检测克隆胚胎中DNA甲基转移酶的表达揭示了Dnmt1在牛发育中的重要作用

摘要

介绍

将体细胞核重新编程为多能性或胚胎干细胞样状态提供了开发用于移植治疗的患者特异性细胞的方法(Jaenisch，2002年;米勒和伦格克，2009年;Reik等人，2001年;高桥，2010;托德，2009年). 通过体细胞核移植（SCNT）生产的动物代表了这种重编程过程的极端，其中所有组织都来自单个重编程细胞(Meissner和Jaenisch，2006年). 通过核移植产生的胚胎表现出频繁的发育和代谢异常，存活率极低(Campbell等人，2005年). SCNT的研究经常将卵母细胞未能对供体细胞核进行正确的表观遗传重组作为发育失败的唯一原因(贝斯特，1998年;Blelloch等人，2006年;Eilertsen等人，2007年;Reik等人，2001年). 为了支持这一点，克隆胚胎表现出各种各样的表观遗传异常，包括X染色体失活模式的改变、印迹基因表达以及异常高水平的基因组DNA甲基化，这表明表观基因组没有正确建立(Bourc'his等人，2001年;Dean等人，2001年;Kang等人，2001年;Kang等人，2002年;Santos等人，2002年;Santos等人，2003年;薛等，2002). 了解核重编程对表观基因组的影响是证明细胞重编程过程安全性和稳定性的关键。

一个被称为DNA（胞嘧啶-5）甲基转移酶（DNMTs）的结构相关蛋白家族已被确定，它催化哺乳动物基因组DNA甲基化模式的产生并调节其动力学(贝斯特，2000). DNMT1是表达最丰富的甲基转移酶，被认为主要负责通过DNA复制维持甲基化模式；尽管它确实展示了从头开始过度表达时的甲基化（Leonhardt等人，1992）。DNMT3a和DNMT3b均为从头开始甲基转移酶，并将甲基转移到基因组中先前未甲基化的CpG二核苷酸(Okano等人，1999年;谢等人，1999年). 总的来说，这些酶是DNA甲基化的关键调节剂，调节失败可能导致观察到的超甲基化和X染色体失活的异常模式，这些模式在使用SCNT生产的动物中经常出现。

受精后，基因组DNA甲基化模式立即被部分消除（以物种依赖的方式），合子基因组的表观遗传状态重置为全能重编程状态。随着发育的进行，表观基因组被编程来指导胚胎的发育和分化(Reik等人，2001年;Santos等人，2002年;Santos等人，2003年). 相反，在SCNT胚胎的植入前发育过程中，基因组DNA甲基化模式并没有完全消除，事实上随着发育的进行而增加(Kang等人，2001年;Kang等人，2002年). 因此，以前的研究已经证明，供体细胞系内甲基化水平的预先降低可以提高重建胚胎发育到囊胚阶段并产生合格胚胎干细胞的能力(Eilertsen等人，2007年;Blelloch等人，2006年). 因此，降低SCNT胚胎基因组DNA甲基化水平可能是提高SCNT效率的关键步骤。然而，尚不清楚这种超甲基化现象是由于胚胎原核和转移的体细胞核调节DNMT家族酶的生化活性的能力不同而引起的，还是实际上是卵泡质无法指导其正确转录的结果。

在这里，我们利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）来测量体外受精、孤雌生殖和SCNT胚胎发育过程中Dnmt的表达。我们的结果表明，在克隆胚胎中，Dnmt家族的过度表达没有超过体外受精或孤雌生殖控制中观察到的水平，这意味着不适当的翻译控制、蛋白质运输或酶功能是克隆基因组超甲基化的基础。在试图开发使用短干扰RNA（siRNA）降低早期胚胎基因组甲基化水平的方案时，我们观察到将Dnmt1靶向siRNA注射到试管婴儿和孤雌胚胎中导致8-16细胞期的发育停滞。相比之下，来自稳定的、Dnmt1缺失的供体细胞系的SCNT胚胎的发育速度与对照组无明显区别。总的来说，我们的结果表明，Dnmt转录在植入前克隆胚胎中被正确编程，母体Dnmt1的表观遗传编程对牛植入前发育至关重要。

