非典型PKC相互作用蛋白p62通过IL-1–TRAF6途径激活NF-κB

通过TRAF6、IRAK和MyD88激活NF–κB需要aPKC和p62

为了确定TRAF6作用是否需要aPKC和/或p62，用κB-荧光素酶报告子、质粒对照或TRAF6表达载体、p62表达质粒或增加λ/κPKC或ζPKC显性阴性突变体或p62反义结构的浓度转染293个细胞。这些实验的结果表明，显性负λ/∏PKC的表达（图​（图2A）2A） 或ζPKC（未显示），或p62耗尽（图​（图2A），2A） ，通过TRAF6以与RIP类似的方式削弱NF–κB的激活(桑兹等., 1999). 此外，p62的过度表达有利于TRAF6激活NF–κB（图​（图2A）。2A） ●●●●。IRAK是IL-1信号中TRAF6上游的一个重要成分（见上文）。因此，确定aPKCs和p62是否对IRAK信号转导至关重要是很有意义的。为了解决这一可能性，将κB荧光素酶报告子与IRAK或IRAK2的质粒控制或表达载体一起转染293个细胞，同时增加λ/κPKC显性阴性突变体的浓度（图​（图2B）2B） 或p62反义结构（图​（图2B）。2B） ●●●●。有趣的是，λ/κPKC突变体的表达或p62的缺失严重抑制了IRAK对NF–κB的激活，这与p62和aPKC是IRAK–TRAF6信号通路的靶点的概念一致。注意，MyD88激活NF–κB的能力同样通过转染λ/κPKC的显性负突变体或通过耗尽p62而受到抑制（图​（图22B） ●●●●。

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图2。λ/κPKC和p62在TRAF6、IRAK和MyD88激活NF–κB中的作用。用1 ngκB-荧光素酶报告基因质粒和0.1μg Flag-TRAF6转染293细胞亚流培养物(一个)、HA–IRAK、Flag-IRAK2或Myc-MyD88(B类)有或没有1或2μg HA–λ/ιPKC显性阴性突变体（HA–λ/ιPKC^静音)（A和B），2μg HA–p62（A）表达载体或反义p62质粒（p62^AS公司)（A和B），以及足够的空载体，以提供2.5μg的总DNA。24小时后，制备细胞提取物并测定荧光素酶活性水平。结果是三个独立实验的平均值±标准偏差，两个实验分别进行孵育。下面的面板显示了其中一个实验中不同标记结构和p62水平表达的代表性控制斑点。

TRAF6不仅参与NF–κB，而且对IL-1诱导JNK活化也很重要。为了确定p62和aPKCs是否在TRAF6信号通路的JNK分支中发挥任何作用，用TRAF6表达载体以及λ/ιPKC显性阴性突变体或p62反义构建体的质粒对照或表达载体转染293细胞。然后，用抗磷酸Jun抗体免疫印迹法测定细胞提取物中JNK通路的活性。图中的结果​图3三结果表明，无论是λ/∏PKC突变体还是p62的缺失都不能显著抑制TRAF6对JNK的激活。

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图3。在TRAF6诱导的JNK激活中，p62和λ/∏PKC缺乏作用。用3μg Flag-TRAF6转染293细胞亚流培养物，转染或不转染6或10μg HA–λ/l.PKC显性阴性突变体^MUT公司)或反义p62质粒（p62^AS公司)，以及足够的空载体，以提供20μg的总DNA。24小时后，制备细胞提取物，并用抗磷酸Jun抗体通过免疫印迹分析测定磷酸Jun。提取物也用Flag和HA表位以及p62的抗体进行免疫印迹。这是另外两个具有类似结果的代表性实验。

