丙酮酸羧化酶是肿瘤细胞谷氨酰胺依赖性生长所必需的

丙酮酸羧化酶对GLS的抑制伴随着葡萄糖依赖性贫血的增加。

GLS缺陷细胞的残留生长促使我们确定替代途径，以补偿谷氨酰胺依赖性缺乏的减少。GLS沉默导致谷氨酰胺衍生碳对脂质的贡献适度减少，而葡萄糖依赖性脂质合成略有增加(SI附录，图S4A类)。GLS抑制还减少了TCA循环中间产物苹果酸和柠檬酸的标记¹³源于谷氨酰胺的C(图2A类,左侧和SI附录，图S4B类)。为了确定提供这些池的替代营养素，我们用D-[1,6培养细胞-¹³C] -葡萄糖，并使用质谱法分析苹果酸和柠檬酸。当GLS被沉默时，这两种中间体都含有更多的葡萄糖衍生碳(图2A类,赖特和SI附录，图S4C类)。在GLS-抑制的LN229细胞中，含有两个额外质量单位（柠檬酸盐m+2）的柠檬酸盐池的分数增加了50%以上。

在单独的窗口中打开

图2。

谷氨酰胺酶沉默通过丙酮酸羧化酶（PC）增加葡萄糖依赖性恢复。(A类)使用气相色谱/质谱法测量L-[3培养细胞中柠檬酸和苹果酸的富集-¹³C] -谷氨酰胺(左侧)和D-[1,6-¹³C] -葡萄糖(赖特)。结果来自重复培养7小时的代表性实验。(B类)在D-[U培养期间，增加PC通量对谷氨酸C2（GLU2）总标记中四分位（Q）、2,3双位（D23）和1,2双位（D12）的分数贡献的预测效果-¹³C] -葡萄糖。数据是使用建模软件生成的tcaSIM公司假设有一个活跃的TCA循环，丙酮酸的富集度为95%，并有活跃的回补。对TCA循环的35圈进行了模拟。(C类)表达对照shRNAmir、针对GLS的shRNAmir或针对GLS和PC的shRNAmir的LN229细胞的蛋白质印迹(D类)从细胞系中提取代谢物的核磁共振波谱C类用10 mM D-[U培养细胞-¹³C] -葡萄糖和4 mM未标记的谷氨酰胺维持8小时。插图突出显示了GLU2多重态。单个峰值的分裂是长程耦合的结果。(E类)柠檬酸盐标签来自[1-¹³C] -丙酮酸在相同的三种细胞系中。柠檬酸盐m+1相对于未标记标准物的百分比（其中m+1=0%）绘制在年轴。每个培养物含有5mM Na-[1-¹³C] -丙酮酸，4 mM谷氨酰胺，无葡萄糖。数据是三个7小时培养物的平均±SD。谷氨酸；Ala，丙氨酸；甘氨酸；乳酸；S、 单线。

柠檬酸盐m+2增加有多种可能的解释。最简单的是，更多的柠檬酸分子含有单一的¹³来自葡萄糖衍生的乙酰辅酶a（柠檬酸盐m+1）的C保留在循环中，产生更大比例的OAA m+1，增加了标记的OAA与标记的乙酰辅酸缩合的可能性(SI附录，图S5)。这是合理的，因为谷氨酰胺通常是OAA的主要来源(7)预计减少GLS通量将减少未标记OAA的总产量。一个同样可信的替代方案是，GLS抑制伴随着PC活性的增加，PC直接从葡萄糖衍生的丙酮酸产生OAA，并在OAA m+1与葡萄糖衍生的乙酰CoA m+1浓缩后产生柠檬酸m+2(SI附录，图S5)。由于质谱无法轻易区分这两种可能性，我们使用了该程序tcaSIM公司模拟不同谷氨酰胺依赖性补骨剂和PC流量对¹³碳同位素形成(15)。如果细胞在D-[U培养基中培养，则增加PC通量可提高谷氨酸碳2（GLU2）处双链（或四链，Q）和2-3双链（D23）的分数贡献-¹³C] -葡萄糖(图2B类; 中的详细标签方案SI附录，图S6)。相比之下，在PC活性没有改变的情况下，简单地减少回补可以抑制D23(SI附录，图S7)。这种区别产生了可通过核磁共振监测的相对PC通量的定量标记。生成了LN229衍生细胞系，该细胞系包含GLS单独或GLS和PC的抑制(图2C类)，这些细胞在D-[U中培养-¹³C] -葡萄糖。谷氨酸同位素的核磁共振分析(16)结果显示，当GLS被抑制时，总的再补流量下降了~45%，但仍占总TCA循环活性的很大一部分(SI附录，表S2)。GLU2检测显示GLS抑制细胞中的Q和D23增强，如果PC也被抑制，这些共振恢复正常(图2D类)，与GLS抑制过程中PC流量增加和葡萄糖依赖性补骨术一致。

