肿瘤特异性CD8耗尽⁺黑色素瘤患者转移瘤中的T细胞

原始T细胞与非原始T细胞的基因表达谱。

在分析肿瘤特异性T细胞之前，我们通过寻找初始和非初始CD8之间的已知分子差异，仅使用1000个细胞验证了我们的方法⁺T细胞(28,30). 我们选择了在原始和非原始CD8之间表现出3倍或更大变化的基因⁺T细胞，加上P（P）针对小于0.05的错误发现率（FDR）调整的值（补充图2A）。通过这种策略，我们在naive相对于非naive CD8中识别出409个上调基因和364个下调基因⁺T细胞（补充表1），发现所有原始T细胞群聚集在一起，与所有非原始T细胞分开（图​（图2A）。2A） ●●●●。我们选择了8个基因进行qPCR验证。无一例外，他们证实了微阵列结果，由于qPCR的敏感性更高，因此qPCR在定量上检测到了更大的差异（补充图2B）。此外，许多差异表达基因的数据（例如。，CCR7号机组,LEF1级,出售,IFNG公司,GZMB公司、和HLADR公司; 补充图2C）证实了原始T细胞和非原始T细胞之间众所周知的差异。

在单独的窗口中打开

图2

外周血原始T细胞和效应T细胞的基因表达。

(A类)基于已确定的773个基因的双向分层聚类，将所有原始T细胞与非原始T细胞分离。相对于平均值，红色表示过度表达，蓝色表示不足表达。每行代表1个基因，每列代表1个患者或健康供体的1000细胞样本。(B类)与已识别基因相关的GO术语的相对过表达，按方法中所述进行计算。(C类和D类)描述原始T细胞和效应T细胞的公开基因集的GSEA。显示了选定的示例基因的位置。基因集包含富含原始T细胞的基因(C类)或在效应细胞中(D类). 排名表左侧和右侧的基因分别富含原始T细胞和非原始T细胞。

我们通过将773个差异表达基因分配给9个基因本体论（GO）术语来评估它们的生物学分类，然后确定与随机基因列表中的预测频率相比，这些GO术语中是否有任何一个在我们的列表中过度表达。毫不奇怪，我们发现免疫反应基因的数量是随机基因测试预测数量的两倍（图​（图2B）。2B） ●●●●。此外，GO术语中的翻译、细胞死亡和凋亡在非原始细胞中过度表达，而与DNA修复相关的基因却未得到充分表达。

2005年，Willinger等人对人类CD8进行了彻底的基因表达分析⁺无抗原特异性差异的健康供体T细胞(31). 他们确定了原始效应细胞和总效应细胞之间的巨大差异，为这两个群体的区别提供了基因集特征。从这些数据中，我们使用了2个基因集，一个在效应器CD8中上调，另一个下调⁺T细胞。此外，2007年，Wherry等人定义了抗原特异性记忆、效应器和耗尽CD8中上调或下调的基因集⁺LCMV感染小鼠的T细胞(2). 虽然来自Willinger等人的基因集描述了效应器分化的长期效应（对人类CD8总量的分析⁺T细胞亚群处于稳定状态），来自Wherry等人的基因集描述了基因表达的短期变化（急性和慢性感染模型）。通过基因集富集分析（GSEA），我们确定基因集是否在我们的差异表达基因的秩序列表中富集。我们的原始T细胞在效应细胞中表现出2个下调的基因集的上调，如Wherry等人（参考文献。2和图​图2C）2C） 以及Willinger等人（参考。31和图​图2C）。2C） ●●●●。相反，在我们的非原始T细胞中富集的基因集是Wherry等人定义的效应细胞中上调的基因集​（图2D）2D） Willinger等人（图​（图2D）。2D） 。总之，这些数据证实了高纯度细胞微阵列分析的再现性，验证了我们对小细胞数抗原特异性T细胞的体外分析方法。