结果

核供体细胞系中Dnmt表达的实时分析

选择细胞类型、年龄甚至特定传代作为核供体对克隆胚胎发育率有着深远的影响。先前的研究假设DNA甲基化可能是监测细胞老化的一种机制，其中较老的细胞积累了较高水平的基因组甲基化(Lopatina等人，2002年;Young和Smith，2001年). 为了支持这一假设，与成人细胞系相比，胎儿细胞系通常表现出基因组甲基化水平降低，并且当用作核供体时通常产生更高的发育速率(Monk等人，1987年;Hill等人，2000年). 同样，随着细胞传代次数的增加，牛克隆胚胎的生产率也会下降(刘等人，2001). 如果DNA甲基化水平的增加与酶表达的伴随增加相关，那么细胞年龄可能会对卵浆重编程Dnmt转录的能力产生重大影响。为了研究Dnmt表达水平随细胞年龄增加而增加的可能性，本研究报告的SCNT实验中用作核供体的野生型牛成纤维细胞系被培养到细胞衰老前传代的位置。在几个关键的传代中，从细胞亚群中分离出RNA，其余部分染色以检查形态学。

随着细胞的传代，它们的形态从成纤维细胞的纺锤形特征转变为更长方形的展开细胞体。为了测量Dnmt mRNA水平，我们使用了qRT-PCR，并将我们的结果标准化为三个独立管家基因的几何平均值(Goossens等人，2005年). 当测量Dnmt转录水平时，我们惊讶地发现，随着时间的推移，Dnmt3b转录水平呈稳定状态，但Dnmt2b转录水平显著下调(图1A). 虽然可以检测到Dnmt1和Dnmt3a的一些微小差异，但它们没有Dnmt3 b的下调那么明显。为了确定所观察到的Dnmt3b对衰老的下调是供体成纤维细胞系独有的还是潜在的常见现象，我们对同样用作SCNT核供体的培养牛卵丘细胞进行了类似的分析(Shin等人，2002年;Akshey等人，2010年). 与供体成纤维细胞一样，卵丘细胞在实验过程中表现出一致的Dnmt1和Dnmt3a表达水平，而Dnmt2b在第10代时再次表现出转录水平的显著降低(图1B). Dnmt3b下调是否作为细胞衰老过程的内在机制而专门发生尚不清楚。然而，我们的数据并不表明Dnmt水平随细胞年龄增加而增加。

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图1

DNA甲基转移酶在衰老供体细胞系中的表达。a） 衰老的原代供体成纤维细胞中Dnmt的表达。将用作核供体的原代供体成纤维细胞培养至衰老，并使用定量RT-PCR分析每一代收集的RNA的甲基转移酶表达。误差条代表SEM，*表示统计显著性P<0.01。b） Dnmt在衰老卵丘细胞中的表达。从分离的卵丘-卵母细胞复合体中获得初级卵丘细胞并培养至衰老。使用q-RT-PCR测量编码牛Dnmts的转录物。将样品归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值。误差条代表SEM，*表示统计显著性P<0.01。

体外受精、核移植和孤雌激活产生的植入前胚胎中牛Dnmt转录的定量分析

为了更准确地评估克隆胚胎植入前发育期间的Dnmt转录水平，进行了qRT-PCR分析。在这些实验中，通过体外受精体细胞核移植和孤雌激活。孤雌激活的胚胎含有两个雌性基因组互补物，可以发育到妊娠中期，但由于印记基因的异常表达，无法产生活的后代(麦格拉思和索尔特，1984年;麦格拉思和索尔特，1984年). 我们假设，使用这些不同方法生产的胚胎中Dnmt表达谱的检查可能会揭示单独包含女性基因组或包含来自体细胞的细胞核所带来的特定差异。胚胎是使用上述方法和野生型牛细胞系生产的，其发育速度与该实验室先前发表的研究一致(De Sousa等人，1999年;戈尔丁和韦斯特胡辛，2003年;Hill等人，2000年;Winger等人，2000年).