作为PC活性的独立测试，细胞用[1-¹³C] -丙酮酸盐和代谢物通过质谱法进行分析。丙酮酸C1以CO的形式释放₂通过丙酮酸脱氢酶，但如果丙酮酸通过PC进入TCA循环，则被保留(SI附录，图S8)。GLS抑制与6倍的¹³C从[1转账-¹³C] -丙酮酸转化为柠檬酸盐，如果PC也被抑制，则情况会逆转(图2E类)。总之，数据表明，慢性GLS抑制导致PC活性增加，部分抵消了谷氨酰胺依赖性贫血的减少。

谷氨酰胺脱除期间细胞生长需要PC。

接下来，我们测试了当谷氨酰胺代谢受损时，PC是否有必要支持生长。SF188胶质母细胞瘤细胞对谷氨酰胺“上瘾”以维持生存和生长(10)。我们之前使用过表达Bcl-xL（SF-xL）的SF188衍生细胞来检测葡萄糖剥夺和Akt抑制对中间代谢的影响(17)。这些细胞保留谷氨酰胺成瘾的表型，并在几天内失去谷氨酰胺后失去生存能力(图3A类和B类)。与其他研究的观察结果一致(9,18)，谷氨酰胺生成细胞减少了谷氨酸和TCA循环中间产物库，并适度增加了细胞ATP含量(SI附录，图S9)。添加谷氨酸或二甲基-α-KG可完全恢复细胞活力，部分恢复谷氨酰胺生成细胞的生长(SI附录，图S10A类和B类)。我们还测试了DMEM中通常缺失的其他氨基酸是否可以用于补体。将脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺补充到含有L-[U的DMEM中-¹³C] -谷氨酰胺和代谢物通过GC/MS进行分析。添加这些氨基酸不会显著改变TCA循环中间产物的标记(SI附录，图S10C类)，表明它们在TCA循环中没有明显的代谢。此外，在缺乏谷氨酰胺的情况下，这些氨基酸中没有一种单独或组合能够拯救细胞生长(SI附录，图S10D类).

在单独的窗口中打开

图3。

PC活性是在适应低谷氨酰胺条件期间诱导的。(A类和B类)在谷氨酰胺丰富或缺乏的条件下，亲代SF-xL胶质母细胞瘤细胞和适应低谷氨酰胺（aSF-xL）的细胞的存活和生长。数据是2×10的三种独立培养物的平均±SD⁵细胞在有或无谷氨酰胺的条件下生长72h(C类)亲代SF-xL细胞和aSF-xL细胞中PC蛋白的表达。将亲代细胞从谷氨酰胺中取出7 h，并将适应细胞给予谷氨酰胺再充满培养基7 h(D类)在谷氨酰胺和4mM二甲基α-KG存在和不存在的情况下，7小时，亲代和适应细胞中柠檬酸盐m+2的丰度(E类)增加转移¹³来自[1的C-¹³C] -适应细胞中的丙酮酸到柠檬酸。每个培养物含有5mM Na-[1-¹³C] -丙酮酸，不含葡萄糖。该比率显示了在7小时的实验中，谷氨酰胺生成（0 mM）和谷氨酰胺释放（4 mM）条件之间的倍数变化。谷氨酰胺生成的亲代细胞和aSF-xL细胞中的最终柠檬酸m+1组分分别为11%和16.5%*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005.

通过逐渐适应SF-xL细胞在逐渐降低的谷氨酰胺浓度下生长，我们获得了在0 mM谷氨酰胺中保持生存能力的亚系(图3A类)提供了一个机会来研究在没有细胞死亡的情况下谷氨酰胺依赖性代谢。与亲代细胞不同，适应性细胞在缺乏谷氨酰胺的情况下增殖，尽管重新引入谷氨酰胺仍能适度刺激其生长(图3B类)。这些细胞的PC蛋白表达高于亲代细胞(图3C类)，但mRNA水平没有显著差异(SI附录，图S11A类)。虽然急性谷氨酰胺缺乏不会影响亲代或适应性细胞的葡萄糖消耗(SI附录，图S11B类)，当任一细胞系与D-[1,6培养时，增加了柠檬酸m+2的丰度-¹³C] -葡萄糖，适应细胞的相对增加更高(图3D类)。添加二甲基-αKG可将柠檬酸盐m+2抑制到两种细胞系的正常水平(图3D类)。当谷氨酰胺严重缺乏时，两种细胞系中丙酮酸C1与柠檬酸的结合也增强，但在适应性细胞中相对增强更高(图3E类)与PC蛋白的丰度相当。这些数据共同表明，谷氨酰胺缺乏会导致PC蛋白丰度增加，以及葡萄糖/丙酮酸用于补充的程度增加。

