脂质立方相已被用于生长膜蛋白晶体以进行高分辨率结构测定。最近，随着G蛋白偶联受体结构的发表，这种方法取得了惊人的成功(1–7). 该方法还用于多种其他膜蛋白和肽类型，包括光敏蛋白，如各种细菌视紫红质、集光复合物和光合反应中心、转运体、通道和粘附素(8–15). 由于它们没有出现在这个列表中，所以最引人注目的是蛋白质的完整膜酶类。
我们对与甘油脂质代谢相关的膜酶的结构-功能关系感兴趣。我们目前的重点是双酰甘油激酶DgkA大肠杆菌负责二酰甘油的ATP依赖性转化为磷脂酸，用于膜衍生低聚糖合成(16). 最近发表了这种疏水性小三聚体的溶液核磁共振结构(17)现在需要一种高分辨率的晶体结构来补充和扩展解决方案的工作。用传统方法结晶DgkA的努力已经产生了晶体，但没有产生任何结构质量(18). 脂质立方中间相(在中)鉴于该方法在其他小的疏水性整体膜蛋白和肽方面取得的成功，该方法目前正在作为一种替代方法进行研究，可能产生所需的晶体结构。
为了支持这一点在中结晶试验重要的是要证明这种酶在立方中间相中具有功能活性，晶体必须生长在立方中间相中。立方相可以被视为由一个单一的、高度弯曲的、连续的脂质双层组成，该双层渗透在3D空间中，其中面位于周期性最小表面上。脂质膜被中间相的水性组分浸没在两侧，中间相以连续的分支网络的形式存在。在这种“双连续”介质中测定酶活性并不简单，这是本工作的重点。
证明和表征整合膜酶的活性在中尺度提出了两大挑战。首先，立方相非常粘稠，具有厚牙膏的流变性。因此，处理中间相并非易事。然而，这些粘度和粘性特性在设置和执行中发挥了优势在中分析，如所述。
第二个挑战出现了，因为中间相是一种多孔的液晶介质，必须在其中测定酶。它可以被视为一种分子海绵，其中海绵的织物是一个脂质双层，海绵上的孔被水介质填充。因此，就像普通的家用海绵一样，水溶性材料可以扩散到渗透中间相的孔或水通道中，并与大块介质连续。在检测过程中，水溶性DgkA底物ATP和产物ADP必须分别扩散到中间相和中间相外，以支持激酶活性和检测。后者是在当前应用中使用耦合酶系统完成的(19–21)包括丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LD）、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。因此，由于DgkA活性而产生的ADP导致沐浴水溶液中NADH浓度降低，可以通过跟踪340 nm处二核苷酸吸收的变化来方便地进行监测。相反，DgkA酶及其脂质底物和产物局限于中间相的脂质双层，并可在连续膜的平面内自由移动。
DgkA是一种混合酶。它可以使用多种脂类和表面活性剂醇作为从ATP转移γ-磷酰基的底物(22–25). 它已被证明与单油酸起作用(22)，也是最常用于为晶体发生创建宿主中间相的脂质。因此，在目前的研究中，单油素具有双重作用，作为底物和中间相脂质的宿主。
在这里，我们表明，脂质立方相是一个合适和方便的系统，用于重组和测定完整的膜酶。具体地说，DgkA被证明可以重组为以功能活性形式由单油酸制备的立方相双层在中已经对其进行了表征，并且证明该激酶与一系列脂类底物起作用。这里描述的系统和方法具有普遍适用性，如用磷脂酰甘油磷酸酯合成酶PgsA进行的测量所证明的那样。
结果
重组。
DgkA是一种小而疏水的膜蛋白(,插入). 因此，预期在与脂质、单油素混合后，在产生立方相的条件下，蛋白质将重新组合成中间相的双层。荧光猝灭有力地证明了这一点。因此，DgkA的固有色氨酸荧光被监测为单油酸被淬灭脂质溴化MAG取代，摩尔对摩尔。溴化MAC是一种单酰基甘油，在其硬脂酰链的碳原子9和10上有溴原子。其相行为与单油酸十分相似，两者完全混溶。淬火曲线()类似于已知的其他整合膜蛋白的重建在中(13,15,26)并且是令人信服的证据，证明DgkA类似地重新构成立方相的双层。
脂质立方中间相中重组DgkA的荧光猝灭。用溴-MAG取代单油酸（摩尔对摩尔）可实现内源色氨酸荧光的猝灭。内源荧光(F类c（c）)归一化为未抑制的荧光值(F类o个)在没有溴-MAG的情况下记录。插图显示膜中的DgkA模型，通过点和序列位置识别色氨酸。
中间相的输运。
