材料和方法
使用动物是基于怀俄明州大学动物使用委员会批准的协议。转基因GAD67-GFP（Δneo）老鼠。GFP的选择性表达受内源性GAD67基因启动子的控制(Tamamaki等人，2003年;Jiao等人，2006年). 在该菌株中，GFP在所有（~95%）GABA能中间神经元中表达。在第4层皮层，约80%的GFP阳性神经元是PV阳性快刺（FS）篮细胞(2009年周日). 在本研究中，2/3层皮层中约50%的GFP阳性神经元为FS细胞，其余GFP阳性细胞主要为规则尖峰非锥体（RSNP）神经元（数据未显示）。我们将GAD67 GFP阳性小鼠分为以下两个年龄组：P6-10为CP前组，P20-40为CP后组。选择适当年龄组的理由如下：在桶皮层2/3层中，感受野特性的发展在P12到P14之间表现出非常窄的CP(Stern等人，2001年). 连接L4和L2/3桶状皮层的主要上行投射直到P15才完全发育(Micheva和Beaulieu，1996年;Stern等人，2001年;Bender等人，2003年;Bureau等人，2004年). 同时，NR2A亚单位的表达从P7开始，在P20达到峰值(Monyer等人，1994年). 我们进一步将CP前组分为P6-7和P8-10亚组，CP后组分为P20-30和P31-40亚组(). 在本研究中，分析了CP前组和CP后组之间以及CP前组与CP后组内NMDAR成分的差异。此外，根据放电模式，CP后中间神经元可进一步分为FS和RSNP神经元(川口和久保田，1997年). 然而，前CP组的中间神经元不能根据放电模式分为不同的亚组（相反，它们统称为未成熟多放电神经元）(Massengill等人，1997年)，形态特征()或PV表达(Alcantara等人，1993年). 因此，我们只分离了后CP组的中间神经元，并对前CP和后CP（FS+RSNP）、前CP和后CP（FS）以及前CP和前CP（RSNP。
EPSCNMDAR公司在2/3层皮层的GABA能中间神经元中。A1、，实验设计。A2、，2/3层大脑皮层记录范式示意图。中间神经元的胞体呈圆形。虚线划分了桶皮层的不同层。地下一层、地下二层，分别在P6（B1）和P24（B2）小鼠中，神经生物素填充GAD67-GFP阳性神经元。比例尺，20μm。刺激电极放置在距离记录细胞20–50μm的位置。C、，在具有代表性的P9（左）和P24（右）GABA能中间神经元中，5个连续的EPSCs在+40 mV的保持电位下以指示的刺激强度（V）诱发。阈值强度用（*）表示。D、，输入（刺激强度）和输出（反应幅度）关系曲线。注意，P24神经元激发可靠EPSCs所需的最小刺激强度较小；P24神经元诱发的EPSCs波幅较大。
切片准备
GAD67-GFP阳性小鼠，年龄从P6到P40，用奈米他丁（40 mg/kg）深度麻醉并斩首。迅速取出大脑，并将其转移到含有以下物质（单位：mM）的冷（~4°C）含氧切割溶液中：2.5 KCl，1.25 NaH2人事军官4，10 MgSO4，0.5氯化钙211葡萄糖和23.4蔗糖。根据Agmon和Connors描述的方法制备丘脑皮质（TC）切片(Agmon和Connors，1991年;Agmon等人，1995年). 我们之所以使用TC切片，是因为这种制剂最大限度地保留了第4层和第2/3层之间的皮质内连接(Micheva和Beaulieu，1996年;Stern等人，2001年;Bender等人，2003年;Bureau等人，2004年). 使用振动仪（TPI，密苏里州圣路易斯）切割切片（200μm），并在35°C的保温室中培养1小时，随后在室温下培养，然后转移到记录室。将切片固定在改良的显微镜载物台上，并在记录前使其平衡至少30分钟。切片被最小程度地浸入水中，并连续过量使用含氧（95%O2-5%一氧化碳2)含有以下物质的人工脑脊液（aCSF）（单位：mM）：126 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2人事军官4，2 MgSO4，2氯化钙2，26氯化钠三和10葡萄糖，pH 7.4，速率为4.0 ml/min。
全细胞补丁记录
记录是在35±1°C下从2/3层大脑皮层的GFP阳性神经元获得的(). 将毛细管玻璃移液管记录电极（1.5–2μm针尖直径，3–6 mΩ）填充含有（mM）：120葡萄糖酸铯、10磷酸肌酸三钠、3 MgCl的溶液2，0.07氯化钙2、4 EGTA、10 HEPES、4 Na2-ATP和1 Na-GTP（用Cs-OH调节pH 7.4，280 mOsm）。定期将神经生物素（0.5%；加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs）添加到贴片吸液管溶液中，用于神经元的形态重建。将一个锐利的双极钨电极放置在记录的神经元附近，以低频（0.1 Hz）传递突触刺激(). 刺激强度保持在超过突触后反应阈值的~15%。阈值被定义为大部分故障(Dobrunz和Stevens，1997年). 例如，在五个连续的记录中，刺激可能只在一个或两个记录中诱导突触后反应。在电压钳中，膜电位保持在+40 mV，以显示EPSCNMDAR公司用多灯700B放大器和pClamp软件（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件）记录EPSC。连续监测串联电阻。电阻变化大于15%的实验被拒绝。EPSCNMDAR公司在存在10μM 2，3-二氢-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并（F）喹喔啉（NBQX）（密苏里州埃利斯维尔Tocris Bioscience）以阻断非NMDA受体和50μM苦rotoxin（PTX）（Tocris）以阻断GABA的情况下诱发A类受体。用相邻的刺激在锥体神经元中诱发单突触抑制性突触后电流（IPSC），并在谷氨酸拮抗剂NBQX（10μM）和D（-）-2-氨基-5-磷酸五烯酸（D-APV）（Tocris）（100μM）存在下以0 mV的保持电位记录。最小刺激强度是根据Allen&Stevens描述的方法定义的(艾伦和史蒂文斯，1994年). 通过局部灌注系统施用以下化学品，可在不同介质之间快速切换：100μM D-APV（Tocris）、3μM ifenprodil（Tocri）、0.5μM Ro25-6981[（αR（右）,βS公司)-α-（4-羟基苯基）-β-甲基-4-（苯基甲基）-1-哌啶丙醇]（Sigma），0.5μM(R（右）)-[(S公司)-1-（4-溴-苯基）-乙基氨基]-（2,3-二氧代-1,2,3,4-四氢喹喔啉-5-基）-甲基]-膦酸（NVP-AAM077）（瑞士诺华公司赠送），0.5μM（2S*，3R*）-1-（菲-2-羰基）哌嗪-2,3-二羧酸（PPDA）（Ascent Scientific，普林斯顿，新泽西州）。
荧光标记
TC切片（40μm）在0.6%H中培养2O（运行）230分钟后，PBS清洗，切换至50%酒精10分钟，PBS洗涤，然后在室温下用0.5%Triton X-100、2%BSA和10%正常山羊血清在TBS中培养2小时，并在4℃下在针对PV（1:1000；Calbiochem）和VGluT2（1:250；Chemicon）的一级抗体中培养过夜。第二天，PBS清洗后，将切片在Alexa Fluor 594和山羊抗兔IgG（重链和轻链；1:1000；Invitrogen，Carlsbad，CA）以及Alexa Fluor 350和山羊抗鼠IgG中孵育3小时，用于PV和VGluT2，然后清洗、安装和盖玻片。使用配备AxioCam数字彩色相机的表观荧光显微镜（Zeiss，Thornwood，NY）检查免疫荧光标本。VGluT2染色鉴定2/3层、4层和5层皮层。手动定义第2/3、4和5层的轮廓区域，并使用Axiovision 4.6（纽约州桑伍德蔡司）中的交互式测量功能计算轮廓区域内的细胞数。细胞密度的计算如前所述(Jiao等人，2006年). 所用的其他主要抗体是多克隆兔抗钙结合蛋白（1:1000；Sigma）、多克隆兔抗钙视网膜蛋白（1:500；Sigma-）和单克隆鼠抗GAD67（1:1000，Chemicon）。