每个实验处理共收集160个胚胎，并从10个双细胞期、20个八细胞期和10个囊胚期胚胎池中分离出RNA。每个池中大约50 ng总RNA被植入两个独立的反应中，以测量参考基因组和单个甲基转移酶(Goossens等人，2005年). 我们假设单独对这些较小的池进行检查可以更准确地揭示实验组之间的细微差异。在2细胞、8细胞和胚泡阶段，每个实验组总共进行了4次独立的测量。考虑到在指数尺度上绘制不同Dnmt转录水平之间的巨大差异，我们将此分析中的数据表示为标准化δC（T）值，而不是相对表达水平(图2).

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图2

DNA甲基转移酶在两细胞、八细胞和囊胚期胚胎中的表达在体外受精(体外受精)孤雌激活和体细胞核移植（SCNT）。使用所述技术生产的胚胎培养到指定的发育阶段，收集在10个双细胞期、20个八细胞期和10个胚泡期胚胎的池中。分离RNA，并将其接种到qRT-PCR反应中，以测量每个Dnmts的水平。将数据归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值，并将值绘制为归一化ΔC_T型误差条代表SEM，*表示至少P<0.01的统计显著性。

在双细胞期，Dnmt转录物的表达没有差异(图2A; P> 0.05）。胚胎基因组激活发生在牛胚胎发育的八细胞阶段，因此在两细胞阶段一致的Dnmt测量可能反映了母体转录物。然而，在八世纪阶段，与体外受精胚胎相比，NT中Dnmt1的表达明显减少(图2B; P<0.01）。孤雌生殖细胞和NT胚胎之间的Dnmt1表达也存在类似的减少（P<0.0001），而在所检查的所有实验组的8细胞期，Dnmt3a和Dnmt3 b的表达在统计学上都没有差异。

在利用体细胞核移植重建的胚胎中，Dnmt1在胚泡发育阶段表现出截然不同的表达模式(图2C). 与体外受精和孤雌发育相比，NT胚胎中Dnmt1的转录水平较低（P<0.001）。同样，在囊胚期测得的Dnmt3a和Dnmt2b的表达在任何实验组中都没有差异。综上所述，这些结果表明，在胚胎基因组激活后，Dnmt3a和3b的转录活性被适当地重新编程，Dnmt1转录被抑制，可能是对NT胚胎中先前报道的高甲基化水平的反应，以及它们对Dnmt1启动子内甲基化反应控制元件的潜在影响(Kang等人，2001年;Kang等人，2002年;Dean等人，2001年;Bigey等人，2000年;Slack等人，1999年;Slack等人，2001年).

Dnmt1的RNAi消耗

无论生物化学起源如何，克隆胚胎基因组超甲基化都是SCNT重编程和克隆胚胎发育的实质性障碍。以前的研究已经测试了各种遗传、生物化学和药理学策略，以诱导供体细胞系和重构胚胎中的基因组去甲基化(Simonsson和Gurdon，2004年;Eilertsen等人，2007年;Blelloch等人，2006年;Enright等人，2003年). 然而，还没有研究试图通过特异性阻断Dnmt1表达来模拟植入前发育期间被动DNA去甲基化的过程。因此，我们选择使用RNA干扰（RNAi）去除植入前阶段胚胎中的Dnmt1转录物。我们假设母体Dnmt1转录水平降低会导致转移的基因组被动去甲基化，并提高SCNT发育率。为了开发验证这一假设的方案，我们首先将靶向Dnmt1的siRNA注射到一个细胞阶段的牛试管婴儿受精卵或随后被单性激活和培养的卵子中在体外siRNAs利用牛Dnmt1（Dnmt1a和Dnmt1b）的两种报告亚型作为靶点{Russell 2008}。作为对照，将注射Dnmt1-siRNA的胚胎与未注射的对照组和注射荧光标记的干扰siRNA的卵母细胞进行比较。为了验证siRNA介导的Dnmt1转录物的缺失，收集了8细胞期胚胎，分离RNA并使用qRT-PCR进行分析。与未注射和打乱的siRNA注射对照组相比，注射Dnmt1靶向siRNA可显著降低靶转录物（<0.0001）(图3A). 出乎意料的是，与未注射的对照组相比，注射过程导致混乱siRNA注射组的Dnmt1转录物水平显著增加（P<0.05），这可能是一种应激反应。总的来说，这些结果表明我们的siRNA处理能够使牛的Dnmt1转录物减少95%以上。为了检测Dnmt3a和Dnmt3 b对Dnmt1缺失的潜在补偿效应，再次采集8细胞期胚胎并用qRT-PCR进行分析。siRNA介导的Dnmt1缺失对Dnmt3a/3b转录水平没有明显影响，尽管与未注射对照组相比，注射过程再次使两个siRNA注射组的Dnmt3 b水平显著增加(图3B).