循环肿瘤和病毒特异性T细胞之间的不同基因表达谱。

我们研究的主要目的是确定肿瘤特异性CD8⁺T细胞与病毒特异性T细胞相似或不同。通过应用与上述相同的选择标准（即折叠变化≥3，调整P（P）<0.05），我们发现390个基因在肿瘤和EBV特异性T细胞之间差异表达（259个上调，131个下调）（图​（图3A三而与CMV特异性T细胞相比，只有184个基因（72个上调和112个下调）存在差异表达（图​（图3B三B和补充表3）。因此，CMV和肿瘤特异性T细胞之间的差异小于EBV和肿瘤特异性T细胞之间。使用这些探针进行的双向分层聚类显示了肿瘤特异性和EBV特异性之间的明显区别（图​（图3C）三C） 以及肿瘤和巨细胞病毒特异性T细胞群（图​（图3D）三D） 尽管个体之间的遗传异质性很高，而且这些T细胞群体的表面标记也很相似（补充图3A）。通过qPCR对一系列基因进行分析，确认了微阵列数据，其中包括一些抑制性受体（图​（图3，三、E和G）。与EBV和CMV特异性细胞相比，时间信息模型3和CTLA4型在肿瘤特异性T细胞中上调，而CD160型在病毒特异性T细胞中上调（图​（图3，三、E和G）。2B4型在CMV特异性T细胞中上调。有趣的是，与EBV特异性T细胞相比，肿瘤特异性T淋巴细胞表达更多编码颗粒酶B的mRNA(GZMB公司)和粒溶素(GNLY公司)，但更少XCL1公司（淋巴战术素）。XCL1公司在CMV特异性T细胞中也上调。最后，我们进行了GO术语分析，发现肿瘤和2种病毒特异性T细胞群之间的差异较小（图​（图3，三，F和H），而非原始T细胞与原始T细胞的差异（图​（图2B）。2B） ●●●●。值得注意的是，与随机基因列表相比，免疫应答基因的表达并没有特别高，这表明免疫基因在EBV、CMV和Melan-a/MART-1特异性效应T细胞中的表达总体相似，尽管抑制性受体存在差异。

在单独的窗口中打开

图3

循环CD8的基因表达⁺T细胞依赖于抗原特异性。

(A类和B类)所有基因探针的火山图，显示差异表达和P（P）肿瘤与EBV特异性T细胞的比较价值(A类)或肿瘤与巨细胞病毒特异性T细胞(B类); 图表与图中的类似​图1。1. (C类和D类)基于已识别的基因探针的双向分层聚类法从EBV-(C类，405个基因探针对应390个基因）和CMV特异性T细胞(D类，187个基因探针对应184个基因）。相对于平均值，红色表示过度表达，蓝色表示不足表达。每行代表1个基因，每列代表1个来自1名患者（肿瘤、EBV和CMV特异性细胞）或健康供体（EBV-特异性细胞、，n个= 4). (E类和克)肿瘤和EBV-之间的对数倍变化(E类)或肿瘤和巨细胞病毒特异性T细胞(克)来自微阵列（蓝色条）和qPCR（红色条）的数据。正值和负值分别表示肿瘤和病毒特异性T细胞中的过度表达。数据表示为平均值±SEM(F类和H（H）)与确定的390个基因相关的GO术语的相对过表达（Melan-A/MART-1与EBV；F类)或已确定的184个基因（Melan-A/MART-1 vs.CMV；H（H）)，按照方法中的描述进行计算。

循环肿瘤特异性CD8的基因表达谱⁺T细胞对应于晚期分化的效应细胞。

EBV和CMV特异性T细胞分别被认为是早期和晚期分化效应细胞的原型(7). 这种区别与这两个种群的表型相符（补充图3A）。我们创建了等级排序的基因列表，以比较肿瘤特异性和2种病毒特异性CD8⁺T细胞群。Wherry等人（参考文献。2和图​图4A）4A） 和Willinger等人（参考。31和图​图4A）4A） 与EBV特异性细胞相比，在肿瘤特异性细胞中富集。相反，与肿瘤特异性T细胞相比，EBV特异性T淋巴细胞中唯一富集的基因集是包含记忆细胞中特异性上调基因的小基因集，而与原始CD8相比⁺Wherry等人定义的T细胞（图​（图4B）。4B） ●●●●。这可能是因为EBV特异性T细胞的效应器分化程度较低（但主要是效应器而非记忆细胞；补充图3A）。当我们比较肿瘤与CMV特异性CD8时⁺T细胞，我们没有发现任何基因集的富集（图​（图4C），4C） 确认肿瘤特异性T细胞的晚期分化阶段。为了验证颗粒酶B和穿孔素在蛋白质水平上的体外差异表达，我们进行了细胞内染色。正如预期的那样，肿瘤和巨细胞病毒特异性CD8⁺T细胞比EBV特异性CD8表达更多颗粒酶B和穿孔素⁺T细胞（图​（图4D）。4D） 。然而，所有3种抗原经历的T细胞在用肽负载的T2细胞触发4小时后产生高水平的IFN-γ（补充图3B）。总之，我们的结果表明肿瘤和CMV特异性CD8⁺T细胞彼此非常相似，而EBV特异性CD8⁺T细胞处于效应分化的早期阶段。