固定、免疫化学和组织学
记录后，将切片固定在100 mM磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4，含4%多聚甲醛，4°C）中至少24小时。通过在1%h中培养切片来阻断内源过氧化物酶2O（运行）2在PB溶液中多次冲洗后，将切片转移到含有0.1%Triton X-100（0.1 M，pH 7.4；ABC-Elite Camon，Wiesbaden，Germany）的1%亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物中，并在4°C下过夜，同时轻轻摇晃。然后使用3，3-二氨基联苯胺（DAB；Sigma）和0.01%H使切片反应2O（运行）2直到树突和轴突乔木清晰可见（约2-5分钟）。切片安装在玻璃载玻片上，嵌入DPX安装介质（奥尔德里奇，密尔沃基），并盖玻片用于图像分析。
数据分析
图中显示的痕迹是10到20个连续EPSCs的平均值，所有数值均表示为平均值±SEM。多组比较使用单向方差分析，组内比较使用Bonferroni事后检验。双尾学生吨对两组进行比较。重要性被置于P（P）<0.05. EPSC的上升时间常数是使用Clampfit（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）从平均记录的标准单指数拟合中计算出来的。衰减时间常数由标准双指数函数或标准单指数函数（Clampfit）拟合。电导-电压(g-V型)每个神经元的曲线按照Kumar的描述进行计算(Kumar和Huguenard，2003年)使用以下公式：
在哪里？我是10个连续EPSC的平均峰值振幅，同时将膜电位保持在恒定电压。V（V）是保持电位。E类转速是每个神经元的反转电位。最大电导(克最大值)通过拟合每个神经元g-V型使用Origin 6.1（Microcal Software，马萨诸塞州北安普敦）使用以下方程式拟合Boltzmann曲线：
结果
EPSC的隔离NMDAR公司在2/3层大脑皮层的前CP和后CP GFP阳性GABA能中间神经元中
全细胞膜片钳记录是从GAD67-GFP小鼠2/3层皮层中目测确定的GFP-阳性GABA能中间神经元获得的。中间神经元分为两组：CP前（产后6-10天，平均年龄=7.9±0.2天，n=65）和CP后（P20-40，平均年龄=26.6±0.7天，n=65）。通过靠近记录细胞的钨双极电极诱发EPSC(). 出生后早期的神经元树突树突较少，树突突起较短(). 第2/3层桶状皮层中的神经元接收来自第4层上升投射的感觉输入，而不是丘脑(Micheva和Beaulieu，1996年;Stern等人，2001年;Bender等人，2003年;Bureau等人，2004年)，因此EPSC主要是从第4层到2/3层的投射在皮质内诱发的，以及来自同一层锥体细胞的兴奋性突触(Holmgren等人，2003年). 在每一次记录中，刺激强度被调整到阈值以上约15%，以可靠地诱发单个EPSC而不会失败(). 隔离EPSC纳米达尔在50μM PTX存在下，神经元膜电位保持在+40 mV，以阻断GABAA类受体和10μM NBQX来阻断非NMDA受体。在P6，不到15%（8/55）的记录中间神经元诱发了EPSCNMDAR公司; P7时，约40%（20/53）；P8-10时，超过85%（37/43）；第20–40页，94%（65/69）。突触EPSCs纳米达尔P5或较年轻的神经元不能诱发EPSCs，并且在极少数情况下，当有诱发的EPSCs时，它们非常不稳定，难以进行统计分析或药理学研究。EPSC的输入/输出关系曲线示例NMDAR公司如所示与后CP组相比，前CP神经元通常需要更高的刺激强度才能激发可靠的EPSCsNMDAR公司()和诱发EPSCs的峰值振幅NMDAR公司通常较小（例如。). 这两个组之间的详细比较将在后续章节中显示。
EPSC电压依赖特性的差异NMDAR公司在preCP和postCP组中
EPSC的电压相关特性NMDAR公司通过测量EPSCs的峰值振幅来检测CP前和CP后GFP阳性GABA能中间神经元NMDAR公司在−80到+40 mV的不同保持电位下对于前CP组和后CP组，平均反转电位(E类转速)接近0 mV（平均值E类转速前CP为1.3±1.4 mV，n=6，后CP为−2.6±2.2 mV，n=13）。这个I-V型曲线显示，两个年龄组的I/V斜率都有显著的内向整流区，然而，两组的内向电流在稍有不同的保持电位下达到峰值（CP后为−35±3.1 mV，CP前为−30±3.7 mV，p>0.05）(). 电导-电压(g-V）每个神经元的关系由个体计算I-V型预CP（n=6）组和后CP（n=13）组的曲线。为了量化两组之间的电压依赖性差异，g-V型将每个神经元的关系归一化为各自的最大电导(克最大值)根据每个单独的Boltzmann拟合计算，以及平均值克/克最大值关系如所示.平均半最大膜电位(克/克最大值=0.5）CP后组（−20.3±2.0 mV）的超极化显著高于CP前组（–11.1±1.7 mV，p<0.05）。这表明EPSC的电压依赖特性NMDAR公司两组之间的差异。
药物分离EPSCs的电压依赖性特性NMDAR公司.A1、A2、EPSC的平均记录道NMDAR公司分别从具有代表性的P8（A1）和P28（A2）神经元，在指示的保持电位范围为-80至+40 mV时记录。注意，P28神经元的内向和外向电流振幅较大。B、，平均值I-V型前CP（n=6）和后CP（n=13）的神经元曲线。C、，标准化（Normalized）g-V型显示V向左移的数据0.5对于postCP组（VCP后0.5=−13.8±2.0毫伏vs.V0.5预CP=−6.3±5.7毫伏，p<0.01）。实线是最适合的玻尔兹曼方程，我/我最大值={1+exp[(V（V）+V（V）1/2)/K（K）]}−1，其中V1/2=−5.1±3.9 mV，预CP和V中的K=0.0151/2=−6.7±2.1 mV，在CP后K=0.004。
EPSC其他特性的差异NMDAR公司
CP后中间神经元亚型进一步分为FS组和RSNP组。FS和RSNP细胞GABA表达存在明显差异A类受体(Bacci等人，2003年)，缝隙连接(Beierlein等人，2003年)代谢型谷氨酸受体特性(Sun等人，2009年)以及对感觉剥夺的敏感性(2009年周日). 在电压灯模式下，在断开之前，我们施加少量电流以获得对记录电池的电气访问。我们调整注入电流的量，以避免断开和形成全细胞模式。在此条件下，接入电阻范围为400–700MΩ，这足以记录中间神经元动作电位（AP）下截短的内向钠电流（例如。). 保持电位保持在负值−60 mV，以防止Cs+扩散到细胞质中。在这些条件下，记录并分析了CP前和CP后中间神经元AP放电模式下的钠电流。在后CP组中，AP的放电模式不同()并与之前定义的FS和RSNP组一致(Kawaguchi等人，1995年;2009年周日). 在本研究中，只有当细胞的AP特性满足以下三个标准时，才将其定义为FS神经元：τ衰退<2.5 ms，半宽<2.0 ms，点火频率>100 Hz(). 只有当中间神经元的AP属性满足三个标准时，才将其定义为RSNP神经元：τ衰退>3.5 ms，半宽>2.5 ms，点火频率<100 Hz(). 不符合上述标准的神经元从RSNP或FS组中剔除（但作为后CP组的一部分保留）。此外，神经生物素填充神经元的重建也可以为后CP组提供有用的形态学信息(补充图1A和B). 根据电生理分析，我们将65个记录在案的CP后中间神经元分为FS（n=22）和RSNP（n=20）组。由于前CP中间神经元没有完全分化，它们表现出相似的放电模式(Massengill等人，1997年)和形态特征。神经生物素填充神经元的重建不能为前CP组提供有用的形态学信息().