建议使用耦合酶系统监测DgkA活性。因此，在测定过程中，重组酶必须同时接触其底物单油蛋白和ATP。单油酸在立方相的双层中可作为脂质的宿主。相反，沐浴液中含有ATP。因此，核苷酸必须扩散到水通道中，并可用于酶，酶分布在整个中间相。同时，产品ADP必须从其生产现场通过立方体逐步淘汰的水渠扩散到沐浴液中。在那里，它可以与PK和LD酶对反应，从而导致可测量的A类340反映NADH的消耗。
在进行分析之前，重要的是要证明立方相是多孔的，并且能够在分析条件下支持小的可溶性有机物的扩散。这是通过用含有ADP的缓冲液制备立方相来完成的。将中间相（其水通道因此预先加载了核苷酸）置于96 well板的孔中，并用模拟分析条件的缓冲溶液覆盖。通过跟踪260 nm处洗浴溶液吸光度的升高，可以方便地监测立方相ADP的释放。ADP在10分钟内释放出约98%的核苷酸(). 这是预期的行为，清楚地表明成功检测DgkA重组所需的类型的运输在中应该是可能的。
立方相ADP释放。中间相是通过在pH 7.5的10 mM HEPES中用8.8 mM ADP均质单油素制备的。将5微升立方相置于96 well板中，并在丸上覆盖0.2 mL 10 mM HEPES pH 7.5。A类260在30°C条件下，摇晃微孔板阅读器，监测沐浴液的浓度随时间的变化。显示了三份样品的释放曲线。为了便于吸光度测量，微孔板的聚苯乙烯基在260nm处具有很强的吸收能力，被更透明的透明水晶密封膜（汉普顿）取代。
激酶活性。单油酸作为底物，LPA作为产物。
DgkA可以使用多种脂质底物，包括单酰基甘油。在当前的研究中，单油素创造了立方相的双层结构，最直接感兴趣的问题是，单油素能作为宿主、立方相形成的脂质和DgkA的底物发挥双重作用吗？薄层色谱（TLC）数据()清楚地表明这种酶确实是活性的在中并且赖氨酰磷脂酸（LPA）是DgkA反应的产物。因此，单油蛋白既可以作为底物，也可以作为宿主脂质。
在立方中间相中DgkA对单油酸作用的脂质底物和产物的薄层色谱分析。车道1，单油精标准。车道2，LPA标准。车道3、单油精和LPA标准。车道4，反应混合，无DgkA。泳道5，反应混合物，含DgkA。允许反应在30°C下进行过夜。车道4和车道5中的数据清楚地显示了单油酸向LPA的依赖于DgkA的转化（车道5）。通道4中的控制测量表明，检测期间的主要条件支持ATP对单油素的非酶磷酸化水平较低，这并不奇怪。
激酶活性表征。
开始动力学表征之前在中用分散在表面活性剂溶液中的蛋白质进行DgkA活性的控制测量在冲浪中蛋白质的形式。使用的底物是二己酰基甘油（DHG），在存在DgkA激活剂心磷脂的情况下进行测量(27). 30°C下记录的典型进度曲线如所示A类相应的比活性为120 U/mg蛋白质，如预期(20). 这个在冲浪中用单油精代替DHG作为底物重复测定。有和没有激活心磷脂的比活性分别为37.4±0.3和26.9±0.3 U/mg。进行分析时，心磷脂和单油酸的浓度分别为2.9和25.5 mol%。
DgkA反应的研究进展在冲浪中和在中使用耦合酶分析进行监测。在A类，反应是在胶束分散液中进行的(在冲浪中)以DHG为底物，心磷脂为激活剂（试验混合物1，见SI文本). 在B类反应是通过将酶重组成立方中间相来进行的，该立方中间相由单油酸形成，单油酸也作为脂质底物，并与分析混合物2（参见SI文本). 用酶记录的进度曲线（实线）被校正（虚线），用于背景变化A类340在不存在酶的情况下记录（虚线）。初始和最终A类340这些值分别反映了反应开始时和所有NADH被消耗时反应混合物中NADH的浓度。
显示了DgkA的行为在冲浪中正如预期的那样，有必要确定是否可以以96-well格式方便地进行分析在中单油酸既是底物又是脂质的宿主。因此，将蛋白质重组为立方相，将中间相与测定溶液一起加入96孔板的孔中（测定混合物2，参见方法)、和A类340监测沐浴液中的激酶活性。进度曲线(B类)首先是一个初始滞后，然后是一个区域，其中A类340与时间成线性关系。后者是线性区域，用于计算标准条件下16.5 U/mg的操作比活度（参见SI文本). 这一结果表明，在耦合分析系统中确实可以方便地监测重组激酶的活性在中.