TRAF6与体内p62相互作用

因为p62以TNFα诱导的方式与RIP结合(桑兹等., 1999)TRAF6是IL-1激活NF–κB的关键中介(曹等1996年b;凯利赫等., 1998;洛马加等., 1999)，我们想在接下来的一系列实验中确定p62是否能与TRAF6相互作用。为了解决这种可能性，293个细胞被转染有Myc-tagged版本的p62，同时增加标记TRAF6或TRAF5的浓度，或HA标记的TRAF2构建物。这三个是唯一参与NF–κB活化的TRAF(建筑等., 1998). 细胞提取物用抗Flag或抗HA抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀用抗Myc抗体进行免疫印迹分析。图中的结果​图4A4A和B证明p62与TRAF6共免疫沉淀，但与TRAF5或TRAF2不共免疫沉淀。由于这些是过度表达实验，p62与TRAF6的相互作用是配体无关的。注意，即使在IL-1或TNFα存在的情况下，TRAF5或TRAF2也不会与p62相互作用（未显示）。此外，图中的实验​图55显示TRAF6的存在不影响p62与ζPKC相互作用的能力，并且这三种蛋白质可以在三元复合物中共同免疫沉淀。

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图4。互动体内p62中含有TRAF6，但不含有TRAF2或TRAF5。将4μg Myc-p62表达质粒单独或与15或20μg Flag-TRAF6、2.5、5或10μg Flage-TRAF5联合转染在直径100 mm的平板中的293个细胞亚流培养物(一个)或2、4或6μg HA–TRAF2(B类)和足够的pCDNA3质粒，以产生25μg的总DNA。转染后（24 h），用抗Flag（A）或抗HA（B）抗体免疫沉淀细胞提取物，然后用抗Myc抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。凝胶显示在(C类)表明Myc-p62在所有转染点的表达量是可比较的。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。

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图5。ζPKC与p62和TRAF6形成三元络合物。将293个细胞在100 mm直径的平板中的亚流培养物转染4μg Myc-p62和5μg HA–ζPKC表达质粒，或者单独转染，或者与20μg Flag-TRAF6和足够的pCDNA3质粒联合转染，以获得30μg总DNA。转染后（24 h），用抗Myc或抗Flag抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，然后用抗Flag、抗Myc和抗HA抗体对免疫沉淀进行免疫印迹分析。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。

总的来说，这些结果表明p62与TRAF6特异性相互作用体内达到与RIP相当的程度(Sanz等人，1999年). 为了在更生理学的环境中证明这种相互作用，我们生成了表达标记TRAF6的HepG2细胞，其水平仅比内源性蛋白高1.5到2倍。这些细胞要么未经处理，要么用IL–1刺激不同时间，然后制备提取物，并用多克隆亲和纯化的抗p62抗体免疫沉淀内源性p62。作为对照，细胞提取物也与免疫前血清进行免疫沉淀。有趣的是，在缺乏IL–1的情况下，内源性p62与TRAF6几乎没有关联（图​（图6A）。6A） ●●●●。然而，IL-1的添加促进了两种蛋白质的快速和可重复的结合（图​（图6A）。6A） ●●●●。接下来我们分析了两种内源性分子的相互作用。用IL–1处理或不处理HepG2细胞不同时间的细胞提取物与抗p62抗体孵育，以免疫沉淀内源性p62。然后，用抗TRAF6抗体进行免疫印迹分析这些免疫沉淀物。图中的结果​图6B6B证明在未刺激的细胞中内源性p62和TRAF6很少或没有关联，但这种相互作用在IL–1刺激时变得明显。这些结果，以及那些证明p62在IL-1诱导的NF–κB活化中的关键作用的结果，强烈表明TRAF6–p62相互作用在功能上相关。

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图6。内源性p62与TRAF6的相互作用依赖于IL-1。(一个)用25μg Flag-TRAF6表达载体转染直径为100 mm的HepG2细胞亚流培养物。转染后20小时，细胞要么未经处理，要么用IL–1（1 ng/ml）刺激不同时间。然后，用预免疫或抗p62多克隆抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，并用单克隆抗Flag抗体通过免疫印迹分析免疫沉淀。将等分试样[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]加载到凝胶中，并用抗Flag抗体通过免疫印迹进行分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。(B类)HepG2细胞在直径100 mm的平板中的亚流培养物在不同时间内用IL–1（1 ng/ml）刺激或不刺激。然后，用多克隆抗p62抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，并用单克隆抗TRAF6和抗p62的抗体进行免疫印迹分析免疫沉淀。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。

