先前使用2pFLIM和2-光子谷氨酸去激活的研究揭示了在经历结构可塑性和LTP的单棘中信号蛋白CaMKII和HRas的时空动力学12,13.CaMKII激活仅限于脊椎，并以约10 s的时间常数快速衰减13相反，HRas活性从受刺激的脊椎沿着树突扩散到周围的脊椎，扩散范围超过~10μm12然而，为了实现持久的、脊髓特异性的可塑性，还应该存在在分钟到小时的时间范围内传递分区信号的信号通路。Rho GTPases可能构成这种信号，因为它们在调节肌动蛋白细胞骨架中发挥重要作用三,16这对于脊椎特定的长期结构和功能可塑性至关重要14,17.
为了测量单个树突棘中Rho GTPase的激活，我们开发了基于荧光共振能量转移（FRET）的传感器，该传感器使用类似于先前开发的HRas传感器的设计，在2pFLIM下优化成像11RhoA/Cdc42传感器由两部分组成：标记有单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）的RhoA/Cdc42及其结合伙伴Rhotekin/Pak3的Rho GTPase结合域（RBD），双重标记有mCherry（mCherry-RBD-mCherrry）(补充说明). 当mEGFP-Rho GTPase被激活时，mCherry-RBD-mCherry与mEGFP-RhoA/Cdc42结合，导致mEGFP和mCherryFRET之间发生FRET(补充图1、2). 这些传感器在2pFLIM下经过验证具有特异性和敏感性(补充说明).
使用这些传感器，我们测量了与LTP相关的脊柱结构可塑性过程中RhoA和Cdc42的活性(,和). 培养海马脑片CA1区的锥体神经元呈弹道状18转染RhoA或Cdc42传感器，在2pFLIM下成像FRET信号。使用mCherry-RBD-mCherry的红色荧光监测脊柱体积(补充图3)12为了诱导单个树突棘的结构可塑性，我们在树突棘上施加了一系列低频双光子谷氨酸去盖脉冲（30个脉冲，频率为0.5 Hz），细胞外镁浓度为零2+（参考13、14、19）。谷氨酸去盖后（短暂期）脊柱体积迅速增加约300%，放松至70-80%的升高水平超过30分钟（持续期）(,)12–14表达FRET传感器的神经元的脊柱扩大时间过程与仅表达EGFP的神经元相似()14表明FRET传感器的过度表达对脊柱结构可塑性几乎没有影响(补充说明).
单棘长期结构塑性诱导过程中RhoA激活的时空动力学a、，2-光子谷氨酸解老化诱导脊柱结构塑性过程中RhoA激活的荧光寿命图像。箭头表示受刺激的脊椎。较暖的颜色表示寿命较短，RhoA活性较高。比例尺，5μm。
b、，RhoA活化的时间过程是通过受激脊髓（stim）、受激脊髓旁的树突状轴（dend；在1μm内）和相邻脊髓（adj；在受激脊髓的3-5μm之间）中结合到mCherry-RBD-mCherry的mEGFP-RhoA分数的变化来测量的。还显示了使用药物抑制剂的数据（Ctrl，对照条件；KN62，CaMKII抑制剂；AP5，NMDA受体抑制剂）。插图：近景。受刺激脊椎和树突的样本数（脊椎/神经元）为35/29，相邻脊椎为29/26，KN62为16/10，AP5为8/5。误差线为s.e.m。
c、，短暂（平均16-64秒）和持续（平均20-38分钟）RhoA激活。星形表示与对照条件下受刺激脊椎中的值存在统计显著差异（<0.05）。对树突和相邻棘使用Wilcoxon符号秩检验，对药物抑制剂的实验使用ANOVA和使用最小显著性差异的事后检验。
日期：，相同实验中脊柱体积变化的平均时间过程b.