CP后组FS和RSNP神经元的分离。A、，代表性动作电位（AP）来自FS（顶部）和RSNP（底部）神经元。插图：方块所示FS和RSNP神经元的AP归一化轨迹。B1、B2、，基于放电频率、半宽度和加权τ的FS和RSNP神经元分离衰退AP的数量。C1、，10个连续EPSCNMDAR公司分别位于代表性的P7（顶部）、P23 RSNP（中部）和P23 FS（底部）神经元中。C2中，变异系数(个人简历)在CP前和CP后RSNP和CP后FS神经元中。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：无显著性，如本图和下图所示。
EPSCs的特性NMDAR公司在CP前和CP后，GFP-阳性GABA能中间神经元在保持电位+40 mV下进行测试，并用5个参数表征：峰值振幅、平均值变异系数（CV）峰值振幅、半宽度（半最大振幅时的宽度，HWs）、上升时间常数（τ上升)和衰减时间常数（τ衰退). 平均值个人简历EPSC的NMDAR公司CP前组神经元明显大于CP后RSNP组（p<0.01）和CP后FS组（p<0.001；)分别是。EPSC的峰值振幅NMDAR公司CP前组的神经元明显小于CP后RSNP组（p<0.001）和CP后FS组（p<0.001，)分别是。EPSC的硬件NMDAR公司CP前组神经元明显大于CP后RSNP组（p<0.001）和CP后FS组（p<0.001，)分别是。τ上升EPSC的NMDAR公司CP前组明显慢于CP后RSNP组（p<0.01）和CP后FS组（p<0.01，)分别是。基于双指数拟合的结果（τ快速衰减和τ衰变-流动)，EPSCNMDAR公司与CP后RSNP组和CP后FS组相比，CP前组的衰减速度明显较慢()分别是。使用单指数拟合，τ衰退CP前组（145.4±6.2 ms）也明显慢于CP后组（63.0±2.9 ms，p<0.001，补充图2A1-A3). 在CP后组中，P20–30和P31–40亚组在同一细胞类型的衰变时间和半宽度方面没有显著差异（FS或RSNP，参见补充图2). 这表明，这些特性的发育变化发生在CP期间。
EPSCs特性的发育变化NMDAR公司.A1、，EPSC的平均记录道NMDAR公司分别位于具有代表性的P7（左）P23 RSNP（中）和P23 FS（右）神经元中。A2、，A1的归一化轨迹。箭头表示快速和慢速τ值衰退对于每个记录道。B、，EPSCs振幅的比较NMDAR公司在前CP（白条）、后CP RSNP（灰条）和后CP FS（黑条）神经元中。CP后组RSNP和FS神经元的峰值振幅均大于CP前神经元（***p<0.001）。EPSCs振幅无显著差异NMDAR公司RSNP和FS神经元之间。C、，EPSC半宽度的比较NMDAR公司在前CP（白色条）、后CP RSNP（灰色条）和后CP FS（黑色条）神经元中（***p<0.001）。D、，比较τ上升EPSC的NMDAR公司在前CP（白条）、后CP RSNP（灰条）和后CP FS（黑条）神经元中（**p<0.01，**p<0.001）。E、，τ的比较衰退EPSC数量NMDAR公司在前CP（白条）、后CP RSNP（灰条）和后CP FS（黑条）神经元中。（***p<0.001）。
在个人简历（p=0.7），峰值振幅（p=0.2），τ上升（p=0.7）和τ衰变-流动后CP组RSNP和FS细胞之间（p=0.2）(). 然而，RSNP神经元的半衰期显著延长（p<0.001），τ快速衰减（p<0.001）比FS(). 这些数据表明，EPSC存在许多差异NMDAR公司属性，这可能至少部分归因于NMDAR亚单位组成的差异。
由于NR2A和NR2B介导EPSC的不同阶段NMDAR公司(Monyer等人，1994年;Sheng等人，1994年)，我们还计算了EPSC的面积NMDAR公司我们比较了对照组之间的面积（术前、术后RSNP和术后FS），发现没有显著差异（单因素方差分析，p>0.05；补充图3A). EPSC领域缺乏差异NMDAR公司可以用峰值振幅和τ的相反发展变化来解释衰退preCP组神经元的峰值振幅最小，τ最长衰退; CP后FS神经元的峰值振幅最大，τ最短衰退(). 因此，在CP前和CP后FS中测量的面积（振幅*持续时间）相似。
为了研究不同的刺激强度是否会改变我们的结果，我们分析了神经元在最小和15%的最小刺激条件下的反应(补充图1C&D). 尽管在最小刺激下诱发反应较小，而在最小刺激上则为15%，但发育变化的趋势是相同的。这表明，这里证明的NMDAR特性的发育差异并不取决于所使用的刺激模式。
NR2A/NR2B比率的发展变化
接下来我们检查了EPSCs的药理特性是否有任何变化NMDAR公司在GABA能中间神经元中。局部灌注0.5μM NVP-AAM077（选择性NR2A亚单位拮抗剂，详细药理特征见下一节）(Auberson等人，2002年;刘等人，2004a;Gerkin等人，2007年)或0.5μM Ro25-6981（作为一种活性依赖、电压依赖、非竞争性NR2B亚单位拮抗剂，具有高亲和力和选择性的ifenprodil衍生物）(Mutel等人，1998年;林奇和古特曼，2001年)然后使用混合物（即NVP-AAM077和Ro 25-6981）检查NMDAR的亚基组成。如果EPSCNMDAR公司仅由NR1/NR2A或NR1/NR2B亚单位组成的NMDAR介导，应用混合物（NVP-AAM077+Ro25-6981）将消除EPSCNMDAR公司.在EPSC所在的电池中NMDAR公司未被混合物PPDA（选择性NR2C/D拮抗剂，0.5μM）完全阻断(Feng等人，2004年;Morley等人，2005年;Harney等人，2008年)用于测试EPSCs是否由NR2C/NR2D介导。APV（100μM）用于确认EPSC是否由NMDAR介导。在没有和存在每种拮抗剂或混合物的情况下记录的代表性痕迹显示在所有对抗者动作的典型时间过程如所示.