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图3

编码Dnmt1的母体转录本耗尽。a） 使用qRT-PCR测量对照组和注射siRNA的八细胞期胚胎中Dnmt1的耗竭。误差条代表SEM，*表示统计显著性P<0.0001。b） 使用qRT-PCR测量非注射和siRNA注射的八个细胞期胚胎中编码Dnmt3a和Dnmt2b的转录物。误差条表示SEM，字母表示统计显著性P<0.01。所有q_RT-PCR测量值均归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值。c） Dnmt1-siRNA注射胚胎基因组甲基化降低。非注射、对照和注射Dnmt1-siRNA的胚胎被固定，并使用识别甲基化胞嘧啶的抗体进行染色。使用碘化丙啶对5MC染色进行标准化，并与非注射对照组进行比较。误差条表示SEM，字母表示统计显著性P<0.05。此分析中使用的原始数字可在补充图1a.d-f）用5MC抗体（绿色信号）和碘化丙啶（红色信号）双重染色的八细胞期非注射（d）、对照（e）和Dnmt1-siRNA（f）注射胚胎的共焦图像。

为了评估siRNA介导的Dnmt1缺失对胚胎DNA甲基化水平的影响，如前所述，分离、固定8细胞期孤雌生殖胚胎并用免疫细胞化学方法进行分析(Dean等人，2001年). 与非注射对照组相比，注射Dnmt1-siRNA的单性烯醇类化合物甲基化水平降低了40%(图3C&D). 这一差异在P<0.05时显著。有趣的是，对照siRNA注射胚胎的5M-C染色减少了10%，这表明微操作/注射程序本身可以影响DNA甲基化水平（P<0.05）。然而，与Dnmt1-siRNA减少40%相比，在对照组中观察到的减少是最小的。以前对小鼠的研究表明，Dnmt1对发育到胚泡阶段并不重要(Li等人，1992年). 令人惊讶的是，虽然未注射和对照的siRNA单性生殖和IVF牛胚胎的囊胚率分别为37%和26-30%，但注射Dnmt1-siRNA的胚胎在8-16细胞期表现出发育停滞(表1). 在利用孤雌胚胎的实验中，发育了少量质量很差的囊胚，而没有产生注射Dnmt1-siRNA的IVF囊胚。胚胎存活率的这种意外下降持续存在且显著（卡方分析P<0.05）。最近，另一组报告称，当使用siRNAs靶向Dnmt1转录物时，羊胚胎在桑椹胚阶段发育停滞(Taylor等人，2009年).

表1

母亲Dnmt1的耗尽会导致发育迟缓。

单亲的
治疗	n个	劈开的	%劈开的	胚泡	%胚泡
无siRNA	182	152	74%一	40	37.7%一
非靶siRNA	375	183	57.9%b条	38	29.2%b条
DNMT1 siRNA	525	182	46.3%c（c）	8	5.8%c（c）

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体外受精
治疗	n个	劈开的	%劈开的	胚泡	%胚泡
无siRNA	250	185	74%一	69	37.3%一
非靶siRNA	190	110	57.9%b条	29	26.4%一
DNMT1 siRNA	188	87	46.3%c（c）	0	0%b条

