活性氧依赖性RhoA激活介导高氧肺纤维化胶原合成

细胞培养和高氧暴露

人肺成纤维细胞HFL-1来自ATCC。将第三代至第八代细胞维持在含有10%胎牛血清和抗生素（10μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20μg/ml庆大霉素和2μg/ml真菌素）的F12K培养基中，并在融合后2或3天使用。对于高氧暴露，将融合的HFL-1成纤维细胞培养至95%O₂和5%CO₂37°C时。正常氧是空气和5%CO₂在一些实验中，融合的HFL-1成纤维细胞暴露于80%的O₂和5%CO2持续12小时，然后50%O₂和5%CO₂在37°C下保持12小时。

RhoA活性的测定

根据制造商协议，使用Millipore的Rho活化试验检测RhoA GTPase的活性。简言之，将HFL-1成纤维细胞暴露于高氧下1-24小时，并在含有25mM HEPES、150mM NaCl、1%Igepal CA-630、1mM Mg Cl2、1mM EDTA和10%甘油的MLB缓冲液中裂解细胞。将裂解产物与与谷胱甘肽-糖结合的重组Rhotekin在4°下孵育45分钟。通过离心收集免疫沉淀物，并用MLB缓冲液洗涤三次。通过在30μl SDS免疫印迹样品缓冲液中煮沸样品，从琼脂糖珠中洗脱蛋白质。琼脂糖珠在10000 g下离心造粒，上清液通过Western blot分析RhoA含量。

RhoA蛋白的敲除

使用针对RhoA mRNA的siRNA敲除RhoA蛋白。siRNA来自Santa Cruz Biotechnology（#sc-29471）。使用阴性对照siRNA（#AM4611，Applied Biosystems）作为对照。这些公司没有披露这些siRNA的序列。根据制造商的方案，在含有4%FBS的F12K培养基中，使用RNAiFest转染试剂（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen），用1μg抗RhoA mRNA的siRNA或对照siRNA转染HFL-1成纤维细胞。siRNA与转染试剂的比例为1:3。转染后48 h，HFL-1细胞暴露于高氧或常氧环境中。然后分析RhoA活性以及RhoA和胶原蛋白I的蛋白水平。

RNA分离和实时PCR

根据制造商的方案，使用RNAesy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）从肺成纤维细胞和肺组织匀浆中分离出总RNA。测量COL1A1公司mRNA和COL1A2公司mRNA，定量实时RT-PCR通过使用来自Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）的TaqMan®基因表达分析进行。小鼠的分析ID为Mm01302043_g1COL1A1公司，Mm01165187_m1用于鼠标COL1A2，Hs00164004_m1人体用COL1A1、，Hs00164099_m1人体用COL1A2公司和Hs03003631_g1用于18s rRNA。该公司未披露引物序列。ABI 7500序列检测器（加利福尼亚州福斯特市Perkin-Elmer Applied Biosystem）编程用于PCR条件：95°C 10分钟，40个95°C循环15秒，60°C 1分钟COL1A1公司和COL1A2公司mRNA含量，比较阈值周期（C_T型)方法。C类_T型显示了PCR周期，在该周期中，可以首先检测到报告荧光高于背景信号的增加。C类_T型首先从C中减去内源性对照（18s rRNA）的值_T型得出ΔC的胶原蛋白基因值_T型值。亲戚COL1A1公司和COL1A2公司然后使用表达2计算mRNA含量^-ΔΔC_T型式中，ΔΔC的值_T型减去ΔC得到_T型ΔC的治疗组_T型对照组。

用编码野生型RhoA、组成型活性RhoA突变体或显性阴性RhoA突变体的质粒转染成纤维细胞

根据制造商协议，使用Lipofectamine LTX和PLUS试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）将含有野生型RhoA cDNA或组成活性RhoA（Q63L）或显性阴性RhoA突变体cDNA（T19N）（Addgene，Cambridge，MA）的哺乳动物表达载体转染到HFL-1细胞中。转染后48 h，细胞暴露于高氧或常氧，然后分析RhoA、胶原蛋白I和RhoA活性的水平。

RhoA和GDI的联合免疫沉淀

成纤维细胞HFL-1裂解物或肺匀浆与抗RhoA抗体在4℃孵育过夜。加入30μl蛋白A琼脂糖凝胶，并将样品在4°C下进一步孵育2小时。通过离心收集免疫沉淀物，并在含有50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl和0.1%Triton X-100的缓冲液中洗涤三次。通过在30μl SDS免疫印迹样品缓冲液中煮沸样品，从sepharose珠中洗脱蛋白质。用10000 g离心法造粒Sepharose珠，用Western blot分析上清液中的RhoA和GDI。