操作K（K）米和V（V）最大值 在Meso中.
DgkA有两种基质，Mg2+-ATP和二酰甘油。如前所述，单油酸还起底物的作用。但因为单油精是宿主脂质在中它的浓度不能敏感地改变以量化酶的催化特性，K（K）米和V（V）最大值，相对于该基底。据推测，单油酸在分析条件下使酶饱和在中然而，镁的浓度2+-ATP可以随意调节，这是如何影响酶活性的在中如所示A类经典Michaelis–Menten饱和行为K（K）米和V（V）最大值值为3.5±0.3 mM Mg2+-ATP和14.4±0.4 U/mg。1.2±0.5 mM Mg的对应值2+-据报道，DgkA的ATP和50±7 U/mg分别为冲浪以DHG为脂质底物，心磷脂为激活剂(20). 这些数据支持这样的观点，即DgkA重组为脂质立方相的双层，作为一种经典的、性能良好的酶发挥作用。
DgkA重组为单油素立方中间相的酶活性及其对底物、活化剂和蛋白质浓度的依赖性。(A类)DgkA饱和度与Mg的线性关系图2+-ATP浓度，插图显示Lineweaver–Burk代表K（K）米和V（V）最大值测定（GraphPad Prism 5）。(B类)DgkA的比活度是总镁的函数2+浓度。在这个实验中，Mg2+以醋酸镁和ATP的形式作为钠盐添加。(C类)DgkA活性对固定体积立方相中酶负荷的依赖性。
镁优化。
DgkA的激酶活性在中对镁的反应2+浓度(B类)以与其行为相似的方式在冲浪中以二油酸为底物(27). 根据这些数据，我们的标准在中分析混合物（分析混合物2）包括55 mM的醋酸镁。
酶负载效应。
激酶活性的测定速率取决于中间相被酶负载的程度(C类和图S1). 正如预期的那样，速率随着最初的负载线性增加。因此，结果表明DgkA起作用在中作为一种性能良好的催化剂。在较高浓度下，速率下降，但在4至16 mg蛋白质/mL的范围内再次与负载成线性关系。将讨论测量速率随浓度和中间相负载的变化。
替代性脂质基质。
如前所述，DgkA可以使用多种脂质底物。为了通过在中尺度方法有可能其中一种或多种可以优先稳定蛋白质，并在这样做的过程中促进结构级晶体的生长。因此，在这项研究中，我们检测了可能作为酶底物的不同脂质在中条件。该调查仅限于在单个脂质系统中形成立方相的脂质。
本调查中包含的脂质及其化学结构和标准条件下记录的反应速率列于表S1。几个顺式-研究了单不饱和单酰基甘油（MAGs）的酰基链长度和双键在链上的位置不同。酰基链长度在16到18个碳之间的MAG的活性保持相对恒定。然而，当链长减少到14个碳时，活性随之显著下降。向链中添加溴，如溴-MAG中的溴，对活性有着深远的影响，与参考脂质单油酸相比，其活性降低了三到四倍。值得注意的是，单油酸和溴-MAG都有18个碳原子长的链。Myverol是一种含有单、二、三酰基甘油、甘油和游离脂肪酸的食品级油脂。主要成分是单油酸(28). 因此，毫不意外，Myverol中DgkA的活性（17.6±1.2 U/mg）与单油素中观察到的活性相似。
本研究中的其他两种脂质类似，但不是真诚的、MAG。第一种是PAL，是一种酰胺脂质。它由一个多分支的20碳植酸链组成，该链与甘油类似物相连，其中一个末端为CH2羟基被氨基取代。它支持非常合理的激酶活性在中与7.7 MAG观察到的速率类似。研究中的最后一种脂质是植酸三醇，它是一种20碳的多支链植烷，分子一端的三个连续碳原子上附着有羟基。这种酶对这种立方相形成的脂质几乎没有活性。
讨论
重组在Meso中.