在单独的窗口中打开

图4

循环肿瘤特异性T细胞是晚期分化的效应细胞，类似于CMV特异性T淋巴细胞。

(A类)描述效应细胞的基因集富集（见图​图2D）。2D） 。排名表左侧和右侧的基因分别富集于肿瘤和EBV特异性T细胞。(B类)描述记忆细胞基因的基因集富集(2). 排名表左侧和右侧的基因分别富集于肿瘤和EBV特异性T细胞。(C类)通过定义效应细胞相关基因的基因集证明，在Melan-A/MART-1和CMV特异性T细胞之间没有发现差异(31). (D类)原始T细胞和抗原特异性T细胞的细胞内染色。顶部面板显示了1个代表性示例；以下是所有样本（EBV和CMV，n个= 5; 黑色素-A，n个= 15; 天真，n个= 25). EBV和CMV特异性T细胞的数据来自健康献血者，而肿瘤特异性T淋巴细胞的数据来自患者***P（P）< 0.001. 方框图中的晶须表示测量的最大值和最小值。直线表示中间带。

与循环T细胞相比，肿瘤浸润淋巴结中的肿瘤特异性T细胞表现出耗竭特征。

先前的研究表明，肿瘤特异性T细胞的功能损害可能主要发生在原位(20,24)这也是CpG-疫苗强烈激活全身T细胞后的情况(25). 因此，我们制定了一项临床研究方案，从肿瘤浸润淋巴结（TILN）中回收大量活细胞。这使我们能够从TILN的肿瘤特异性T细胞与循环T细胞进行体外功能研究和基因表达分析。来自转移瘤的肿瘤特异性T细胞在4小时肽触发后表现出IFN-γ生成严重不足（图​（图5A），5A） ，如之前发布的(20,24). 微阵列分析允许识别332个在肿瘤特异性CD8之间差异表达的基因（TILN中201个上调，131个下调；补充表4）⁺PBMC和TILN的T细胞，使用与之前相同的标准（图​（图5B）。5B） ●●●●。使用这些基因的分层聚类将13个样本仅分为2组，一组用于血液，另一组用于TILN衍生的肿瘤特异性T细胞（图​（图5C）。5C） ●●●●。qPCR用于选择允许正确验证的基因（图​（图5D）。5D） 。TILN肿瘤特异性细胞中上调的基因包括淋巴结滞留受体CRTAM公司，趋化因子XCL1公司和XCL2型，激活标记TNFRSF9公司和抑制性受体CTLA4型.CXCL13系列，一种通常在淋巴结B细胞室中发现的B细胞趋化因子，是最高表达的基因之一。TILN细胞中下调的基因包括细胞生长调节蛋白利亚尔和抑制受体KLRG1号机组当将差异表达的基因分类为广义GO术语时，我们发现与细胞死亡和凋亡以及免疫反应相关的基因与随机选择的基因列表相比出现过多（图​（图5E）。5E） ●●●●。获得肿瘤特异性CD8差异的更一般概述⁺与TILN相比，我们研究了效应细胞、原始细胞、记忆细胞和衰竭细胞的特异基因集，如上所述。值得注意的是，为耗尽的T细胞描述的基因集(2)与原始、记忆和效应T细胞的基因集特征相比，TILN中的肿瘤特异性细胞显著富集（图​（图5F）。5F） ●●●●。这些大规模数据显示了令人印象深刻的耗竭特征，肿瘤特异性CD8中多条通路的分子改变范围更广⁺转移瘤的T细胞。

在单独的窗口中打开

图5

原位肿瘤特异性T细胞的耗竭情况。

(A类)循环中肿瘤特异性T细胞产生IFN-γ（血液；n个=6）或倾斜(n个=8）抗原刺激4小时后。方框图中的晶须表示测量的最大值和最小值。交叉表示平均值，而直线表示中间值**P（P）< 0.01. (B类)从血液中分离的肿瘤特异性T细胞与TILN的差异基因表达，如所有基因探针的火山图所示。(C类)基于已确定的346个基因的双向分层聚类，将所有血源性肿瘤特异性T细胞与其TILN对应物分离。相对于平均值，红色表示过度表达，蓝色表示不足表达。每行代表1个基因，每列代表1名患者的1个1000细胞样本。(D类)血液肿瘤特异性T细胞与TILN的对数倍变化；来自微阵列（蓝色条）和qPCR（红色条）的数据。正值和负值分别表示TILN和血液中肿瘤特异性T细胞过度表达。平均值±SEM(E类)与已识别基因相关的GO术语的相对过表达，按方法中所述进行计算。(F类)用于衰竭T细胞的基因集的富集(2)在TILN衍生的肿瘤特异性T细胞中，相对于其血源性T细胞。在该基因集中发现的抑制性受体的位置显示在等级排序基因列表中。左边的位置表示TILN衍生细胞的富集，右边的位置表示血液衍生细胞的富集。