为了确定在谷氨酰胺缺乏的条件下生长是否需要PC，PC从适应细胞中稳定地耗尽(图4A类)这些细胞在有无谷氨酰胺的条件下生长(图4B类)。在谷氨酰胺存在的情况下，含有对照shRNA或两种针对PC的shRNA的细胞的生长没有差异。然而，在缺乏谷氨酰胺的情况下，PC表达的沉默严重限制了细胞生长(图4B类)。此外，当PC被沉默时，从葡萄糖到大分子的碳转移被抑制，但仅在无谷氨酰胺的条件下(SI附录，图S12)，与对细胞生长的影响相似。因此，PC对于谷氨酰胺补充型胶质母细胞瘤细胞的生长是不必要的，但当谷氨酰胺供应有限时需要PC。

在单独的窗口中打开

图4。

细胞需要PC来逃避谷氨酰胺成瘾。(A类)抑制适应低谷氨酰胺生长的SF-xL细胞中PC蛋白的表达，然后感染表达对照shRNA（GFP）或针对PC（PC1，PC2）的shRNA的慢病毒。(B类)细胞在有无细胞外谷氨酰胺的情况下生长。细胞以1×10的密度进行电镀⁵/培养72h。数据为三种独立培养物的平均±SD*P（P）< 0.05.

代谢分析。

使用自动电化学分析仪（BioProfile Basic-4分析仪；NOVA）从0.6-mL等分培养基中测定葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的浓度。全日空航空公司₄⁺分泌物用分光光度法（Megazyme）测定。使用氨基酸分析仪（Hitachi；L8900）通过HPLC测量氨基酸的消耗和分泌。代谢率是通过将代谢物丰度的绝对变化标准化为蛋白质含量来确定的。

RNA干扰。

所有的RNA干扰（RNAi）实验都使用了细胞池。RNAi载体是从基于pGIPZ（shRNAmir）或pLKO.1（shRNA）主干（开放生物系统）的商业库中获得的。用于RNAi的序列位于SI附录通过使用Fugene HD（Roche）将293T细胞与慢病毒构建体pCMVΔR8.91和pMD2.G共转染来产生慢病毒颗粒。转染后2天收集含病毒上清液并用于感染细胞。感染后第2天添加嘌呤霉素（1μg/mL），在任何实验之前继续选择10天。在1μg/mL的嘌呤霉素中维持稳定的感染池，并适当沉默。

蛋白质表达。

在RIPA缓冲液中制备全细胞裂解物，并使用BCA蛋白质分析（Thermo Scientific）进行定量。蛋白质通过SDS/PAGE分离，转移到PVDF膜上，并用抗PC（Santa Cruz Biotechnology）、β-肌动蛋白（Sigma）、GLS或GLS2（在Matés实验室制备）的抗体进行检测。

软琼脂集落形成分析。

通过低密度的平板细胞（细胞数2×10）测定锚定非依赖性菌落形成^三)和高密度（1×10⁴)在12孔板中，使用0.33%SeaKem GTG琼脂（Cambrex BioScience）。2周后，在20%甲醇中用0.05%结晶紫对培养物进行染色。低密度微孔用于计数直径>200μm的菌落，高密度微孔用于摄影。

异种移植生长试验。

将SF-xL或LN229细胞以200×10的浓度重新悬浮在DMEM中⁶/mL，与Matrigel（Becton-Dickinson）以1:1的比例混合，并将皮下埋植到男性侧翼北卡罗来纳州立大学6-8周龄小鼠（20×10⁶每次注射的细胞数）。将表达非靶向和靶向shRNAs的细胞注射到对侧侧翼。肿瘤体积根据公式[（长）×（宽）计算²]/2。当肿瘤超过2000毫米时^三老鼠被杀了。

我们感谢Craig Malloy、Mark Jeffrey和Aron Jaffe对数据和手稿的反馈。Kartik Rajagopalan测量了氨基酸水平。Carolina Cardona纯化了谷氨酰胺酶抗体。R.J.D.得到了美国国立卫生研究院（NIH）（DK072565）、德克萨斯州癌症预防与研究所（CPRIT）（HIRP100437）、韦尔奇基金会（I-1733）和儿童临床研究咨询委员会的资助。E.S.J.由国家卫生研究院拨款（DK078933）支持。J.M.M.得到了西班牙财政部的资助（SAF2010-17573）。T.C.由CPRIT培训拨款支持，a.R.M.由NIH培训拨款支持（5T32GM083831-02）。