药理实验显示NR2B/NR2A比率发生了发育变化。A1、B1、，代表性EPSCNMDAR公司P8神经元（A1）和P25神经元（B1）中分别存在NVP-AAM077（0.5μM，深灰色）和NVP-AAM 077（0.5M）加上Ro 25-6981（0.5M，浅gay）。A2、B2、，代表性EPSCNMDAR公司P8神经元（A2）和P28神经元（B2）中分别存在Ro 25-6981（0.5μM，深灰色）和NVP-AAM077（0.5μM）加Ro 25-6981（0.5μM，浅灰色）的混合物。A3、B3、，代表性EPSCNMDAR公司P7神经元（A3）和P24神经元（B3）中分别存在伊芬地尔（3μM，深灰色）和NVP-AAM077（0.5μM）加伊芬地尔（3μM，浅同性恋）和PPDA（0.5μM，浅黑色）时的痕迹（黑色）。C、，NVP-AAM077、Ro 25-6981和ifenprodil对EPSCs振幅的影响NMDAR公司.D、，NVP-AAM077和ifenprodil对EPSCs振幅的影响NMDAR公司在CP后RSNP和CP后FS神经元中。
A1类–A3、B1–B3中，前CP组（A1–A3）和后CP组（B1–B3）的代表性痕迹，显示NR2A和NR2B亚单位特异性拮抗剂对EPSCs振幅的影响NMDAR公司.C、，NVP-AAM077的剂量-反应曲线符合希尔方程。箭头指示IC50浴灌溶液中有（黑点）和无（灰点）ifenprodil（3μM）的拟合曲线值。D、 E、，NR2A和NR2B亚单位特异性拮抗剂在所有GABA能细胞中的作用，无论其年龄组如何。D、，NVP-AAM077、Ro 25-6981和ifenprodil对EPSCs振幅的影响NMDAR公司.E、，图中显示“NR2B剩余EPSC”（n=48，浅灰色条），与Ro 25-6981（n=28，深灰色条）和ifenprodil（n=51，黑色条）进行比较与NVP-AAM077（n=48，黑条）相比，所有检测神经元中NR2A剩余EPSCs 1’（来自Ro 25-6981实验，n=28，浅灰色条）和“NR2A其余EPSCs 2”（来自ifenprodil实验，n=51，深灰色条），无论其年龄组如何。
局部灌注NVP-AAM077（0.5μM）阻断54.2±13.4%的EPSCsNMDAR公司第6-7页；P8-10时为62.8±5.9%；P20–30时为81.1±6.1%；P31-40时为73.5±7.4%。应用Ro25–6981（0.5μM）阻断39.1±8.7%的EPSCNMDAR公司第6-7页；P8-10时为37.9±7.7%；P20–30时为24.9±9.9%；P31-40时为21.6±7.2%(). 接下来，我们检查了另一种NR2B拮抗剂ifenprodil的作用(托瓦尔和韦斯特布鲁克，1999年;Cull-Candy等人，2001年). 应用ifenprodil（3μM）获得的结果与Ro25–6981的效果非常相似。Ifenprodil阻断了43.2±12.9%的EPSCsNMDAR公司第6-7页；P8-10时为30.4±8.1%；P20–30时为21.2±4.0%；P31-40时为10.4±2.6%(). 代表NVP-AAM077、Ro 25–6981和ifenprodil对振幅和τ的影响的典型记录道衰退CP前组和CP后组的EPSC数量如所示如果这些药理学药物如前所述具有受体亚单位选择性，则这些药理学数据表明EPSC的药理学敏感性发生了发展变化NMDAR公司开发期间：在CP-EPSC之后NMDAR公司对Ro 25–6981或ifenprodil的敏感性降低，对NVP-AAM077的敏感性增加。此外，我们分析了NVP-AAM077（0.5μM）和ifenprodil（3μM）对P20-30和P31-40处RSNP和FS神经元峰值振幅的影响。NVP-AAM077阻断67.5±6.6%的EPSCNMDAR公司P20–30时，RSNP和FS分别为79.1±4.8%；P31-40时，RSNP为64.4±11.3%，FS为80.1±8.5%。RSNP和FS神经元之间无显著差异(). Ifenprodil阻断了20.4±5.2%的EPSCNMDAR公司P20–30时，RSNP和FS分别为20.4±4.4%和20.4±4.4；P31-40时，RSNP为21.4±13.1%，FS为16.1±6.6%。RSNP和FS神经元之间无显著差异(). 在P6-7和P8-10亚组之间，NR2A（NVP-AAM077）或NR2B（ifenprodil）拮抗剂介导的效应没有显著差异()或在相同细胞类型（FS或RSNP，). 这表明在CP期间发生了药理学特性的发育变化。
NR1/NR2A组合的衰变时间为几十毫秒，NR1/NR2B和NR1/NR2组合的衰亡时间为数百毫秒(Vicini等人，1998年)、和秒（对于NR1/NR2D通道）(Monyer等人，1994年). 我们早期的研究结果表明，年轻的EPSCs纳米达尔τ慢得多衰退(). 如果药理药物具有建议的选择性，这些拮抗剂的应用预计会对τ产生不同的影响衰退事实确实如此。τ衰退应用NVP-AAM077后，不仅增加了τ衰退NVP-AAM077在两个年龄组中也存在差异。在preCP组（n=16）中，τ快速衰减增加10.9±17.3 ms（p=0.3），τ衰变-流动增加298.9±141.6ms（p<0.05）。在postCP组（n=11）中，τ衰变快增加35.6±18.7ms（p<0.05），τ衰变-流动增加168.3±81.0 ms（p<0.05）(). Ro25–6981和ifenprodil对τ的影响相反衰退：即导致τ减小衰变。τ的减少衰退两个年龄组之间也存在差异。在preCP组（n=14）中，τ快速衰减降低63.4±20.1ms（p<0.01），τ衰变-流动减少289.6±65.3 ms(p<0.0001）。在postCP组（n=12）中，τ快速衰减降低6.5±4.1 ms（p=0.1），τ衰变-流动减少33.5±72.5 ms（p=0.7）(). ifenprodil的作用类似于Ro 25–6981。在preCP组（n=20）中，τ快速衰减降低37.1±8.8 ms（p<0.001），τ衰变-流动下降173.6±51.8ms（p＜0.001）。在postCP组（n=35）中，τ快速衰减降低0.1±1.9 ms（p=1.0），τ衰变缓慢减少72.2±29.6ms（p<0.05）(). 快速τ的变化衰退在应用Ro 25–6981或ifenprodil后，CP后组未达到统计学意义。这些结果表明，τ快速衰减在CP后组中不太可能由NR2B介导。相反，τ的变化快速衰减在应用NVP-AAM077后，在预CP组中没有达到统计学显著性。这可能表明τ快速衰减在preCP组中不太可能由NR2A介导。因此，我们单独使用ifenprodil（或Ro25-6981）或NVP-AAM077的数据显示，CP前组与CP后组之间存在显著差异。因此，药物的作用与EPSCs一致NMDAR公司τ衰退数据表明NR2B对NR2A亚基对EPSCs的贡献发生了转移NMDAR公司GABA能神经元在发育过程中。
表1
NR2A和NR2B拮抗剂对快和慢τ的影响衰退EPSC的NMDAR公司在CP前和CP后中间神经元之间。
| 预阴极保护 | 后CP |
|---|
|
|---|
| 快速衰减τ（ms） | 慢衰减τ（ms） | | 快速衰减τ（ms） | 慢衰减τ（ms） | |
|---|
|
|---|
| 之前 | 之后 | 之前 | 之后 | n个 | 之前 | 之后 | 之前 | 之后 | n个 |
|---|
| NVP-AAM077型 | 124.4 ± 12.1 | 135.3 ± 14.0 | 491.1 ± 60.80 | 790.0 ± 143.1* | n=16 | 52.7 ± 8.5 | 88.2 ± 26.0* | 287.4 ± 65.2 | 455.7 ± 90.6* | n=11 |
| 伊芬诺地尔 | 101.5 ± 4.5 | 64.4 ± 6.5*** | 455.1 ± 50.4 | 281.5 ± 44.5** | n=20 | 40.1 ± 2.8 | 39.9 ± 2.6 | 286.2 ± 28.1 | 214.0 ± 22.3* | n=35 |
| Ro 25-6981号 | 110.9 ± 15.7 | 47.4 ± 10.5** | 543.7 ± 72.3 | 254.2 ± 40.7*** | n=14 | 45.0 ± 4.5 | 38.5 ± 3.9 | 250.3 ± 49.8 | 216.8 ± 47.8 | n=12 |