这项工作最重要的结果是证明DgkA重组为立方相的双层，并且在其中具有酶活性。蛋白质包含五种色氨酸，分布在整个序列中(,插入)这使得通过荧光猝灭相对容易地显示蛋白质按照标准的重建程序驻留在双层中。将该蛋白重组为纯溴-MAG导致其80%的固有荧光熄灭(). 最近溶液核磁共振结构研究得出的模型将DgkA的五种色氨酸中的三种（Trp47、Trp112、Trp117）置于跨膜区域，因此容易被猝灭。第四和第五种色氨酸（Trp18，Trp25）预计位于膜-水界面，尽管它们位于蛋白质的N末端（残基1-25），在NMR研究中被认为是可移动的，构象不太明确。如果这些残留物确实在界面上，那么它们很可能至少部分屈服于与中的数据一致的淬火.
激酶活性在Meso中.
DgkA具有酶活性在中由TLC直接令人信服地证明(). 我们的下一个任务是确定高通量偶联分析系统是否可以与重组为粘性中间相的DgkA一起使用。中的进度曲线B类很明显，情况就是这样。进度曲线包括一个初始滞后阶段，然后是一个速度与时间呈线性关系的区域。预计会出现滞后阶段。酶活性存在于分布在多孔团状物中的蛋白质中，其底物之一ATP主要通过渗入中间相的水通道进入。因此，ATP必须从沐浴液中扩散到水通道中并通过水通道为分布的激酶提供燃料。与此同时，水溶性产物ADP必须在这些渗透性水通道中扩散，从药丸中流出，进入散装介质。在那里，它可以与耦合分析系统的组件结合，从而减少A类340反映激酶活性。这两个过程都需要时间，它们共同构成了初始滞后。
紧随其后的是一个区域A类340随时间线性变化，反映了稳态的建立。正是这个线性区域用于计算酶的操作比活性。标准条件下记录的值（参见SI文本)为14.4–16.5 U/mg。记录的比活性在冲浪中，以单油酸为底物，为26.9 U/mg。重要的是要了解在冲浪中和在中系统在许多方面都不同，不一定需要类似的特定活动。
据我们所知，这是一种独特的重组膜蛋白酶活性和周转的证明在中鉴于其他类似处理的膜蛋白已被证明具有生物活性，发现这种酶在立方中间相中起作用可能并不奇怪。因此，例如在中维生素B的形式12转运体BtuB能够以纳米摩尔亲和力结合其底物钴胺素，其外膜中的天然蛋白也具有这种亲和力大肠杆菌(13). 和OpcA，一种来自内塞里亚，结合唾液酸在中亲和力与蛋白质的亲和力相似在冲浪中(15). 这些数据和文献中的其他数据一起(29)支持立方相的脂质双层是一种合理的膜模拟物的观点。它还强调了这样一个事实，即立方相是研究膜蛋白的一个普遍有用的系统，尽管它具有粘性和粘性，但它是一种易驾驭和通用的纳米多孔生物材料。在当前的应用中，它在多阱形式下工作得很好，因此非常适合经济、并行和高通量的筛选，这将有利于未来的结晶和结构-功能确定研究。
这个K（K）米和V（V）最大值Mg的值2+-此处报告的ATP是可操作的，因为它们反映了被调查系统的细节。因此，例如，在标准条件下，立方相作为一组串状丸排列在分析中。构成药丸的立方相是一种开放的多孔材料，水溶性分子和离子在其中扩散。渗入中间相的水通道分子窄，直径为5–10 nm(30). 因此，扩散速度有限，但如释放研究所示，扩散显著(). 因此，很明显，沐浴液中添加的ATP浓度始终是酶所经历的核苷酸浓度的上限在中。在时间零点，丸表面的酶将经历整体浓度，而丸内的DgkA分子在其附近没有ATP。在稳定状态下，丸体表面与时间零点处的情况类似。然而，现在丸中的酶是在ATP浓度从表面向丸芯下降的条件下运行的。因此，测得的活性反映了在ATP浓度范围内运行的酶的活性，ATP浓度的最大值是初始散装沐浴液的最大值。因此K（K）米报告值（3.5 mM）为上限；实际的内在价值较低。为了进行比较，文献中报道的脂质体和在冲浪中为0.2–1.8 mM(31)和1.2毫微米(20)分别是。
