倍变化为1.5×。省略了标记为缺失的基因（即表达水平接近背景）。所有表达数据保存在基因表达总览（GEO登录GSE29121）中。

中的热图图5使用TIGR多实验查看器生成(Saeed等人，2003年).

使用DAVID/EASE网站确定GO和KEGG途径的功能富集(Dennis等人，2003年;Huang等人，2009年). 使用Benjamini Hochberg对报告的统计显著性进行了多次测试校正，并通过网站计算FDR值。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）DK051592（M.G.）、P01 DK049210（K.H.K.）和DK078803（M.S.）的资助，美国国立卫生院/美国国家科学院（NIH/NRSA）向J.L.K.提供的博士后研究金，OHSU已对本文所披露的部分技术（MIC1-C3/MPdi1）进行了商业许可；C.D.和M.G.是这种试剂的发明者。OHSU审查并管理这种潜在的利益冲突。