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为了进一步研究牛植入前发育中的这一块，我们试图建立一个供体细胞系，其中含有稳定表达的短发夹RNA，靶向牛Dnmt1，用作核供体。使用聚合酶II驱动的构建物会在细胞培养中诱导供体基因组去甲基化，但在8细胞期合子基因组激活之前，重构胚胎中的转基因转录不会被诱导，因此不会影响母体mRNA的存储。为了在长时间培养期间实现Dnmt1转录物的稳定耗竭，慢病毒构建物包含基于microRNA的短发夹RNA（shRNA）^和平号s） 克隆了靶向牛Dnmt1。再次，我们设计这些shRNAs靶向牛Dnmt1转录物{Russell 2008}的两种报告的异构体。我们利用前面描述的PEG慢病毒载体表达shRNA^和平号绿色荧光蛋白（GFP）转基因的3′UTR内(图4A) (Golding等人，2010年). 实现靶向shRNA的Dnmt1的稳定整合和表达^和平号s、 这些构建物用于产生感染性、复制缺陷的慢病毒颗粒，并通过上述方法将其输送到与核供体相同的原代牛成纤维细胞中(Golding等人，2006年;Golding等人，2010年). 转基因细胞内GFP荧光的观察证实了这些结构的稳定整合和表达。Dnmt1 shRNA^和平号通过结合qRT-PCR和western blot分析，使用嘌呤霉素和Dnmt1缺失，选择表达细胞系和非靶向对照，以使其同质性。四个独立的shRNA^和平号s进行了测试，两名最佳候选人的测试结果见图4B（mRNA）和4C（蛋白质）.牛shRNA^和平号s Dnmt1-3和Dnmt1-4持续产生Dnmt1表达的显著降低，其中Dnmt1-4产生Dnmt1信息和蛋白质水平的降低大于95%。

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图4

转基因供体成纤维细胞中Dnmt1的稳定耗竭。a） 用于传递靶向Dnmt1的shRNAs的PGK-嘌呤霉素EF1a-GFP（PEG）慢病毒shRNA表达结构的卡通图。b） 牛Dnmts在转基因细胞系中的表达减少。用非靶向对照或Dnmt1靶向shRNAs转导原代牛成纤维细胞。从转基因细胞中分离出RNA，并将其接种到qRT-PCR反应中，以测量每个Dnmts。数据归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值。误差条代表SEM，*表示统计显著性P<0.001。c） 使用Western分析验证DNMT1消耗。从含有shRNA的细胞系中分离出蛋白质提取物，并使用识别DNMT1的抗体进行检测。为了使样品正常化，剥离印迹并探测GAPDH。d） 转基因细胞系中基因组甲基化水平降低。含有非靶向对照或Dnmt1靶向shRNAs的成纤维细胞被固定，并使用识别甲基化胞嘧啶的抗体进行染色。5MC染色用碘伏标准化。将非靶向对照细胞系的测量值设置为1，并绘制相对值。误差条表示SEM，字母表示统计显著性P<0.05。此分析中使用的原始数字可在中找到补充图1b.

为了检测Dnmt1的缺失是否影响Dnmt3a或Dnmt2b的表达，使用qRT-PCR分析RNA制备。出乎意料，如图所示图4BDnmt1的缺失与Dnmt3a和Dnmt2b信息水平的显著下降相关（P<0.01）。接下来，含有Dnmt1或对照shRNA的细胞株^和平号分析基因组DNA甲基化水平。培养7代后，如前所述，用免疫细胞化学分析细胞系(Dean等人，2001年). 与转基因对照细胞相比，Dnmt1缺失和相应的Dnmt3a/3b水平下降与基因组甲基化水平下降15%相关，具有统计学意义（P<0.05）(图4D). 为了确定稳定的Dnmt1缺失对SCNT发育速度的影响，将Dnmt1-shRNA4和对照细胞系用作核供体。与报告的实验相反Eilertsen等人（2007年）使用短暂siRNA介导的Dnmt1缺失可提高供体细胞系的发育速度，而使用稳定的Dnmt1缺失细胞系与对照组相比，胚泡发育速度无显著差异(表2). 然而，重要的是，胚胎发育在8-16细胞期没有停止，并且产生的胚泡发育率与对照组难以区分。这些结果表明，编码Dnmt1的母体转录物至少可以将发育带到胚泡期，与表达shRNA的细胞系相比，使用siRNA的方案会耗尽这些母体转录产物并阻止发育。