蛋白质印迹分析

从细胞或肺匀浆（20至40μg）中提取的裂解蛋白在4-20%三甘醇SDS-PAGE上分离，并电泳转移到硝化纤维素膜上。将膜在室温下的封闭溶液中培养1-2小时，然后在4°C下与抗胶原蛋白I、RhoA、GDI和GAPDH的一级抗体杂交过夜。用免疫化学发光法检测条带。密度通过Bio-Read Quantity One软件进行量化。

超氧化物自由基的测定

用10μM DHE负载HFL-1成纤维细胞和小鼠肺冰冻切片30 min。清洗后，使用激光共聚焦扫描显微镜LSM 510获取荧光图像。激发和发射波长分别为510 nm和590 nm。

细胞增殖试验

使用罗氏试剂盒（美国印第安纳波利斯）检测HFL-1肺成纤维细胞的增殖，该试剂盒监测溴脱氧尿苷（BrdU）并入新合成DNA的情况。根据制造商的说明，使用抗BrdU过氧化物酶结合物检测BrdU。停止反应后，使用SpectraMax M2测量A450^{e（电子）}微孔板阅读器。

动物和高氧暴露

年龄在8至10周的雄性C57BL/6小鼠购自Jackson Laboratory（ME Bar Harbor）。所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》的指导原则进行，并经佐治亚州卫生科学大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。对于高氧暴露，小鼠被随意放置在一个透明的聚丙烯塑料室（30“×20”×20“）中，可以自由获取食物和水。使用Proox氧气控制器（BioSpherix，Lacona，NY）将试验箱中的氧气浓度维持在80%，持续5天，然后再改变为50%，持续10天（总共15天）。氧气混合物加湿，CO浓度₂在试验箱中的含量低于0.3%。从换成50%氧气的时候开始，高氧小鼠被给予ROCK抑制剂Y27632（5 mg/kg，每天IP注射）或ROS清除剂替龙（1.5 g/kg，每天IP注入）或相同体积的PBS。正常小鼠被保存在室内空气中，并且每天IP注射相同数量的替龙或Y27632，或与高氧小鼠同时使用PBS。

小鼠肺部实验

麻醉小鼠（戊巴比妥，90 mg/kg，i.p.）并插管气管。然后通过开胸手术对小鼠实施安乐死。通过肺动脉注入PBS冲洗肺循环中的血液，并取出心肺。分离右肺并将其在液氮中冷冻以制备匀浆，左肺在25 cm H处填充4%多聚甲醛（PFA）溶液₂在4%PFA中固定24 hCOL1A1公司和COL1A2公司在肺匀浆中测定。

肺形态分析

固定后，左肺在吞咽中段切片，并用石蜡包埋。将20张7μm厚的载玻片切片，然后进行Masson三色染色，以进行胶原蛋白和形态学分析。每个肺随机选择10片载玻片，并用奥林巴斯BX41显微镜进行检查。使用奥林巴斯DP72数码相机和DP2-BSW软件记录图像。每个载玻片至少检查10个显微镜视野。胶原染色强度通过ImageJ软件的颜色直方图模式测量，并如前所述表示为蓝色与绿色的比率[25].

高氧诱导HFL-1肺成纤维细胞RhoA活化

为了确定高氧是否激活RhoA，HFL-1人肺成纤维细胞暴露于高氧（95%氧气）中3–24小时，然后使用下拉法测量RhoA的激活。如所示图2成纤维细胞暴露于95%的氧气中，导致活性RhoA的蛋白质含量随时间而增加，而总RhoA蛋白没有变化。活性RhoA在高氧暴露6 h时明显增加，12 h时达到最大值。这些数据表明，高氧诱导HFL-1肺成纤维细胞中RhoA活化。

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图2

高氧诱导肺成纤维细胞RhoA活化。将HFL-1细胞暴露于95%氧气中3–24 h，然后按照材料和方法中的描述测定细胞裂解液中的活性RhoA和总RhoA。（A） 是4个独立实验的代表性斑点。（B） 是描述活性RhoA蛋白增加的条形图。结果表示为平均值±SE；n=4个实验。*与0时间点相比，P<0.05。