我们还比较了应用拮抗剂后按面积计算的抑制水平。面积由EPSC的峰值振幅和持续时间决定NMDAR公司NR1/NR2A组合具有较大的峰值振幅(Monyer等人，1992年)与NR1/NR2B相比，衰减时间过程更短(Vicini等人，1998年). 理论上，当NMDARs主要由NR1/NR2A和/或NR1/NR2B组成时，阻断NR2A亚基会降低EPSC的峰值振幅NMDAR公司增加NMDAR的衰减时间EPSC相反，阻断NR2B亚单位将降低EPSCs的振幅和衰减时间NMDAR公司为了了解情况是否如此，我们将峰值振幅计算结果与面积计算结果进行了比较。我们发现EPSCs的百分比NMDAR公司由面积计算的被NVP-AAM077（NR2A拮抗剂）阻断的面积小于由峰值振幅计算的面积。相比之下，EPSC的百分比NMDAR公司以面积计算的ifenprodil或Ro25–6981（NR2B拮抗剂）阻断作用大于以峰值振幅计算的阻断作用( 与。 补充图3B; 与。 补充图3C). 这些结果表明NR2A和NR2B亚单位介导的EPSCsNMDAR公司表现出鲜明的特点。
此外，在同一年龄组（如前CP和后CP）内，诱发EPSCs的振幅存在差异NMDAR公司最低刺激强度低于15%。检查EPSCs振幅的可变性NMDAR公司影响拮抗剂的作用，我们还分析了ifenprodil（NR2B拮抗剂）的作用与EPSCs振幅的关系NMDAR公司对于每个年龄组，根据峰值振幅将神经元进一步分为两个亚组。尽管EPSCs的诱发振幅存在显著差异NMDAR公司在小组之间(补充图1E)，ifenprodil的疗效无显著差异(补充图1F). 这些结果表明，EPSCs的诱发振幅NMDAR公司对拮抗剂的作用没有显著影响。
NMDAR拮抗剂的特异性
尽管据报道NVP-AAM077对NR2A亚单位具有很高的亲和力(Auberson等人，2002年;Liu等人，2004年a;Gerkin等人，2007年)也有报道称，NVP-AAM077在表达于爪蟾NVP-AAM077抑制谷氨酸和甘氨酸诱导的电流反应能力检测卵母细胞(内顿和保莱蒂，2006年;de Marchena等人，2008年). 检查本实验中使用的拮抗剂浓度是否足以区分突触激活EPSC下的不同受体亚型NMDAR公司，我们接下来测试NMDAR拮抗剂的特异性。在我们的剂量反应实验中，我们在浴灌流溶液中测试了不同浓度的NVP-AAM077（0.01、0.05、0.1、0.5和5μM），无论是否加入伊芬地尔（3μM）()在P8-10（n=6）和P20-21（n=5）中间神经元中。如剂量反应曲线所示，0.5μM NVP-AAM077在浴灌流中用3μM ifenprodil阻断了95.7±3%的NMDAR EPSCs，阻断了72.9±5%的EPSCsNMDAR公司没有ifenprodil。3μM ifenprodil单独阻断28.6±3.4%（n=55）的EPSCsNMDAR公司这与混合物（即NVP-AAM077加ifenprodil）和单独NVP-AAM 077之间的差异非常相似（95.7%−72.9%=24%）。此外，IC没有显著差异50存在或不存在ifenprodil时NVP-AAM077的值(). 这些结果表明，0.5μM NVP-AAM077是用于NR2A药理分离的合适浓度与NR2B介导的EPSCsNMDAR公司在类似实验条件下使用的脑切片中。
拮抗剂对不同亚基的特异性应与动物年龄无关。我们发现这是真的。当我们结合两个年龄组的数据时，NVP-AAM077（0.5μM）单独阻断70.3±3.7%的EPSCNMDAR公司（n=27）；Ro25-6981（0.5μM）单独阻断31.5±4.3%（n=26），ifenprodil（3μM）独自阻断28.6±3.4%（n=55）(). 如果我们使用的浓度过高或过低，当我们添加NVP-AAM077单独与Ro25-6981单独（或NVP-AAM 077单独加ifenprodi1alone）的影响时，百分比将分别大于或小于100%。我们发现上述情况似乎都不是真的。当NVP-AAM077单独和Ro 25-6981单独或NVP-AAM 077单独与ifenprodil单独添加在一起时，其效果非常接近100%（参见). 此外，使用混合物（NVP-AAM077+Ro 25-8198或ifenprodil）阻断了98.4±0.3%的EPSC纳米达尔首先使用NVP-AAM077时，首先使用Ro 25-6981时为99.8±0.1%，首先使用ifenprodil时为92.7±2.1%(). 涂抹混合物后，使用APV（100μM）完全消除了EPSCs的残留NMDAR公司在NVP-AAM077（首先应用）或Ro 25-6981（首先应用）组中，并抑制99.8±0.2%的EPSC残留NMDAR公司在ifenprodil（applied first）组中(). 这些数据表明，在我们实验中使用的当前浓度下，这些拮抗剂（NVP-AAM077、Ro 25-8198和ifenprodil）选择性地阻断了不同组的NMDAR。这些数据表明，GABA能中间神经元中的NMDAR主要由NR1、NR2A和NR2B亚单位组成。
如果NMDAR主要由NR1、NR2A和NR2B亚单位组成，则在应用NR2A特异性拮抗剂后，其余EPSCsNMDAR公司由NR2B亚单位介导，并且反之亦然为了进一步证实，我们通过以下等式计算了剩余的NR2A-a和NR2B-介导的EPSC：
和
根据方程式（3）为29.4±3.7%（n=27），与单独使用Ro 25-6981（31.5±4.3%，n=26）或单独使用ifenprodil（28.6±3.4%，n=55）的效果无统计学差异（p>0.05）。剩余NR2A介导的EPSC平均值计算如下方程式（4）和(5)分别为68.4±4.3%（n=26）和64.2±4.2%（n=55），与单独使用NVP-AAM077产生的抑制百分比（70.3±3.7%，n=28）没有统计学差异（p>0.05）。此外，NR2A EPSCs之间没有统计学意义剩下的1和2（p>0.05）(). 按面积计算的结果与按峰值振幅计算的结果相似(补充图3D&E 与。 ). 锥体神经元和中间神经元之间NVP-AAM077选择性的差异可能是由于NMDAR成分的差异。我们的结果表明，在中间神经元中，NR2A和NR2B亚单位形成不同的受体（详见下文）。这可能不是主要神经元的情况。
CP前和CP后组中NR1/NR2A/NR2B和/或NR1/NR2C/NR2D介导的电流
在preCP组（n=65）中，局部灌注混合物（NVP-AAM077加ifenprodil或NVP-AAM 077加Ro 25-6981）消除了99.7±0.2%的EPSCNMDAR公司65个神经元中的64个，局部灌注APV（100μM）完全消除了残留的EPSCs纳米达尔有一个神经元（P9），其中混合物仅清除68.5%的EPSCsNMDAR。剩余EPSCNMDAR公司被NR2C/D拮抗剂PPDA（0.5μM）完全阻断。
在后CP组（n=65），混合物（NVP-AAM077加ifenprodil，或NVP-AAM 077加Ro 25-6981）阻断了99.7±0.1%的EPSCNMDAR公司65个神经元中有56个。剩余EPSCNMDAR公司被APV完全阻断。65个神经元中有9个神经元，其中混合物仅阻断了69.3±4.7%的EPSCsNMDAR公司在9个神经元中的2个（P20和P21）中，残留的EPSCsNMDAR公司PPDA完全阻断（分别为21%和53.2%）。然而，PPDA对残留EPSC没有影响NMDAR公司其余7个神经元。7个神经元的残余EPSCs被APV阻断98.5±1.2%。
这些结果表明，在前CP组和后CP组中，极少数细胞（前CP中的1/65和后CP中的2/65细胞）含有NR2C/D的NMDAR，类似于第4层皮层中的棘状星状神经元(Binshtok等人，2006年). 在后CP组（7/65）而不是前CP组（0/65）中，NR1/NR2A/NR2B中的NMDAR可能有助于EPSCNMDAR公司（两组比较有显著性差异（p<0.01）。这是因为残留的EPSCNMDAR公司在CP后组的7/65个细胞中，未被NR2A、NR2B或NR2C/D拮抗剂阻断，但被APV完全消除，这表明残留的EPSCs纳米达尔可能由NR1/NR2A/NR2B介导(Sheng等人，1994年;Kumar和Huguenard，2003年)可能会降低对拮抗剂的敏感性(哈顿和保莱蒂，2005年).