IRAK是TRAF6上游IL–1信号传导的关键成分（见上文）。因此，研究p62是否可以通过TRAF6与IRAK形成复合物是很有意义的。因此，用HA–IRAK和Myc-p62的表达载体转染HepG2细胞，无论是否含有Flag-TRAF6，之后对细胞进行处理或用IL–1刺激。细胞提取物用抗Myc抗体免疫沉淀p62，免疫沉淀用抗HA抗体分析以检测相关的IRAK。图中的结果​图77证明IRAK与p62的共同免疫沉淀仅在转染TRAF6的受刺激细胞中，表明TRAF6实际上在IRAK和p62之间形成了桥梁。为了获得p62–TRAF6–IRAK复合物存在的其他证据，我们用Flag-TRAF6和HA–IRAK-以及绿色荧光蛋白（GFP）–p62构建物转染HepG2细胞，然后用IL–1刺激细胞10分钟或不处理细胞。然后用兔多克隆抗HA抗体和抗兔Alexa 594抗体（红色荧光）检测IRAK，用单克隆抗Flag抗体和抗小鼠Cy5抗体（蓝色荧光）检测TRAF6，用三重共聚焦激光扫描显微镜分析细胞。绿色荧光显示GFP–p62的表达。GFP–p62的表达呈现特征性的间断细胞溶质染色（图​（图8A8A和B，面板A、B、d和f；桑切斯等., 1998). 根据图中所示的数据​图8A，8A、 在未刺激的HepG2细胞中，TRAF6和IRAK在面板A和c中检测到部分共定位，呈粉红色信号。然而，TRAF5和p62很少或没有共定位（图​（图8A，8A、 面板d）可能是因为这两种蛋白在这些细胞中的表达水平低于293细胞，在没有任何刺激的情况下，很容易检测到这两种蛋白质之间的相互作用。观察到IRAK与TRAF6在未刺激HepG2细胞中至少部分共定位（图​（图8A，8A、 面板A和c）可能表明其相互作用的亲和力可能强于TRAF6与p62的亲和力。注意，IRAK与p62完全没有共定位（图​（图8A，8A、 面板A和b）。然而，当HepG2细胞暴露于IL–1时，IRAK–TRAF6复合物对p62信号的重新定位显著。因此，图中的数据​图8B8B显示IRAK和TRAF6与p62有很好的共定位，在面板B中检测为黄色信号，在面板c中检测为粉红色，在面板d中检测为淡蓝色。在面板a中，信号为白色，表明三个分子的共定位。

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图7。TRAF6将p62链接到IRAK。将4μg Myc-p62表达质粒单独或与4μg HA–IRAK（含或不含15μg Flag-TRAF6）和足够的pCDNA3质粒联合转染HepG2细胞在100 mm直径平板中的亚流培养物，以获得25μg总DNA。转染后（24小时），细胞未经处理或用IL–1刺激10分钟。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞提取物，然后用抗HA抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。

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图8。IL-1刺激细胞中p62与TRAF6和IRAK的共聚焦。用Flag-TRAF6和HA–IRAK以及GFP–p62构建物转染HepG2细胞，然后对细胞进行处理(一个)或用IL–1刺激10分钟(B类). 然后通过三重共聚焦激光扫描显微镜分析细胞，用兔多克隆抗HA抗体和抗兔Alexa 594抗体（红色荧光）检测IRAK，用单克隆抗Flag抗体和抗小鼠Cy5抗体（蓝色荧光）检测TRAF6。绿色荧光表示GFP–p62的表达。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。