e、，瞬时（1.5–2分钟内的平均体积变化减去20–38分钟内的体积变化）和持续体积变化（20–38 min内的平均容积变化）。
单棘长期结构塑性诱导过程中Cdc42活化的时空动力学与中相同的实验和分析除了测量Cdc42活性而不是RhoA活性。受刺激脊椎和树突的样本数（脊椎/神经元）为33/28，相邻脊椎为33/29，KN62为11/6，AP5为12/8。
RhoA和Cdc42活动的空间分布a、，谷氨酸去壳前后RhoA活性的荧光寿命图像。箭头表示脊椎受到刺激。
b、，RhoA活化的平均空间分布。红色圆圈表示受刺激脊椎的活动，黑色圆圈表示树突的活动，绘制为树突与模拟脊椎之间距离的函数。样本数（树突/神经元）为20/18。
c、，Cdc42活性的荧光寿命图像。
日期：，Cdc42激活的平均空间分布。样本数（树突/神经元）为30/26。
e、，棘头光活化后paGFP-RhoA（左）和paGFP-Cdc42（右）的荧光图像（绿色，paGFP-Rho GTPases；红色，串联mCherry）。
f中，脊髓中paGFP标记蛋白的光激活后，脊髓中荧光衰减的平均时间进程。荧光强度归一化为峰值。paGFP的样本数（脊髓/神经元）为63/6，paGFP-HRas（G12V）的样本数为38/4，paGFP-Cdc42（WT）的样本量为41/5，paGFP-Cdc42（Q61L）的样本数量为83/9，paGFP-RhoA（WT。HRas（G12V）、RhoA（Q63L）和Cdc42（Q61L）是组成活性突变体。
g、 h时，衰变时间常数(克)20秒后剩下的分数(小时)paGFP荧光在光激活脊髓中的表达。水平条，平均值。
Rho-GTPase抑制对脊柱头部膨大结构可塑性的影响a-h、，Rho-GTPase信号操纵下神经元受刺激脊髓中脊柱体积变化的平均时间过程。用抗RhoA和RhoB（sh-RhoA/B）和mEGFP的shRNAs转染神经元(一)、sh-RhoA/B、mEGFP-shRNA抗性RhoA（mEGFP-RhoA-res）和串联mCherry(b)、mCherry-C3（C3）和mEGFP(c（c）)，mEGFP(d、 小时)、针对Cdc42（sh-Cdc42）和mEGFP的shRNA(e（电子）)，sh-Cdc42，mEGFP-shRNA抗性Cdc42（mEGFP-Cdc42-res）和串联mCherry(（f）)或mCherry-Wasp（210–321）（黄蜂）和mEGFP(克)（红色）。在同一批切片中进行配对对照实验（黑色），使用打乱的shRNA代替靶向shRNA(a、 e（电子）)，仅mEGFP(b、 （f）)或者用mCherry代替C3和Wasp(c、 克). 药理学实验(d、 小时)在给浴缸用药前（配对对照，黑色）和用药后30–40分钟（红色）进行。mEGFP的荧光强度(a、 c、d、e、g、h)或串联mCherry(b、 （f）)用于测量脊柱体积变化。样本数量（脊椎/神经元）如图所示（对照组和实验组的数量相同）。
我，瞬时容积变化（1.5–2分钟内的平均容积变化减去20–36分钟内的均值）。星形表示统计显著性（p<0.05，配对t检验）。
j、，持续的音量变化（20–36分钟内的平均音量变化）。
k、，Cdc42和RhoA活化模型。
我，脊柱体积变化和RhoA激活的叠加时间过程()，Cdc42()和CaMKII13在结构可塑性的脊椎中。时间进程被归一化为峰值。对，近距离观察。
在基础条件下，Rho GTPase活性与脊柱体积之间没有相关性(补充图4). 当诱导脊柱结构塑性时，两种RhoA()和Cdc42()在受刺激的脊髓中约30秒内被迅速激活。活性衰减约5分钟，随后持续活性超过30分钟。RhoA活性扩散到树突超过几微米(,)，并轻微侵犯周围脊椎（约占受刺激脊椎的25%）。相反，Cdc42的激活仅限于受刺激的脊髓(,). 对于RhoA和Cdc42，脊柱颈部的梯度保持了约30分钟(,).
接下来，我们从药理学上确定了激活RhoA和Cdc42的信号通路。用2-氨基-5-磷酸戊酸（AP5，50μM）抑制NMDA受体可消除RhoA的激活()和Cdc42()以及脊椎扩大(,)14表明RhoA和Cdc42被Ca激活2+通过NMDA受体。已知CaMKII抑制剂KN62能强烈抑制持续的脊柱增大，但对暂时性脊柱增大的影响较小(,)13,14KN62（10μM）在瞬态阶段部分抑制了RhoA和Cdc42的激活，在持续阶段更为强烈。(,). autocamtide CaMKII抑制剂肽2（AIP2）的表达也以类似的方式抑制了脊柱体积变化和Rho GTPase激活(补充图5). 这些结果表明RhoA和Cdc42是CaMKII的下游。
接下来，我们描述了RhoA和Cdc42活性沿树突的空间分布，作为与受刺激脊椎距离的函数(). RhoA活性在受刺激的脊髓和树突之间表现出相对较小的梯度，并沿树突扩散。沿枝晶扩散的长度常数为4.5μm()，该值类似于HRas的值（~10μm）12相反，Cdc42的激活仅限于受刺激的脊髓()显示出类似于CaMKII的空间模式13一小部分Cdc42活化扩散到枝晶中，并急剧衰减，长度常数约为1.9μm(). 这些实验是在室温（25–27°C）下进行的，但在近生理温度（32–34°C；补充图6、7).