出生后早期慢性阻断NR2A降低GAD67 GFP中间神经元2/3层和4层皮层PV的表达
如果NR2A的发育增加而NR2B介导的EPSCs的发育减少NMDAR公司在中间神经元中，正如我们在本研究中所证明的，在发育的CP期间，这在中间神经元的成熟中起到任何功能作用吗？PV表达发生在桶和视觉皮层的CP(阿尔坎塔拉和费勒，1994年;Yan等人，1996年;Czeiger and White，1997年;梅尔和麦卡斯兰，1997年;Letinic和Kostovic，1998年;Hada等人，1999年;Moon等人，2002年). PV细胞网络控制眼优势可塑性的发生(Hensch，2005年;Sugiyama等人，2008年). 几个小组(Itami等人，2007年;Liuz-Legznar等人，2009年;Belforte等人，2010年)包括我们的(Jiao等人，2006年;2009年周日)研究表明，PV的表达量在CP期间受感觉活动的调节。因此，我们检测了NR2A或NR2B慢性阻断对GAD67–GFP阳性中间神经元PV表达的影响。第2/3层PV阳性神经元密度显著降低（170±10/cm2注入NVP与。230±10/cm2对照组p<0.01）和第4层（310±20/cm2注入NVP与。460±40/cm2在对照组中，注射NVP的小鼠（n=6只）与对照组小鼠（n=6只）相比，大脑的桶状皮层p<0.001，). 接下来，我们测试了PV阳性细胞的减少是否是由于PV型GABA能细胞增殖减少/凋亡增加，或是GABA能亚群中PV表达下调所致。使用GAD67–GFP小鼠，其中>95%的GABA能细胞在运动皮层GAD67启动子下表达GFP(Tamamaki等人，2003年)在体感皮层(Jiao等人，2006年)，我们计数了GFP阳性细胞。注射NVP-AAM077的桶中GAD67–GFP阳性神经元的密度与对照组相似(). 第2/3层，510±20/cm2注入NVP与。510±20/cm2对照组（p=0.9）；第4层，610±40/cm2注入NVP与。600±40/cm2对照组（p＝0.8）。PV/GFP比值显示NVP注射脑内第2/3层和第4层显著降低(). 在第2/3层中，对照组为0.45±0.02与。注射NVP时为0.34±0.02（p<0.01）；第4层，对照组为0.76±0.03与。注射NVP 0.51±0.03（p<0.001）。然而，GAD67–GFP神经元的总数与GABA能神经元的总数相似，总体上保持不变。我们的结论是，从出生后早期（P7）开始慢性阻断NR2A可导致第2/3层和第4层GABA能中间神经元PV表达的深度下调。我们还研究了NR2A的慢性阻断是否存在PV表达下调的敏感期。在NVP-AAM077注射在P18停止的GAD67-GFP小鼠（对照组和注射NVP的分别为4只）中，我们没有发现PV细胞密度的显著变化。第2/3170±2/cm层2在控制中与。150±9/cm2注入NVP-AAM077（p=0.8）；第4层，310±40/cm2在控制中与。360±20/cm2注入NVP-AAM077，（p=0.3，n个分别=12片；). 因此，我们的结果表明，NR2A从P7到P25的慢性阻断，而不是从P7至P18的慢性阻断会损害PV的发育表达。最后，我们检测了NR2A慢性阻断对GAD67–GFP连体中钙结合蛋白和钙视网膜素表达的影响。对照组（n=4只小鼠）中钙结合蛋白和钙视网膜蛋白的表达无显著差异与.NVP-AAM077注射小鼠（n=4只小鼠，). 相反，通过从P7中注射Ro 25-6981（即P25或P18）来慢性阻断NR2B，不会引起GAD-67 GFP中间神经元PV表达的显著变化()表明NR2A而非NR2B对PV的发育表达很重要。
NVP-AAM077和Ro25-6981注射液对GAD67-GFP小鼠（TC切片）大脑皮层PV表达的影响。A、 B和C，对照小鼠（a）、注射NVP-AAM077（来自P7-P25）小鼠（B）和注射Ro25-6981（来自P7–P25）鼠（C）的双免疫荧光染色TC切片（40μm厚）的显微照片。光伏的显微照片(A1类–C1类)、GFP(A2级–指挥与控制)和PV+GFP的合并图像(A3号–C3）.比例尺，50μm。白色虚线勾勒出整个桶皮层的不同层次。第1页–一层楼统计比较P25岁时对照组（白条，n=6只小鼠）、NVP-AAM077治疗组（灰条，n=6只鼠）和Ro25-6981治疗组（黑条，n=3只小鼠）小鼠PV-阳性（D1）、GFP-阳性（E1）细胞密度和PV/GFP-阳性（F1）神经元比率（P7-P25注射）。D2类–地上二层，P18岁时对照组（白色条，n=3）、NVP-AAM077处理组（灰色条，n=3）和Ro25-6981处理组（黑色条，n=2）小鼠PV阳性和GFP阳性细胞的细胞密度的统计比较。对照组和NVP-AAM077治疗组PV-阳性（D2）、GFP-阳性（E2）神经元密度和PV/GFP-阳性（F2）神经元比率无显著差异。
表3
对照组和NVP-AAM077注射组的钙结合蛋白和钙视网膜蛋白抗体染色。
| | 钙结合蛋白 | 钙调素 |
|---|
|
|---|
| 钙结合蛋白（细胞/厘米2) | GFP（细胞/厘米2) | 钙结合蛋白/GFP | 钙调素（细胞/cm2) | 绿色荧光蛋白（细胞/厘米2) | 钙调素/GFP |
|---|
|
|---|
| 控制 | 第2/3层 | 3000 ± 500 | 600 ± 60 | 5.5 ± 0.9 | 100 ± 20 | 600 ± 50 | 0.2 ± 0.03 |
| 第4层 | 3000 ± 500 | 700 ± 40 | 4.2 ± 0.5 | 60 ± 1 | 700 ± 50 | 0.09 ± 0.01 |
| 第5层 | 1000 ± 200 | 600 ± 40 | 1.9 ± 0.2 | 80 ± 4 | 600 ± 50 | 0.1 ± 0.05 |