表2

使用表达非靶向对照shRNA或Dnmt1-shRNA 4的转基因细胞生成的SCNT胚胎的胚胎发育率。

细胞系	卵母细胞	去核的	熔断（%）	囊胚（%）	妊娠率第40天
非目标控制	200	186	160 (86%)	54 (34%)	33%
Dnmt1 shRNA 4	200	138	116 (84%)	37 (32%)	0%

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为了进一步研究稳定的shRNA介导的Dnmt1缺失对牛胚胎发育的影响，我们选择转移20个Dnmt1-shRNA^和平号囊胚期胚胎分为5个受体。作为对照，含有非靶向shRNA的囊胚^和平号s也被转移。如图所示表2对照胚胎在第40天测得的妊娠率为33%，而Dnmt1缺失胚胎的妊娠率则为0%。这些结果与先前在小鼠中的研究一致，这些研究表明DNMT1活性对于体内植入前发育，但对植入后发育至关重要(Li等人，1992年). 上述结果共同表明，Dnmt1对反刍动物的着床前发育至关重要，母体Dnmt1转录物的siRNA缺失或Dnmt1-siRNA处理持续超过8细胞期会干扰Dnmt1的表观遗传编程功能，导致发育停滞。由于我们的siRNA治疗阻止了我们的对照胚胎，因此没有尝试在通过SCNT生产的胚胎中测试Dnmt1-siRNA注射。

讨论

基因表达的异常模式是克隆胚胎的标志，在克隆牛和小鼠中进行的基因组超甲基化研究已经开始为这些转录异常提供一些解释(Bourc'his等人，2001年;Dean等人，2001年;Kang等人，2001年;薛等，2002). DNA甲基化的关键调节剂是DNMT，该酶家族的过表达被假设会导致观察到的超甲基化以及X染色体失活和印迹基因表达的异常模式，这种异常模式在使用核移植生产的动物中常见(贝斯特，1998;戈尔丁和韦斯特胡辛，2003年). 为了区分DNMT过表达与体细胞核和胚胎细胞核对该酶家族生化调节能力的不同，我们对IVF、NT和孤雌生殖发育期间的牛DNMT转录物进行了实时定量。本研究的结果表明，在克隆胚胎中，Dnmt家族成员的过度表达没有超过体外受精或孤雌生殖胚胎中的水平，而是显示编码最丰富的甲基转移酶Dnmt1的转录水平显著降低。人类dnmt1的启动子包含几个甲基化反应元件，这些元件被假设根据基因组甲基化的局部水平调节转录(Bigey等人，2000年;Slack等人，1999年;Slack等人，2001年). 鉴于克隆胚胎中基因组的高甲基化状态，可能由于供体基因组中CpG甲基化水平较高，克隆中Dnmt1的转录减弱。

在克隆小鼠的早期发育过程中，从卵母细胞中去除雌性原核会排除受精卵去甲基化供体基因组的任何能力，并去除控制卵母细胞特定亚型Dnmt1（Dnmt1o）贩运的关键因素(豪厄尔等人，2001年;Chung等人，2003年;Kang等人，2001年;Oswald等人，2000年). 同样，对重构胚胎中的细胞核破裂和小鼠Dnmt1o动力学的研究也支持这样一种说法，即DNMT在NT胚胎中的运输受到干扰。(Gonda等人，2003年;Chung等人，2003年). 鉴于我们观察到的牛Dnmt1转录下调以及之前对小鼠NT早期发育的观察，我们推测克隆牛中观察到的基因组甲基化水平的增加可能是由于该基因家族的异常贩运或生化调节所致。因此，在卵母细胞的独特环境中，体细胞核缺乏控制酶通路或活性的关键元素，从而导致基因组超甲基化。

