末端结合蛋白EB3和EB1将微管连接到轴突起始段的锚蛋白G

AIS中EB3的稳定、MT-依赖浓度。

作为一个+TIP，EB蛋白作为短暂的彗星聚集在不断增长的MT plus-ends(18). 为了比较EB3在AIS和树突中的动态行为，我们将EB3-GFP转染到8到10 div神经元中，然后使用高度倾斜照明显微镜进行活细胞成像(图2A类和电影S1). 在细胞体和树突中，我们观察到许多移动的瞬时EB3-GFP彗星。引人注目的是，AIS中富集的EB3-GFP大多是不动的，AIS内几乎没有彗星可检测到(图2A类和电影S1). 为了直接探讨AIS中EB3的稳定性，并验证EB3的富集并没有掩盖可移动的EB3彗星，我们对AIS和8-10-div神经元树突中的EB3-GFP进行了光漂白后荧光恢复（FRAP）分析。在AIS中，我们从未观察到彗星侵入漂白区，这表明AIS中EB3的富集不是由MT加ends的积累引起的(图S3). AIS中的荧光恢复比树突中的更不完整(图2B类)揭示了AIS中EB3固定种群的积累(图2C类). AIS中EB3的浓度和稳定性可能与EB3沿MT晶格的结合有关。因此，我们评估了急性（2小时）诺克唑和紫杉醇治疗后扰乱MT的21-div神经元中EB3的定位(图2D类). 废除MT动力学的低剂量（0.2μM）诺卡唑治疗足以诱导EB3体脂蛋白斑点消失，并降低整体EB3标记强度(17). 经此治疗后，大多数神经元仍检测到AIS中EB3的富集，表明EB3的积累并不依赖于MT加end动力学(图2E类). 相比之下，使用高剂量（20μM）的诺卡唑改变组装的MT(17)或使用紫杉醇（0.2μM）稳定所有MT，破坏一半神经元中EB3的AIS富集(图2E类)高剂量诺可唑能够显著改变EB3标记的平均AIS/D比率(图2F类). 这些观察结果有力地表明，EB3的稳定性取决于MT晶格的完整性和稳定性。

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图2。

EB3在AIS处不动且稳定。(A类)EB3-GFP转染10-div神经元的活细胞成像(电影S1). AIS（紫色）沿线的日程表显示了EB3的浓度，但没有明显的彗星运动。沿着树枝状（蓝色）的日程表显示了几个彗星的双向运动。[比例尺：10μm(左侧); 5微米(赖特以及在居中); 60 s（垂直波形图方向居中). (B类)表达EB3-GFP的8-9-div神经元的点FRAP实验的归一化平均荧光恢复曲线。AIS（紫色）中的恢复不如枝晶（蓝色）中的完全。平均值（粗线）±SEM（细线），n个=两个实验中的14个神经元。(C类)根据单个恢复曲线计算AIS和树突中不动EB3-GFP种群的百分比。条形图表示平均值±SEM；n个=两个实验中的19个神经元；t吨测试***P（P）< 0.001. (D类)MT扰动对21个div神经元EB3定位的影响。诺卡唑（noco）（0.2μM或20μM，持续2小时）或紫杉醇（0.2μM，持续2 h）诱导EB3体感斑点消失（EB3，绿色；map2，蓝色），但仅部分干扰AIS中的EB3浓度（ankG，红色）。（比例尺：20μm）(E类)MT扰动后AIS中显示EB3浓度的神经元百分比。车辆、车辆状况。条形图表示平均值±SEM；n个=三个实验中的301–330个神经元；与车辆的单因素方差分析后验比较**P（P）< 0.01; 不显著（ns），P（P）> 0.05. (F类)MT扰动后EB3的AIS/D比率。条形图表示平均值±SEM；n个=35-36个神经元，来自三个实验；与车辆的单向方差分析后验比较*P（P）< 0.05; 纳秒，P（P）> 0.05.