RhoA和ROCK抑制剂可防止高氧诱导的胶原合成和细胞增殖增加

为了研究RhoA激活是否参与高氧诱导的胶原合成，在存在和不存在细胞可渗透的Rho抑制剂C-3转移酶（CT-04，1μg/ml）或ROCK抑制剂Y27632（10μM）的情况下，将HFL-1肺成纤维细胞暴露于高氧（95%氧气）24小时。我们发现CT-04和Y27632都能阻止高氧诱导的胶原蛋白I含量增加(图3A和3B). 此外，CT-04和Y27632阻断了COL1A1公司和COL1A2公司在高氧HFL-1细胞中(图3C). 此外，如中所示补充图1肺成纤维细胞暴露于80%的氧气中12h，然后再暴露于50%的氧气中12 h，细胞增殖增加。C-3转移酶（CT-04，1μg/ml）减弱了高氧诱导的细胞增殖增加。这些结果表明，RhoA激活与高氧诱导的胶原mRNA表达有关COL1A1公司和COL1A2公司胶原蛋白I合成和细胞增殖。

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图3

RhoA抑制剂CT-04和ROCK抑制剂Y27632可减轻高氧诱导的肺成纤维细胞胶原蛋白I合成增加。HFL-1细胞暴露于95%的氧气中，在有或无细胞渗透性Rho抑制剂C-3转移酶（CT-04，1μg/ml）或ROCK抑制剂Y27632（10μM）的情况下24 h，然后胶原蛋白I（A和B）的蛋白质含量和mRNA水平COL1A1公司和COL1A2公司（C） 按照材料和方法中的说明进行测定。（A） 是4个独立实验的代表性斑点。（B） 是描述胶原蛋白I蛋白变化的条形图。结果表示为平均值±SE；n=4个实验。*与常氧组相比，P<0.05。

组成活性RhoA突变体Q63L的过度表达增加胶原蛋白-1的蛋白质含量

为了检测活性RhoA水平是否与胶原合成呈正相关，用含有野生型RhoA和组成活性Rho-A突变体Q63L的质粒转染HFL-1肺成纤维细胞[26]. 如所示图4A和4B，在具有组成活性Rho-A突变体Q63L的HFL-1细胞中，胶原蛋白I的蛋白含量要高得多，这表明组成活性Rhos-A突变型的过度表达增加了胶原蛋白I合成。这一结果进一步证明了活性RhoA与胶原蛋白合成呈正相关。

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图4

RhoA激活是高氧诱导肺成纤维细胞胶原蛋白I合成增加的原因。（A） 和（B）：HFL-1成纤维细胞转染含有或不含有野生型RhoA基因和组成活性RhoA突变Q63L的质粒。转染后48小时，测定胶原-I和GFP（质粒中的标签）的蛋白质含量。（A） 是4个独立实验的代表性斑点。（B） 是描述胶原蛋白I和GFP蛋白变化的条形图。结果表示为平均值±SE；n=4个实验。*与野生型质粒组（WT质粒）相比，P<0.05。（C） 和（D）：用含有野生型RhoA基因和显性阴性RhoA突变T19N基因的质粒转染HFL-1成纤维细胞。转染后48h，细胞暴露于常氧或高氧（95%氧气）下24h。测定胶原蛋白I的蛋白质含量。（C） 是4个独立实验的代表性斑点。（D） 是描述胶原-I蛋白变化的条形图。结果表示为平均值±SE；n=4个实验。*与常氧组相比，P<0.05。（E） 和（F）：用对照siRNA或RhoA siRNA转染HFL-1成纤维细胞。转染后48 h，细胞暴露于常氧或高氧（95%氧气）下24 h。测定胶原蛋白I和总RhoA的蛋白含量。（E） 是4个独立实验的代表性印迹。（F） 是描述胶原蛋白I蛋白变化的条形图。结果表示为平均值±SE；n=4个实验。*与常氧组相比，P<0.05。

显性负性RhoA突变体T19N和RhoA siRNA的过度表达可防止高氧诱导的胶原合成增加

为了进一步研究RhoA激活是否与高氧诱导的胶原合成有关，我们测定了转染含有野生型RhoA和显性阴性RhoA突变体T19N的质粒的HFL-1肺成纤维细胞中胶原蛋白I的合成[26]以及在正常和高氧条件下控制siRNA和RhoA siRNA。如所示图4C和4D高氧增加了转染含有野生型RhoA质粒的HFL-1细胞中胶原蛋白I的含量。然而，在转染含有显性阴性RhoA突变体T19N的质粒的HFL-1细胞中，高氧诱导的胶原蛋白I蛋白升高被阻止。此外，使用RhoA siRNA敲低RhoA表达可阻止高氧肺成纤维细胞中胶原蛋白I蛋白的增加(图4E和4F). 总之，这些结果表明RhoA激活介导高氧诱导的胶原蛋白I合成。