根据同样的推理，DgkA的活动报告在中必须被视为操作值。药丸表面的酶分子将直接将ADP生成到沐浴液中，以便立即检测，以减少A类340采用耦合分析方法。然后，这些将展示并产生最大测量活动。相反，与表面活性较低的酶相比，丸内酶的ATP浓度较低。同时，所产生的ADP必须从丸中扩散到沐浴液中，以便通过耦合分析系统进行检测。因此，测得的速率将反映产品从生产地点的这种移动，并且酶越接近团块的圆柱形核心，速率就越慢。因此，记录的推注的操作速率总是小于真实速率。运营V（V）最大值记录在中在标准条件下为14.4 U/mg。为了进行比较V（V）最大值DgkA报告值在冲浪中以单油酸为底物时为26.9U/mg。
尽管刚刚提供了合理化，但可以说V（V）最大值 在中是由于未折叠的和不活跃的酶。在缺乏一种方便、直接的结合方法来量化活性蛋白质的情况下在中我们间接地处理了这个问题。一种突变的热稳定型DgkA，CLLD(32)，显示出相同的相对激酶活性在冲浪中和在中就像野生型一样(表S2). 鉴于CLLD的非凡稳定性，这一发现证实了以下观点：在中是该膜模拟物中全酶活性的反映，而不是未折叠蛋白的指示。我们生长DgkA晶体的能力在中(参见下文,图S2)与此观点一致。
尽管存在上述所有真实但可以理解的DgkA检测并发症在中进度曲线进入一个阶段，在该阶段，测量的速率与时间呈线性关系，反映了在标准分析条件下建立的稳定状态。此外，当该线性区域中的速率作为中间相中蛋白质浓度的函数进行监测时，因此，在分析溶液中，它也与较低蛋白质浓度下的负载量呈线性关系(C类). 这是一项重要的发现，因为这意味着在标准分析条件下，操作速率可以用作活性蛋白质和底物浓度的可靠测量。
蛋白质含量越高，记录的激酶比率下降(C类). 其原因可能包括水溶性底物在中间相中的扩散速度和产物在中间相外的扩散速度，无法满足蛋白质对底物的高需求和产物的扩散。这可能还与蛋白质带来的癸基麦芽糖苷（DM）洗涤剂浓度升高时中间相的变化特性有关。在较高的表面活性剂水平下，这将趋向于层状和远离立方中间相(33,34). 如前所述，本体片层相与支持活性所需类型的水溶性底物和产物的扩散不相容，所述活性可通过偶联酶测定法监测。作为参考，10 mg DgkA/mL的负载量对应于约0.1 M的DM浓度在中，仍远低于触发转换所需的水平在中(33,34). 附带说明，10 mg/mL在用于在中结晶试验。重要的是，蛋白质负载研究表明，该酶在这种条件下具有催化活性。
朝向在Meso中结晶和结构功能研究。
本研究的主要目的是确定整合膜激酶DgkA在并入脂质立方相时是否具有催化活性（且可检测）。显然是这样。因此，该阶段将继续进行结晶试验，以期通过在中现有衍射质量晶体的方法(图S2). 该激酶已被证明能磷酸化多种脂类底物，其中一些底物在未来的晶体学研究中被证明是有用的，目的是破译该激酶的作用模式及其底物选择性的来源。
在本研究中，包含完整膜激酶的脂质立方相已被证明与基于微孔板的催化活性耦合分析相兼容，以便于高通量筛选。立方相的粘性和粘滞特性促进了此类测量。事实上，酶及其脂类底物和产物仍局限于多孔中间相，而其他水溶性底物和产品可自由分配到水浴溶液中，这表明了一种通用且方便的方法来表征与膜状物中脂类起作用的整体膜酶环境。为了支持这一点，磷脂酰甘油磷酸酯（PGP）合成酶PgsA的活性已被成功测定在中(图S3和S4系列). 这里，脂质底物胞苷二磷酸二酰甘油（CDP-DAG）和产物PGP保留在宿主立方相；它们的水溶性对应物，3-磷酸甘油和一磷酸胞苷，可以自由进出充满PgsA的药丸，便于直接分光光度测定。立方相独特的流变性意味着不总是需要单独的步骤来物理分离基质和产品。因此，如果其中一种水溶性底物或产品可以用分光光度法测量，则需要用放射性同位素等进行标记，并且需要进行繁琐的脂质提取(35)无需，活动可直接持续监控。由于其开放、双连续的性质，立方相的优点是蛋白质可以从膜的两侧进行分析。此外，所述的立方中间相系统应能够同时进行重组、功能表征和开发对脂质代谢途径中的顺序反应进行催化的整体膜酶。
方法
详细程序和其他结果见SI文本.