绘制负责与TRAF6相互作用的p62区域

为了确定p62的哪个区域是与TRAF6相互作用所必需的，不同标记的p62缺失突变体（图​（图9）9)与标记的TRAF6一起转染到293细胞中，并通过上述免疫沉淀分析确定其相关性。如前所述，包含p62的氨基酸1–117的区域是必要的，足以解释与ζPKC的相互作用，而不是与RIP或TRAF6的相互作用（图​（图9；9;桑兹等., 1999). 该区域包含一个新的酸性基序（氨基酸69-81），与酵母蛋白CDC24的序列同源。有趣的是，简单删除该基序就足以消除p62与ζPKC的相互作用，而不会影响RIP或TRAF6的结合。与RIP的报告类似(桑兹等., 1999)p62氨基酸1–266或117–439的表达足以解释TRAF6的相互作用（图​（图9），9)，而氨基酸117–439的缺失完全消除了它（图​（图9）。9). 这些结果表明，p62与TRAF6的相互作用需要包含氨基酸117-266的区域。注意，这与TNFα信号级联中p62与RIP结合的区域相同(桑兹等., 1999). 有趣的是，RIP激活NF–κB的主要负片段的表达(桑兹等., 1999)也抑制TRAF6对该参数的影响（未显示）。该区域包括ZZ域，一种功能未知的新型非典型锌指基序(庞廷等., 1996). 为了确定该ZZ区域对p62与RIP或TRAF6的相互作用是否重要，删除该区域以生成p62Δ^ZZ公司突变体。如上所述，评估了该结构的HA标记版本与标记TRAF6或RIP的潜在交互作用。有趣的是，ZZ区的缺失完全消除了p62与RIP的相互作用，但没有与TRAF6的相互作用（图​（图9）。9). 这是首次证明ZZ基序作为蛋白质-蛋白质相互作用模块的作用。接下来，我们试图确定p62的哪个区域可以解释与TRAF6的相互作用。在这方面，最近有报道称存在一种p62亚型，称为ZIP2，它在大脑中特异表达(龚等., 1999). 这种亚型由选择性剪接产生，缺乏225-251个氨基酸。实验结果总结如图​图99证明这27个氨基酸的缺失严重损害了TRAF6的结合，而不是RIP与p62的结合。这些结果表明，p62可以同时锚定RIP和TRAF6，并且它们不会竞争p62中的同一结合位点。该结论与图中的结果一致​图1010表明TRAF6表达量增加并不影响RIP与p62的结合。

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图9。用于p62–TRAF6和p62–RIP相互作用结构域映射的各种构建体的示意图。按照材料和方法中的说明制备结构。AS、酸性序列和ζPKC相互作用区；ZZ，锌指域。

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图10。p62与TRAF6和RIP的同时相互作用。用4μg HA–p62表达质粒和5μg Flag-RIP单独或与5、10或15μg Flage-TRAF6和足够的pCDNA3质粒联合转染直径为100 mm的培养板中293个细胞的亚流培养物，以获得25μg的总DNA。转染后（24 h），用抗HA抗体免疫沉淀细胞提取物，然后用抗Flag抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分试样[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]加载到凝胶中，并用相应的抗标签抗体通过免疫印迹进行分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。

p62与TRAF6的C末端结构域的相互作用

除TRAF1外，所有TRAF都有一个N端区域，包括一个环和几个锌指，以及一个保守的C端模块（TRAF结构域），其中包含一个N近端TRAF-N线圈序列和一个C近端TRAF C结构域(建筑等., 1998). 为了确定TRAF6分子中的哪些序列负责与p62的相互作用，用Myc-p62的控制载体或表达质粒以及由TRAF结构域（包括N-和C-近端区域）组成的标记构建物转染293细胞。为了进行比较，还用标记的全长TRAF6表达载体转染细胞。免疫沉淀实验如图所示​图11A11A证明p62与TRAF6的TRAF结构域的结合程度与全长分子相当。TRAF结构域是所有TRAF中最保守的区域。然而，TRAF6在这个序列中只有29%的同源性，这使得它成为最有分歧的区域(曹等1996年b;石田等., 1996;建筑等., 1998). 这可以解释为什么p62能够选择性地结合TRAF6而不是TRAF2或TRAF5。