活性氧清除剂泰隆预防高氧诱导的RhoA活化和胶原合成

为了研究活性氧（ROS）在高氧诱导的RhoA活化和胶原合成中的作用，将肺成纤维细胞暴露于高氧（95%氧气）中24小时，并在存在或不存在活性氧清除剂蒂龙的情况下。如所示补充图4高氧可显著增加活性氧的产生，而替龙（5 mM）可阻止高氧HFL-1细胞中活性氧的增加。重要的是，我们发现高氧诱导HFL-1细胞活性RhoA和胶原蛋白I含量增加(图5). 此外，用替龙（5 mM）处理的高氧HFL-1细胞中活性RhoA和胶原蛋白I的增加被阻止(图5)表明肺成纤维细胞中RhoA活化和RhoA介导的胶原蛋白I合成是ROS依赖性的。

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图5

活性氧清除剂替龙可防止高氧诱导的RhoA活化和成纤维细胞中胶原蛋白I的表达。将HFL-1细胞暴露于95%氧气或常压氧气中，在有或无膜透性ROS清除剂tiron（5 mM）的情况下暴露24 h，然后按照材料和方法中的描述测量RhoA活性和胶原蛋白I含量。（A） 是4个独立实验的代表性印迹。（B） 是描述活性RhoA蛋白变化的条形图。（C） 是描述胶原蛋白I蛋白变化的条形图。结果表示为平均值±SE；n=4个实验。*与常氧组相比，P<0.05。

活性氧清除剂替龙预防高氧HFL-1成纤维细胞中RhoA和GDI联合减少

为了研究高氧诱导RhoA活化的机制，我们使用免疫共沉淀法分析了RhoA和GDI的相关性。如所示图6HFL-1成纤维细胞暴露于高氧（95%氧气）下6 h，导致使用抗RhoA抗体的免疫沉淀法降低GDI的量。此外，替龙还阻止了RhoA抗体降低GDI量的减少(图6). 这些数据表明，高氧抑制了RhoA和GDI之间的联系。高氧肺成纤维细胞ROS生成增加导致RhoA从GDI中分离，导致Rho A活化。

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图6

高氧和替龙对肺成纤维细胞RhoA-GDI相关性的影响。将HFL-1成纤维细胞在存在和不存在膜可渗透ROS清除剂替隆（5mM）的情况下暴露于95%的氧气或常氧下24小时，之后通过使用抗RhoA抗体的共免疫沉淀测定RhoA-GDI结合。（A） 是5个单独实验的代表性斑点。（B） 是描绘通过使用抗RhoA抗体而降低的GDI蛋白的量的变化的条形图。结果表示为平均值±SE；n=5个实验。*与常氧组相比，P<0.05。

替龙和高氧（80%和50%氧气）对肺成纤维细胞细胞增殖、胶原蛋白I蛋白、RhoA活化和RhoA-GDI相关性的影响

我们测定了暴露于80%氧气中12小时，然后在有无活性氧清除剂替龙的情况下暴露于50%氧气中再暴露12小时的肺成纤维细胞的细胞增殖、胶原蛋白I和RhoA活化。如所示补充图2和3肺成纤维细胞暴露于80%氧气中12小时，然后再暴露于50%氧气中12 h，导致胶原蛋白I和RhoA活化增加，RhoA-GDI相关性降低。Tiron（5 mM）减弱了细胞增殖的增加(补充图1)、胶原蛋白-I蛋白、RhoA活化和RhoA-GDI相关性降低(补充图2和3).