| NVP注入 | 第2/3层 | 3000 ± 900 | 600 ± 40 | 5.1 ± 0.8 | 200 ± 50 | 600 ± 40 | 0.3 ± 0.02 |
| 第4层 | 3000 ± 400 | 700 ± 70 | 4.7 ± 0.7 | 60 ± 8 | 700 ± 50 | 0.1 ± 0.007 |
| 第5层 | 1000 ± 200 | 600 ± 50 | 1.8 ± 0.3 | 80 ± 3 | 600 ± 80 | 0.1 ± 0.03 |
NR2A亚单位慢性阻断后，体周抑制受损
抑制性突触传递的特性与位于神经末梢的特定钙通道有关(Poncer等人，1997年;Poncer等人，2000年). 在海马或新皮质中，P/Q通道主要表达在FS细胞的GABA能端，而N型钙通道主要表达于非FS GABA能细胞的GAB能端(Poncer等人，1997年;Poncer等人，2000年;Ali和Nelson，2006年;Zaitsev等人，2007年). 为了进一步研究与FS和RSNP细胞相关的GABA传递的功能成熟，我们应用ω-agatoxin-IVA（2μM）（Bachem Bioscience Inc.，King of Prussia，PA），一种选择性P/Q钙通道拮抗剂(Poncer等人，1997年;Poncer等人，2000年;Sun和Dale，1998年)，并分析了第4层桶皮层棘神经元中的诱发IPSC（eIPSC）和自发IPSC（sIPSC），因为NVP-AAM077注射小鼠的第4层PV+细胞也显著减少(). 如所示在NVP-AAM077注射神经元中，eIPCS的振幅明显较小()以及半宽度和τ衰退在NVP-AAM077注射神经元中显著增大(). 此外，个人简历在NVP-AAM077注射神经元中，成对脉冲比率（IPSC2/IPSC1）显著增大()表明NVP注射神经元突触前释放概率较低。对照组和NVP-AAM077注射神经元中的eIPCS通过ω-agatoxin IVA（2μM）浴敷几乎完全消除()，这表明棘神经元上的eIPCS几乎完全由FS细胞产生，如先前的研究所示(Poncer等人，1997年;Poncer等人，2000年;Ali和Nelson，2006年;Zaitsev等人，2007年). 因此，注射NVP-AAM077的神经元中eIPSCs的减少表明FS细胞的抑制性传递下调。
对照组和NVP-AAM077注射小鼠第4层锥体神经元诱发IPSC的特征。A类，在对照组和NVP-AAM077注射神经元中应用agatoxin前后在最小刺激强度下诱发IPSC的代表性痕迹。B–F，诱发IPSC的特征。B、，振幅（由第一个IPSC测量）；C、，硬件；D、，τ衰退;E、，振幅CV；F、，成对脉冲比（IPSC2/IPSC1）。
接下来，我们测试了ω-琼脂蛋白IVA对sIPCS的影响。在对照条件下，琼脂毒素降低了IPSC的振幅和频率()表明sIPCS主要通过FS细胞的P/Q型钙依赖性释放介导。半宽和τ没有显著变化衰退(). 在NVP-AAM077注射神经元中，sIPCS的振幅和频率均小于对照组(). 琼脂毒素降低sIPCS的振幅()对频率、半宽度和τ没有显著影响衰退sIPSC的()，支持eIPCS的结果。
对照和注射NVP-AAM077的小鼠中来自第4层锥体神经元的自发IPSCs的特征。A1、A2，在对照（A1）和NVP-AAM077注射（A2）神经元中应用agatoxin前后自发IPSC的代表性痕迹。B–E、，自发IPSC的特征。B、，振幅；C、，瞬时频率；D、，工作流和E、，τ衰变。
NR2A从P7到P25的慢性阻断增加了NR2B介导的EPSCsNMDAR公司
为了进一步测试P7-25期间NR2A活性的慢性阻断是否影响中间神经元NMDA受体亚单位组成的发育变化，我们分析了NR2B介导的EPSCs的比例NMDAR公司对照组和NVP-AAM077注射小鼠的2/3层中间神经元。因为RSNP和FS在幼年动物的NR2A/NR2B比率上表现出相似的发育变化()因此，我们将中间神经元视为一组，并比较了EPSCs的特性NMDAR公司以及对照组和NVP-AAM077注射小鼠中NR2B介导的电流百分比。我们发现EPSCs的振幅和面积都降低了NMDAR公司以及个人简历NVP-AAM077注射神经元。这一结果表明，NVP-AAM077诱导突触前释放概率降低，突触后特性改变。半宽和τ衰变-加速和τ衰变流NVP-AAM077注射神经元增加，这表明NR2B介导的电流增加(). 应用ifenprodil（3μM）阻断EPSCs峰值振幅的44.0±7.9%NMDAR公司在注射NVP的神经元中，其显著大于对照组（20.2±3.4%，p<0.05）(). 此外，应用伊芬地尔（3μM）阻断了56.8±8.4%的EPSC面积NMDAR公司在NVP注射神经元中，其显著大于对照组（27.2±4.2%，p<0.01）(). EPSC百分比的增加NMDAR公司被ifenprodil阻断，以及半衰期和τ衰减的增加，共同表明NR2B介导的EPSCsNMDAR公司NR2A从P7-25慢性阻断后增加。这些结果也支持这样的观点，即NR2A亚单位，而不是NR2A子单位本身携带的NMDA电流量，在FS GABA能细胞的成熟中起着重要作用。
NR2A慢性阻断对EPSCs的影响NMDAR公司.A1、A2，在不存在（黑色）和存在ifenprodil（3μm，灰色）的情况下，对照组（A1）和注射NVP（A2）的代表性迹线。这些痕迹是10个连续EPSCs的平均值。B、 C、。EPSCs峰值振幅抑制百分比NMDAR公司（B） 以及EPSC的面积NMDAR公司（C） 由ifenprodil（3μm）在对照组和NVP-AAM077注射小鼠中提供。
表4
慢性NVP-AAM077注射液对EPSC性能的影响NMDAR公司.