EB3直接绑定到AnkG。

AIS中EB3的浓度和稳定性表明它与ankG支架有关。为了测试EB3与ankG的相互作用，我们首先用细菌表达的GST-EB3和转染COS细胞的ankG-GFP或ankB-GFP进行GST下拉试验。AnkG能够与重组EB3结合，但ankB（沿远端轴突表达的另一种神经元锚蛋白）不能结合(图3A类和图S4) (19). 接下来，我们使用表面等离子体共振（SPR）实验来评估EB3和ankG之间的直接相互作用。纯化的190-kDa-ankG与GST-EB3结合，具有纳米摩尔亲和力(K（K）_d日=1.2±0.7 nM），而220-kDa ankB未观察到结合(图3B类和表S1). 为了确认EB3–ankG在细胞环境中的相互作用，我们使用了基于细胞的MT招募分析。在COS细胞中，ankG-mCherry（ankG-m Ch）显示出均匀的膜下定位(图3C类). 过度表达的EB3-GFP沿MT累积，诱导MT束(20). 当与EB3-GFP共表达时，与转染ankG-mCh和tubulin-GFP的细胞的4±3%相比，在EB3-GFP高表达的细胞中，ankG-m Ch被招募到MT中(图3D类和E类). 此外，HA标记的EB3也向MT募集ankG-GFP，但不募集ankB-GFP(图3E类和图S5A类–C类)，证实了EB3–ankG相互作用的特异性。在本试验中，EB3与MT的结合对于ankG的补充是必要的，因为截短的EB3缺乏MT-结合195-氨基酸末端残基（EB3ΔN个-GFP）仍然能够绑定ankG(图S4)但没有与MT联系，也没有招募ankG-mCherry(图S5D类).

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图3。

EB3直接与ankG互动。(A类)GST-EB3从转染COS细胞裂解物中下调ankG-GFP[上部(图S4显示全凝胶）]但ankB-GFP没有(下部)如免疫印迹（IB）所示。(B类)代表性SPR曲线：纯化的190-kDa ankG（红色），而不是220-kDa-ankB（蓝色），与固定化GST-EB3结合。（定量参数见表S1.) (C类)COS细胞招募分析：转染COS细胞后，ankG-mCh（红色）显示膜下定位。（比例尺：20μm）(D类)EB3-GFP（绿色）的共表达诱导ankG向β-微管蛋白染色（蓝色）鉴定的MT募集。(E类)具有锚蛋白向MT招募的COS细胞百分比，表明EB3-HA优先招募ankG而非ankB。条形代表平均值±SEM；n个=256–1403个细胞，来自两到七个实验；单因素方差分析后验比较***P（P）< 0.001, **P（P）<0.01，纳秒P（P）> 0.05.

AnkG绑定到EB3的末端结合同源域疏水囊。

为了表征EB3上的ankG结合位点，我们生成了EB3 C末端的几个截短突变体，该突变体包含一个末端结合同源（EBH）结构域和一个酸性尾(图4A类). EBH结构域包含一个极性边缘，其后是一个疏水囊，对EB蛋白相互作用+TIP的结合很重要(21). 我们首先评估了SPR实验中截断EB3结构与ankG相互作用的能力。EB3Δ259仍以纳米摩尔亲和力与ankG结合，但EB3Δ》245和EB3Δ）238未与ankG结合(图4B类和表S1). 在COS细胞分析中，EB3Δ259-GFP将ankG-mCh招募到MT中，但EB3△245-GFP和EB3△238-GFP没有招募到MTs中(图4C类和D类和图S6). 综上所述，这些发现表明245–259位之间的EB3残基对ankG结合至关重要。这些残留物包围了疏水囊的最后一部分(22). 因此，我们通过丙氨酸拉伸替换225-227位置的FYF，废除了疏水囊的另一端。在表达EB3FYF-GFP的细胞中，对MT的AnkG募集发生改变(图4C类和D类). 因此，ankG与EB3的EBH结构域中的疏水口袋结合，与其他EB蛋白+TIP伙伴使用的位点相同。ankG的这种竞争性约束可能解释AIS中观察到的其他+TIP被排除在外的原因(图1D类和图S2).

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图4。

AnkG与EB3的EBH域疏水囊结合。(A类)EB3突变结构体C末端的氨基酸序列。在EBH域中，突出显示的特征是极性边缘（红色的氨基酸）和疏水囊（蓝色的氨基酸）。(B类)190 kDa ankG与GST-EB3截短构建体结合的代表性SPR曲线：EB3Δ245和EB3Δ238不能结合ankG。（定量参数见表S1.) (C类)通过EB3-GFP突变体量化ankG-mCh向MT的募集：显示ankG向MT募集的COS细胞百分比，标准化为全长EB3的募集效应。EB3Δ259能够招募ankG到MT，但EB3Δ》245和EB3Δ）238不能，EB3FYF只能部分胜任ankG招募。条形图表示平均值±SEM；n个=三个实验中的300个细胞；与GFPf的单因素方差分析后验比较(^$$$P（P）<0.001）或全长EB3(***P（P）< 0.001). (D类)表达EB3Δ245（绿色，左侧)或EB3FYF（绿色，赖特)未能将ankG mCh（红色）募集到MT（蓝色）。（比例尺：20μm）