ROCK抑制剂Y27632抑制小鼠肺部高氧诱导的胶原合成

为了确认我们的在体外观察高氧肺成纤维细胞激活的RhoA/ROCK通路介导的胶原合成，我们利用高氧诱导肺纤维化的动物模型。雄性C57BL/6小鼠暴露于80%氧气中5天，然后再暴露于50%氧气中10天。从改变到50%氧气的时间开始，高氧小鼠每天注射ROCK抑制剂Y27632（5 mg/kg，每天IP注射）或等量PBS。正常小鼠保存在室内空气中，同时每天IP注射等量Y27631或PBS。我们发现，用马森三色染色法，高氧肺显示出显著的纤维化(图7A和7B). Y27632在高氧肺中减弱胶原染色(图7A和7B). 肺匀浆的Western blotting分析进一步证实了胶原蛋白的合成。如所示图7C、7D和7E，高氧小鼠肺匀浆中含有更高水平的胶原蛋白I和COL1A1公司和COL1A2公司mRNA。Y27632抑制胶原蛋白I蛋白和COL1A1公司和COL1A2公司高氧小鼠肺中mRNA的表达(图7C、7D和7E). 这些结果表明，ROCK激活与高氧诱导的胶原蛋白I合成和肺纤维化有关。

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图7

ROCK抑制剂Y27632可减弱氧毒性小鼠肺中胶原I的合成。雄性C57BL/6小鼠暴露于80%氧气中5天，然后再暴露于50%氧气中10天。从改变到50%氧气的时间开始，高氧小鼠每天注射ROCK抑制剂Y27632（5 mg/kg，每天IP注射）或相同体积的PBS。正常小鼠置于室内空气中，同时每天IP注射相同剂量的泰隆或PBS。（A） 是Masson三色染色肺切片的代表性图像。（B） 是一个条形图，描绘了肺组织中胶原染色强度的变化，用bue与绿色的比率表示。（C） 是8个实验的代表性印迹。（D） 是描述肺组织中胶原蛋白I蛋白变化的条形图。（E） 是一个描述变化的条形图COL1A1公司和COL1A2公司肺组织中的mRNA水平。结果表示为平均值±SE；n=8个实验。*与常氧组相比P<0.05；**与常氧+Y27632组相比P<0.05；#与高氧组相比，P<0.05。

活性氧清除剂替龙预防小鼠肺中高氧诱导的RhoA活化和RhoA和GDI的分离

雄性C57BL/6小鼠暴露于80%氧气中5天，然后再暴露于50%氧气中10天（共15天）。每天给高氧小鼠注射活性氧清除剂泰隆（1.5 g/kg，每天通过IP注射）或在改变为50%氧气时开始等量PBS。将正常小鼠置于室内空气中，同时每天注射相同剂量的替龙或PBS。我们发现，小鼠暴露于80%氧气中5天（第5天）会导致肺部RhoA活性增加(图8A和8B). RhoA活性在变为50%氧气10天后（第15天）继续增加(图8A和8B). 与正常肺组织相比，高氧肺组织匀浆中使用RhoA抗体进行免疫沉淀可降低GDI蛋白的含量(图8E和8F). 更重要的是，替龙阻止了高氧肺中ROS生成的增加(补充图5). 用替龙清除活性氧阻止了高氧肺中RhoA活化的增加和RhoA与GDI结合的减少(图8C、8D、8E和8E). 这些数据表明，RhoA的激活以及RhoA和GDI的分离归因于高氧诱导的肺纤维化中ROS生成的增加。

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图8

高氧和替龙对小鼠肺氧中毒中RhoA激活和RhoA-GDI关联的影响。雄性C57BL/6小鼠暴露于80%氧气中5天，然后再暴露于50%氧气中10天（共15天）。从改变到50%氧气的时间开始，高氧小鼠每天注射ROS清除剂替龙（1.5 g/kg，每天IP注射）或相同体积的PBS。正常小鼠保存在室内空气中，同时每天IP注射相同剂量的替龙或PBS。（A） 是5个实验的代表性斑点。（B） 是显示RhoA活动随时间变化的条形图。（C） 是8个实验的代表性斑点。（D） 是描述肺组织中胶原蛋白I蛋白变化的条形图（第15天）。（E） 是8种表达的RhoA和GDI的共同免疫沉淀的代表性印迹。（F） 是一个条形图，描绘了使用抗RhoA抗体在肺匀浆中拉下的GDI蛋白量的变化（第15天）。结果表示为平均值±SE；n=8个实验。#与第0天相比P<0.05；*与常氧组相比P＜0.05。

我们感谢William R.Caldwell博士对手稿的批判性阅读。

这项工作得到了NIH拨款R01HL088261（给YS）、空乘医学研究所拨款072104（给YS）和美国心脏协会大东南附属机构拨款0855338E（给YS.）的支持。