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图11。p62与TRAF6的TRAF结构域的相互作用。用标记的野生型TRAF6（15μg）表达质粒或缺失TRAF6 N端结构域的突变体（20μg；TRAF6–C）转染293细胞亚流培养物(一个)或与HA–TRAF2（7.5μg）或25μg HA–标记嵌合结构TRAF2/6或TRAF6/2(B类)以及4μg控制载体或Myc-p62表达质粒。用抗标志（A）或抗HA（B）抗体免疫沉淀细胞提取物，并用抗Myc（A和B）、抗标志（A）或抗HA（B）的抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用抗Myc抗体进行免疫印迹分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。

TRAF结构域作为受体对接和寡聚区以及NF–κB通路中信号分子的招募模块，如RIP2(麦卡锡等., 1998)或ECSIT(科普等., 1999)，与p62一样，对TRAF6具有选择性。另一方面，含有环指和锌指的TRAF6的N端区域的缺失不仅抑制了TRAF6激活NF–κB的能力(曹等1996年b;建筑等., 1998;波特等., 1999)但也会产生一个显性负性分子。这表明N末端区域必须完整，TRAF6才能发出信号，而缺乏该结构域的突变体可能会将信号分子保持在一个不活跃的复合物中，无法激活该途径的下游成分。为了确定p62是否也可以结合TRAF6的N末端区域，用对照载体或TRAF6的HA标记突变体的表达质粒（其中TRAF结构域被删除（TRAF6ΔC））以及对照载体或Myc-p62表达质粒转染293细胞。细胞提取物用抗HA抗体免疫沉淀，免疫沉淀用抗Myc抗体免疫印迹分析。这些实验的结果表明，p62与TRAF6的N端部分没有可检测的关联（未显示）。这表明p62与ECSIT类似(科普等., 1999)，与TRAF6的TRAF域相互作用。然而，Karin及其同事最近表明，TRAF6和TRAF2的齐聚是N末端结构域发生相互作用的必要事件(波特等., 1999). 为了解决寡聚化可能触发TRAF6的N末端结构域与p62相互作用的可能性，我们利用了p62不与TRAF2结合的事实，以及TRAF2的C末端区域与TRAF6一样，能够在过度表达时形成寡聚体(建筑等., 1998). 因此，我们生成了一个嵌合分子（TRAF6/2），其中TRAF6的N端结构域融合到TRAF2的C端区域。作为对照，我们通过将TRAF2的N端部分融合到TRAF6的TRAF结构域，生成互补结构（TRAF2/6）。作为阴性对照，将这两种构建物和野生型TRAF2的HA标记版本与Myc-p62质粒一起转染到293细胞中。细胞提取物用抗HA抗体免疫沉淀，免疫沉淀用抗Myc抗体免疫印迹分析。图中的结果​图11B11B表明p62与TRAF2/6共沉淀，但与TRAF6/2不共沉淀。正如预期的那样，TRAF2控件没有绑定p62（图​（图11B）。11B） ●●●●。这些结果与图中的数据一致​图11A，11A、 证明p62与TRAF6的TRAF结构域结合，并表明TRAF2的N端区域的存在不会影响这种相互作用。p62与TRAF6/2突变体缺乏相互作用表明TRAF的N末端结构域不能与p62相互作用，即使是寡聚形式。