分子生物学、蛋白质生产和纯化。
这个dgk公司根据基因序列合成了一个基因（Genscript）dgk公司A英寸大肠杆菌K12，并使用Nco公司我和经济效益一、表达蛋白的氨基酸序列与pSD0005的氨基酸序列相同(32)其中N端蛋氨酸被六氢双标记肽（MGHHHHHEL）取代。CLLD突变基因与其野生型对应物相同。DgkA和CLLD的生产和纯化按照公开的程序进行(36)稍作修改（请参见SI文本).
重组在Meso中.
按照标准方案将DgkA重组为立方相的双层(8). 在耦合的注射器装置中用单油精均质稀释的蛋白质溶液(37)在室温（RT，19–24°C）下，每三个单油素使用两体积的蛋白质溶液。在需要透明样品的光谱分析中，使用了略为水合的相；相应的体积比为29∶71。在缓冲液中用1%（w/v）DM代替蛋白质溶液制备缺少酶的对照样品。
激酶活性测量。
使用耦合分析系统监测DgkA活性。因此，在单油酸磷酸化过程中ATP的消耗通过PK和LD的顺序作用耦合到NADH的氧化，通过以下变化进行监测A类340(19)96-well板格式(20).
在以下标准条件下，测定重组为立方相的DgkA的激酶活性。这个在中分析混合物（分析混合物2）包含20 mM ATP、0.1 mM EDTA、0.1 mM-EGTA、55 mM醋酸镁、1 mM PEP、0.2 mM DTT、50 mM LiCl、0.4 mM NADH、20 U/mL PK和LDH以及75 mM PIPES，pH 6.9。如上文所述，将3体积的单油酸和2体积的DgkA溶液以66μg/mL均质制备的蛋白质负载中间相转移到50μL注射器（Hamilton）上，该注射器连接到50步分配器（Hamilon）上，并配备22号针头。沿着96 well板（Nunc）中孔的侧壁，在平板阅读器的光路之外，将5微升中间相分散在1μL杆状药丸中。因为中间相是粘性的，所以在分析过程中它仍保留在侧壁上。为了开始反应，向每个孔中添加0.2 mL分析混合物2，足以覆盖药丸。立即将平板置于30°C的微孔板阅读器中，并摇晃5s。A类340每15秒记录一次读数，持续45分钟，每次读数之间摇晃2秒。在每次试验中，使用用缓冲液制备的中间相运行无DgkA空白。与ATP非酶水解和NADH光漂白相对应的背景速率从DgkA存在时记录的速率中减去。检测一式三份。单位平均值（1 U=1μmol底物转化为产物/min）±标准偏差。
分光光度法。
蛋白质的吸光度和荧光测量在冲浪中和在中尺度如前所述进行(13,15,26)稍作修改（请参见SI文本).
薄层色谱法。
TLC用于验证LPA是DgkA对单油素作用的产物。因此，在30°C的1.5-mL Eppendorf管中培养5μL立方相（含和不含DgkA）过夜，并在0.2 mL分析混合物2中浸泡。通过在25°C下以20000 g离心10分钟获得中间相，并用于提取脂质（参见SI文本). 提取的脂质和氯仿标准溶液在硅胶TLC板上斑点，并在氯仿∶甲醇∶丙酮∶醋酸∶水（体积比10∶2∶4∶2∶1）中展开。用磷钼酸染色后，将平板置于150°C的热板上进行显影。