抑制性受体的表达增强，如CTLA4型和拉丁美洲3在T细胞衰竭时观察到(2,23,32–34). 有趣的是，它们在TILN细胞中的表达丰富，但值得注意的是PTGER2（PTGER2）和KLRG1号机组（图​（图5F）。5F） ●●●●。然而，KLRG1号机组被描述为在功能正常的效应细胞中比在衰竭的T细胞中表达更强烈(2)，与我们的数据兼容。所选抑制受体的绝对表达值详见表​表1。1虽然肿瘤微环境可能起作用，但抑制性受体表达增强的原因仍有待阐明。

表1

肿瘤特异性T细胞选择性抑制受体的表达

在单独的窗口中打开

微阵列和qPCR。

在两个实验中进行了基因表达谱分析。第一个实验包括来自血液来源的原始、EBV和肿瘤特异性T细胞的样本。第二个实验包括来自血液和转移的肿瘤特异性T细胞，以及来自血液的CMV特异性T淋巴细胞。冷冻样品被送往Miltenyi Biotec，并根据供应商推荐的基因表达分析方案进行处理。样品与安捷伦全人类基因组寡核苷酸芯片4x44K杂交，并使用安捷伦芯片扫描系统（安捷伦）进行扫描。安捷伦特征提取软件用于图像文件的读取和处理。使用软件包手册中描述的Agi4x44PreProcess软件包进行背景校正、数据过滤和分位数归一化。Limma软件包用于识别差异表达基因并创建等级排序列表。我们分析了B细胞、单核细胞和树突状细胞的最终污染，发现IGHG1、CD19、TLR和CD1的表达水平分别为CD3E表达的0.28%和2.72%，证实了我们样品的高纯度。我们还评估了可能导致高背景的组内变异性。为此，我们随机分割了13个原始CD8的数据⁺T细胞样本分为3对，每组2组，每组6个和7个样本，并分析各组之间的差异。我们发现，在任何配对中，基因探针都没有差异，表明背景较低（数据未显示）。对于非原始单元格（图​（图2），2)EBV和肿瘤特异性CD8的数据⁺收集T细胞。使用GO术语映射器将基因分配到广义GO术语(http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTerm映射器)，得出归因于给定GO项的提交基因的百分比与归因于该GO项所有注释基因的百分比。通过将归因于GO术语的提交基因的百分比除以该GO术语注释的所有可用基因的百分比来计算相对过度表达。使用GSEA分析排名基因列表（根据B值排序）(www.broadinstitute.org/gsea; 裁判。49). 如果满足以下条件，则认为富集显著P（P）如在线工具所示，小于0.05，FDR小于0.25。

qPCR用于验证在微阵列实验中观察到的富集基因。使用环球罗氏图书馆分析设计中心的在线工具设计定制寡核苷酸（Microsynth）（补充表5）。使用的反应混合物为Power Sybr Green Master mix（Applied Biosystems），并使用Applied biosystems7900HT Fast Real-Time PCR系统监测扩增情况（酶激活15分钟，循环40次，每次15秒95°C，1分钟60°C）。哈密尔顿液体处理机器人系统用于装配384孔板。将用于微阵列分析的扩增cDNA样品稀释（1:50），并在通过引物确认线性和单产物扩增后用于qPCR。样品测量一式三份。GAPDH被用作看家基因来计算相对表达值。

统计。

对于定量比较，学生的t吨使用Prism 5.0进行测试（双样本双尾比较）或单因素方差分析与Tukey后测（多样本比较）；P（P）<0.05被认为是显著的。P（P）使用在线工具中的1000个排列计算GSEA的值和FDR。微阵列分析是按照相对严格的标准进行的，即，如果P（P）经FDR校正为0.05的值为P（P）≤0.05，倍数变化≥3。

我们感谢患者的专注合作。我们感谢M.Delorenzi、F.Schütz、H.-P.Pircher、M.Etzrodt、M.Pittet、M.Matter、O.Michielin、L.J.Old、J.O'Donnell-Tormey、E.W.Hoffman和A.Krieg作出的重要贡献；D.Zehn、P.Ohashi、H.R.MacDonald、J.Skipper和H.F.Oettgen提供支持；与P.Schneider、L.Derre、M.Braun、C.Christiansen-Jucht、C.Jandus、J.-P.Rivals、T.Lövgren和M.Iancu合作并提供建议。我们感谢P.Guillaume和I.Luescher提供四聚体，感谢辉瑞和Coley Pharmaceutical Group（美国）提供CpG 7909（PF-3512676）。这项工作得到了路德维希癌症研究所、癌症研究所（美国）、癌症疫苗合作组织、大西洋慈善组织（美国），威廉·桑德基金会（德国），瑞士癌症联盟（赠款02279-08-2008），瑞士国家科学基金会，和瑞士国家分子肿瘤学研究能力中心。