质粒

pCDNA3-HA–λ/λPKC^MUT公司、pCDNA3-HA–λ/λPKC、pCDNA3-HA–ζPKC和pCDNA3-HA–αPKC^MUT公司，pCDNA3-Myc-ζPKC，pCDNA 3-HA–p62，pCDN A3-Myc-p62，pRK5-p62^AS公司、3EconA-Luc、pRK5-Flag-RIP和pCDNA3-HA–TRAF2已在前面进行了描述(Diaz–Meco等人，1996a,b条;Sanchez等人，1998年;Sanz等人，1999年). 通过插入生态RI将全长p62 cDNA消化到pEGFP-C1载体中。将p62或RIP的不同结构域亚克隆到pCDNA3-HA、pCDNA3-Flag或pCDNA3-4myc载体中。pCR-Flag-TRAF6、pCR-Frag-TRAF6-C和pCR-Flag-TRAF5质粒如前所述(Akiba等人，1998年). 将包含TRAF6的1–274个氨基酸的TRAF6ΔC结构亚克隆到pCDNA3-HA载体中。含有TRAF2的氨基酸1-272的TRAF2/6嵌合体与TRAF6的氨基酸273-531融合，含有TRAF6氨基酸1-273的TRAF6/2嵌合体与RAF2的胺基酸273-501融合，亚克隆到pCDNA3-HA中。pCDNA3-HA–TRAF6ΔC-Gyr是通过将TRAF6的1–273个氨基酸与细菌DNA回转酶（GyrB）的B亚单位融合而构建的(Farrar等人，1996年)转化为pCDNA3-HA。pcDNA3-HA–IRAK来自Keith Ray博士（英国葛兰素威康）慷慨提供的pcDNA3-IRAK。质粒Flag-IRAK2和Myc-MyD88是David Goeddel博士（Tularik Inc.）赠送的礼物。

免疫沉淀

对于内源性蛋白质的免疫沉淀，使用HepG2细胞。对于共免疫沉淀，用所示的表达质粒转染接种在100毫米培养皿上的亚融合293或HepG2细胞。转染后（24小时），用1 ng/ml IL–1刺激或不刺激HepG2细胞。然后收集细胞并在缓冲液PD（40 mM Tris–HCl pH 8.0，500 mM NaCl，0.1%NP–40，6 mM EDTA，6 mM-EGTA，10 mMβ-甘油磷酸，10 mM-NaF，10 mM.磷酸苯酯，300μM Na）中溶解_三VO（旁白）₄、1 mM苯甲脒、2 M苯甲基磺酰氟、10μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮氨酸蛋白酶、1μg/ml胃蛋白酶抑制素、1 mM-二硫苏糖醇）。提取物在15000下离心两次克将1 mg全细胞裂解物在PD缓冲液中稀释15 min，并与5–10μg所示抗体孵育。将该反应混合物在冰上孵育2 h，然后添加25μl蛋白A或G珠，并在4°C下将混合物轻轻旋转再孵育1 h。然后用PD缓冲液将免疫沉淀物洗涤五次。样品在8%SDS-PAGE上分离，转移到硝化纤维素ECL膜（Amersham）上，并用相应抗体进行Western blot分析。用ECL试剂（Amersham）检测蛋白质。在更严格的缓冲液（0.1%NP–40，0.7 M NaCl）中进行免疫沉淀时，也检测到TRAF6–p62相互作用。

共焦免疫荧光显微镜

HepG2细胞在玻璃盖玻片上生长，在补充有FCS（10%）的MEM中达到80%的融合，分别转染5μg HA–IRAK、Flag-TRAF6和GFP–p62，然后未经处理或用1 ng/ml IL–1β刺激10分钟。细胞在冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）中快速洗涤两次，室温下在4%甲醛中固定15分钟。用PBS清洗细胞四次，并用0.2%Triton X–100渗透。用10 mM甘氨酸淬灭游离醛基团，并在37°C下用一级抗体孵育固定细胞1 h。使用的二级抗体是抗兔Alexa 594（分子探针）和抗鼠Cy5（Amersham）。将玻璃盖玻片安装在Mowiol上，并使用Radiance 2000 Bio-Rad共焦系统（加利福尼亚州里士满Bio-Read）对其进行检查，该系统安装在蔡司Axiover S100电视显微镜上（德国奥伯科钦蔡司）。