| 个人简历 | 振幅（pA） | 面积（pA*毫秒） | τ上升（毫秒） | 硬件（毫秒） | τ快速衰减（毫秒） | τ衰变-流动（毫秒） | n个 |
|---|
| 控制 | 0.2 ± 0.0 | 92.6 ± 9.4 | 6506.9 ± 948.9 | 3.6 ± 0.2 | 48.8 ± 0.8 | 44.8 ± 3.9 | 274.9 ± 31.6 | 29 |
| NVP注入 | 0.4 ± 0.0** | 59.6 ± 6.4** | 4987.4 ± 343.9*** | 3.5 ± 0.3 | 57.8 ± 3.4* | 55.8 ± 3.8* | 402.5 ± 47.0* | 22 |
讨论
出生后长期阻断NR2A而非NR2B可下调FS细胞PV阳性中间神经元密度和抑制突触传递
GABA能中间神经元不仅参与哺乳动物中枢神经系统中广泛的生理相关过程(Toth和McBain，2000年;McBain和Fisahn，2001年;Klausberger和Somogyi，2008年;Gao和Strowbridge，2009年;McBain和Kauer，2009年;Wulff等人，2009年)但也涉及神经系统疾病。PV是一种钙结合蛋白，可以结合细胞质钙2+阻止钙的活化2+激活的K+电流，从而缩短动作电位的不应期(西里奥，1986年). PV阳性中间神经元在谷氨酸能神经元的胞体或轴突起始段上激发高频动作电位和突触，使其能够有效调节锥体神经元的输出(van Brederode等人，1991年). PV阳性中间神经元的丢失在功能上与癫痫有关(Marco等人，1997年;Arellano等人，2004年)，精神分裂症(Woo等人，1998年;张和雷诺兹，2002年;Lewis等人，2005年;Lodge等人，2009年)和自闭症(Selby等人，2007年). 有趣的是，NMDAR拮抗剂的治疗可以导致PV表达的类似下降(Keilhoff等人，2004年;Kinney等人，2006年;Abekawa等人，2007年;Behrens等人，2007年). 中间神经元NR1基因缺失产生了类似的结果(Belforte等人，2010年). 然而，有证据表明NR2A和NR2B受体的功能与PV神经元的发育有关体内缺少。
在本实验中，从P7到P25，NR2A（而非NR2B）的慢性阻断降低了2/3层和4层大脑皮层PV阳性中间神经元的密度(). 长期服用NR2A和NR2B拮抗剂将影响锥体神经元和中间神经元。含NR2A的NMDAR增加锥体神经元AMPA受体GluR1亚单位的表面表达(Kim等人，2005年). NR2A慢性阻断导致PV表达减少可能是由于锥体神经元谷氨酸能传递减少所致。然而，因为PV中间神经元比锥体神经元表现出更高的NR2A/NR2B比率(Kinney等人，2006年)PV表达的减少更有可能是由中间神经元的直接作用引起的。通过测量第4层棘细胞中的eIPCS和sIPCS，我们发现阻断NR2A活性后，主要由PV阳性FS中间神经元介导的体周抑制受到损害(&). 此外，NR2B介导的EPSC纳米达尔NR2A从P7到P25被铬阻断后，2/3层中间神经元增加(和). 我们首次证明NR2A受体可以影响钙结合蛋白的表达和特定中间神经元（FS细胞）的突触传递。然而，关于NR2A在PV阳性细胞成熟过程中作用的机制尚不清楚，这就需要对PV中间神经元中NR2A介导的信号进行更详细的研究体内.
NR2B的慢性阻断对桶状皮层中PV的表达没有影响(). 我们的结果体内类似于早期的研究，其中NR2A，而非NR2B受体，在培养PV中间神经元的GABA能功能的维持中起着关键作用(Kinney等人，2006年). 在这两项研究中，NVP-AAM077（而非Ro25-6981）的应用影响了PV的表达。从表面上看，这个结果似乎只将PV表达与NR2A受体联系起来。然而，对这一结果的解释需要谨慎。例如，NVP-AAM077对EPSC的抑制作用更强NMDAR公司与Ro 25-6981相比。注射NVP-AAM077后，含PV中间神经元的减少可能只是因为NVP-AAM 077提供了更强的抑制作用，而不是其亚单位特异性。然而，我们关于慢性NVP–AAM077治疗小鼠中NR2B介导电流增加的结果（参见)表明是NR2A亚单位，而不是NR2A本身携带的NMDA电流量，似乎与GABA能神经元的发育成熟有关。此外，NR2A从P7到P18的慢性阻断并未引起PV表达的显著变化；这可能是由于治疗时间的不同，而不是敏感期的影响。我们不知道预期体内NVP-AAM077和Ro25-6981在大脑中的半衰期。虽然Ro 25-6981在体外4°C下的解离半衰期非常慢（>5小时）(Mutel等人，1998年)很难预测NVP-AAM077或Ro25-6981的有效性在大脑中持续多久体内在这种情况下，有两个因素将决定治疗是否有效。一是化学品的累积效应（NVP-AAM077或Ro25-6981）体内另一个是治疗的长度。
总之，我们记录了突触诱发的EPSCsNMDAR公司来自出生后早期组（preCP）和幼年组（postCP）的GABA能中间神经元，位于2/3层大脑皮层。EPSC的差异NMDAR公司NR2亚单位特异性拮抗剂的特性和敏感性表明，GABA能中间神经元中NMDAR的分子组成在关键发育阶段发生变化。本研究结果表明，含有NR2A的NMDAR在PV阳性细胞的成熟过程中起着关键作用体内这些结果增加了特定NR2亚单位参与皮层抑制网络经验依赖性可塑性的可能性。
补充材料
补充表S1
补充图1。A&B、，神经生物素填充神经元的重建。A、，快速尖峰的中间神经元。B、，规则的非锥体神经元突起。比例尺，20μm。C&D公司，诱发EPSC的峰值振幅（C）和面积（D）NMDAR公司低于最小值与最低刺激条件下0.15%。E&F、，比较前CP组和后CP组中峰值振幅小于或大于平均振幅的神经元。E、，在前CP组和后CP组中，<平均振幅组的神经元的峰值振幅要小得多。F、，在CP前和CP后两组中，ifenprodil的效果没有显著差异。
补充表S2
补充图2。A1类–A3号前CP（A1）、后CP（RSNP）（A2）和后CP FS（A3）神经元的单指数拟合。虚线为单指数拟合τ衰退箭头表示τ的值衰退 地下一层–地下三层。双指数拟合与A1–A3中相同的神经元。虚线为双指数拟合τ衰退箭头表示τ的值衰变。 C1类–C3类手动双指数拟合与A1–A3相同的神经元。虚线为双指数拟合τ衰退箭头表示τ的值衰退 D-H2，EPSC特性的差异NMDAR公司CP后RSNP和FS神经元之间P20–30与。第31-40页。CV（D）、峰值振幅（E）、τ无显著差异上升（G） 和慢τ衰退（H2）组内（P20–30或P31–40）或组间（P20-30）与。第31-40页）。HWs（F）和fastτ存在显著差异衰退（H1）组内，组间无显著差异。
补充表S3
补充图3。A、，EPSC面积比较NMDAR公司在前CP（白条）、后CP RSNP（灰条）和后CP FS（黑条）神经元中。各组间无显著差异（p>0.05）。B中，NVP-AAM077、Ro 25-6981和ifenprodil对EPSC面积的影响NMDAR公司.C、，NVP-AAM077和ifenprodil对EPSC面积的影响NMDAR公司在CP后RSNP和CP后FS神经元中。D、，NVP-AAM077、Ro 25-6981和ifenprodil对EPSC面积的总影响NMDAR公司.E、，按EPSC面积计算的数据图NMDAR公司显示“NR2B剩余EPSC”（n=48，浅灰色条），与Ro 25-6981（n=28，深灰色条）和ifenprodil（n=51，黑色条）相比与NVP-AAM077（n=48，黑条）相比，所有检测神经元中NR2A剩余EPSCs 1’（来自Ro 25-6981实验，n=28，浅灰色条）和“NR2A其余EPSCs 2”（来自ifenprodil实验，n=51，深灰色条），无论其年龄组如何。