EB1在成熟神经元中表达并与AnkG结合。

重要的是，EB3上的ankG结合位点在EB蛋白家族的三个成员中是保守的(22). 因此，我们想知道EB1和EB2是否也可能在神经元的AIS中发挥作用。Western blot显示EB1和EB2在所有年龄段的成熟培养物中都有表达。相反，EB3在未成熟神经元中的表达较低，10天后表达增加(图5A类). EB3和EB1的同步免疫标记显示，在神经元成熟过程中，EB3水平相对于EB1增加(图5B类). 在成熟神经元中，EB2主要存在于细胞体和轴突中，但从未在AIS中富集(图S7) (17). 相反，EB1定位于体细胞点状突起和轴突(15)如前所述，在AIS中为神经元亚群积累(图5C类) (14). 这种亚细胞定位促使我们研究EB1与ankG的可能结合。GST-EB1能够在GST下拉分析中与ankG-GFP相互作用(图5D类). SPR实验证实EB1与ankG以纳米级亲和力直接相互作用(K（K）_d日=1.4±0.9 nM），类似于EB3(图5E类和表S1). 最后，在COS细胞中共表达时，EB1-GFP能够在MT上招募ankG-mCh(图5F类和G公司). 这些结果表明，尽管EB3是成熟神经元AIS中的主要EB蛋白，但EB1也可能在ankG和MT之间起到连接作用。疏水口袋序列在三个EB家族成员之间高度保守，表明ankG通过与EB3相同的结合位点与EB1结合，ankG也可以与EB2结合。

SPR。

使用HBS-EP运行缓冲液（GE Healthcare），在25°C的Biacore 3000仪器上使用CM5传感器芯片进行SPR实验。大约5-18 fmol的GST融合蛋白和GST通过抗GST多克隆羊抗体通过胺偶联化学共价偶联固定在流式细胞中。单循环动力学方法(29)用于分析ankB（220 kDa）或ankG（190 kDa）与捕获的EB3、EB3突变体和EB1的GST融合的结合。其他详细信息见SI材料和方法.

动物。

Wistar大鼠的使用遵循欧洲动物护理和使用委员会（86/609/CEE）制定的指南，并经当地伦理委员会批准（协议C13-055-8）。

细胞培养和转染。

如上所述培养COS-1和COS-7细胞(6)，根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染，转染后24小时固定。按照描述培养大鼠海马神经元(6)，使用Lipofectamine 2000转染，并在指定的时间点固定。

免疫荧光。

用冷甲醇固定COS细胞7分钟。在−20°C下用甲醇固定神经元细胞5分钟，然后用4%多聚甲醛固定5分钟，并按照前面所述进行免疫细胞化学处理(4). 其他详细信息见SI材料和方法.

显微镜、图像采集和处理。

培养细胞的成像是使用AxioObserver显微镜（蔡司）进行的，该显微镜配备有QuantEM相机（光度学），并由MetaMorph（分子器件）或AxioVision（蔡斯）引导。使用40×，NA 1.2油物镜和合适的荧光滤光片对COS细胞或神经元进行计数和定量。AIS/D比率是给定神经元沿AIS的平均强度与沿近端树突的平均强度之比。一幅图像的AIS（体细胞）强度比定义为转染神经元的AIS平均强度除以周围所有未转染神经元AIS（体细胞）平均强度的平均值。在shRNA实验中，比较了用shRNA质粒转染的神经元和用缺少shRNA盒的控制质粒转染神经元的比率。其他详细信息见SI材料和方法.

活细胞成像和FRAP实验。

在第7–10天转染神经元，转染后24–48小时成像。使用AxioObserver显微镜（蔡司）进行成像。我们使用488-nm激光器（Error）在高倾斜照明模式下通过100×全内反射荧光（TIRF）物镜(25)从玻璃基板上成像至～0.5–1μm。FRAP实验使用旋转盘系统（横河CSU22）和激光扫描FRAP系统（罗珀科学公司）进行。点区域（直径1-μm）被漂白（60%–70%），并使用背景校正的归一化曲线进行回收率定量。其他详细信息见SI材料和方法.

我们感谢F.Rueda、G.Caillol和A.Tasmadjian提供的技术帮助；A.Woodhouse对手稿的批判性阅读；C.Lévíque和G.Ferracci为SPR实验提供帮助；D.Choquet、C.Breillat和C.Poujol为FRAP实验提供帮助；和V.Bennett、A.Akhmanova、M.Coppey、P.Gordon-Weeks、A.Benmerah、C.Berlot、C.Hoogenraad、R.Tsien、F.Watrin和N.Galjart分享抗体、重组蛋白和质粒。这项工作得到了国家医学研究所、国家医学科学研究中心的支持，以及国家医学研究院的A05161号拨款、医学研究基金会的R06048AA号拨款、居里夫人第七框架计划（向H.V.）的IRG-2008-239499号拨款的支持，以及国家多发性硬化症协会和基金会向C.l.提供的资助。