测试RhoA和Cdc42的分区程度的差异是否是由于其流动性的差异12,13我们使用光活化GFP（paGFP）测量了尖晶石扩散耦合20融合到Rho GTPases。随着paGFP在脊柱中的光活化，由于paGFP-Rho-GTP酶从脊柱中扩散，脊柱中的荧光强度衰减，野生型的时间常数为~3s，其组成型活性突变体的时间常数为~6s(). 这些值比胞浆paGFP的衰减时间常数（约0.4 s）大约10倍，与组成活性HRas突变体的衰减时间常量（约6 s）相似()12野生型Rho GTPases和组成活性突变体之间的差异可能反映了与质膜结合的蛋白质比例的差异，因为活性Rho TGPases位于质膜上21.光活化后20 s仅剩下一小部分（10-20%）荧光()表明脊椎中不存在RhoA或Cdc42的主要固定部分。因此，Cdc42与RhoA和HRa一样具有流动性，但只有Cdc42表现出分区活性。
接下来，为了阐明Rho GTPase激活在脊柱结构可塑性中的作用，我们测量了Rho或Cdc42信号抑制下的脊柱体积变化(). 短发夹RNA（shRNA）下调RhoA和RhoB可降低瞬时容积变化，但对持续容积变化没有明显影响(). 相反，针对Cdc42的shRNA减少了持续的体积变化，但不减少瞬时的体积变化(). 这些shRNAs引起的表型通过共表达shRNA-resistant mEGFP-Rho GTPases而得到挽救()表明shRNAs的作用是特异性的，FRET传感器中使用的mEGFP-RhoA和mEGFP-Cdc42具有内源性蛋白质的功能。因为shRNA对蛋白质的下调是部分的(补充图8)并且需要相对较长的时间（4天），我们还通过表达Rho抑制剂mCherry-C3转化酶（C3）来抑制Rho和Cdc42信号22和标记有mCherry（Wasp）的Wasp的Cdc42结合域23时间更短（24小时）。用C3抑制Rho抑制瞬时和持续相()显示出比shRNA更强的作用(). 用Wasp抑制Cdc42可抑制持续相，但不抑制瞬态相()，与shRNA结果一致(). 因此，我们的数据表明，Rho信号在脊椎扩大的短暂阶段和可能的持续阶段是必需的，而Cdc42信号在持续阶段则是必需的。C3和Wasp均不影响CaMKII激活(补充图9)，表明Rho和Cdc42没有向上游Ca发出反馈信号2+和CaMKII。C3和Wasp还抑制了配对突触后去极化（0 mV）和2-光子谷氨酸去极化诱导的突触增强(补充图10)13,14表明Rho和Cdc42对脊椎的功能可塑性和结构可塑性很重要。
在已知的Rho和Cdc42效应物中，Rock和Pak是两种激酶，可被这些GTPase代表性激活24–26。我们通过急性（30-40分钟）应用特定的药理学抑制剂来测试它们是否是结构可塑性所必需的。乙二醇-H1152（GH1152；2μM）对岩石的抑制作用27抑制瞬时和持续的体积变化()类似于Rho抑制剂C3(). 相反，IPA3（100μM）对Pak的抑制作用28在不改变瞬时容积变化的情况下，选择性地降低持续容积变化()类似于抑制Cdc42信号(). 结合Rho/Cdc42抑制的结果()，我们的数据表明，瞬态和持续阶段都需要Rho-Rock路径，而结构塑性持续阶段需要Cdc42-Pak路径，但瞬态阶段不需要().
在这项研究中，我们观察了与LTP相关的结构可塑性的单个树突棘中RhoA和Cdc42的活化12–15,19其激活的时间过程与体积变化的时间过程相似：快速激活后持续激活30分钟以上(). 正如其高机动性所预期的那样()，RhoA活化后扩散到枝晶中()13然而，活动侵入邻近脊椎的程度相对较小（25%的受刺激脊椎，)不足以产生塑性(). 与RhoA活性的扩散模式相反，Cdc42活性仅限于受刺激的脊髓(,). Cdc42活性的分区并不是由于活性Cdc42的有限扩散，因为活性Cdc42-与RhoA和HRas一样具有流动性(). 由于Cdc42在受刺激脊椎和树枝晶之间的高空间梯度维持了20–30分钟以上(,)在可塑性期间，Cdc42必须在受刺激的脊椎处持续激活，并在扩散出脊椎后立即失活。树枝晶中Cdc42的短长度常数（1.9μm，)还支持枝晶中Cdc42的快速失活：失活时间常数τ与长度常数有关L（左）和扩散常数D类~0.6微米2（参考12)作为τ=L（左）2/D类因此，Cdc42约为6秒，RhoA约为30秒，而HRa为200–300秒12.
我们的研究结果进一步表明，RhoA和Cdc42的激活是CaMKII依赖性的，并且激活持续30分钟以上(,). 先前的成像研究表明，CaMKII活性以约10 s的时间常数衰减()13从而整合NMDA受体激活的Ca2+持续约0.1秒的瞬态13,29.RhoA和Cdc42的局部持续激活，在CaMKII激活和体积变化之间达到峰值()，中继瞬态CaMKII信号13长期脊柱结构可塑性(). 特别是，作为CaMKII13,14Cdc42表现出脊椎特异性激活，并需要维持可塑性()，NMDA受体-CaMKII-Cdc42-Pak通路（中的红线)构成脊椎特异性信号转导，跨越从亚秒到30分钟以上的时间尺度，从而导致脊椎结构和功能的持续可塑性().