为了降低基因组甲基化水平，我们使用RNAi抑制供体细胞系和早期胚胎中的Dnmt1活性。在植入前发育期间，利用siRNAs阻断DNMT1的表达，我们寻求通过诱导被动去甲基化来降低基因组甲基化水平的方案。然而，与之前描述的在绵羊中使用Dnmt1靶向siRNAs的研究类似，IVF和孤雌胚胎中最丰富的甲基转移酶的耗竭导致胚泡期之前的发育停滞(Taylor等人，2009年). 相反，使用稳定表达的shRNA干扰克隆胚胎中Dnmt1的表达并不会导致发育停滞，并且产生与对照组相同的发育速度。我们假设这些观察可以用RNAi诱导分子剂量和时间的差异来解释。含有shRNA表达盒的SCNT胚胎在8细胞阶段的胚胎基因组激活之前不会被转录，因为siRNAs将在注射后立即启动RNAi机制并抑制同源转录。此外，以微粒体数量注射siRNAs，其中shRNAs将表现出与其他聚合酶II转录物相似的动力学和丰度(Silva等人，2005年;Stegmeier等人，2005年). 因此，在使用表达Dnmt1-shRNA的细胞系生成的SCNT胚胎中，母体转录物很可能足以将发育从胚泡阶段带入植入后的发育阶段，此时Dnmt1的缺失是致命的。虽然在提高SCNT胚胎发育率方面无效，但我们的结果清楚地表明，上述技术作为在大型动物模型中研究功能基因组学的工具是有效的。

我们感到惊讶的是，鉴于Dnmt1转录物的潜在耗竭水平低于对照组的5%，供体细胞系内的整体DNA甲基化水平仅下降了15%左右。考虑到转基因成纤维细胞在分析之前生长的传代次数，我们完全预计甲基化水平会降低至少一半。DNMT3b有可能补偿并维持甲基化水平，但它确实有一些报告的维持活性(Eilertsen等人，2007年;Chen等人，2003年). 然而，我们观察到Dnmt3a和Dnmt2b转录物水平在Dnmt1-shRNA中都降低了^和平号细胞系并不完全支持这种说法。此外，我们无法解释在缺乏Dnmt1的情况下Dnmt3a和3b的下调。

随着哺乳动物胚胎的发育，DNA和组蛋白表观遗传修饰的渐进变化逐渐规划了基因表达的细胞特异性模式，并限制了谱系潜能和细胞特性(Goldberg等人，2007年). 然而，与细胞内的细胞相比体内植入前胚胎，培养的ES和IPS细胞都是相对高甲基化的；但显然保留了生成所有体细胞谱系的能力。此外，尽管基因组甲基化水平的增加是SCNT重编程的障碍，但它们显然并非不可逾越。因此，旨在部分降低这些高水平的方法应提高供体细胞核的“可编程性”，从而提高胚胎存活率。相反，最近的一份报告表明，牛的克隆效率与关键表观遗传修饰物（包括供体细胞系中的Dnmts 1、3a和3b）水平的改变无关(Zhou等人，2009年). 我们的研究表明，使用siRNAs靶向植入前胚胎中的母体Dnmt1转录物不太可能是提高SCNT发育率的可行策略，因为RNAi的影响可能持续超过8细胞期，并阻断Dnmt1在发育规划中的重要作用(Howell等人，2001年). 相反，供体细胞系中短暂的siRNA介导的Dnmt1缺失可使SCNT发育到囊胚期的速率增加约30%(Eilertsen等人，2007年). 有趣的是，这种发育速度的增加是否与产生有能力的ES细胞或活后代的能力增加相关。

多利的诞生以及最近诱导多能干细胞生成方法的发现，提出了有关分化状态不可逆性的基本问题(Campbell等人，1996年;高桥和山中，2006年). 自发现以来，体细胞内多能性的诱导在体外将细胞重编程过程的研究从受胚胎培养规模限制的研究转向细胞培养的大规模研究，大大加快了该领域的研究步伐。现在越来越清楚的是，重塑细胞的表观遗传景观是这一重编程过程成功的关键，因此，已经付出了大量努力来确定这一过程中涉及的关键因素。基因组去甲基化酶、多梳蛋白和染色质重塑因子在这一过程中的关键作用说明了表观遗传学在IPS细胞生成中的关键性质，并强调了坚定地理解这些过程对IPS稳定性和治疗潜力的重要性（Kim等人，2010；Singhal等人，2010年;Pereira等人，2010年;不丹等，2009年). 因此，为IPS程序启动体细胞的方法也很可能有助于提高细胞对SCNT过程的适应性。最近，利用参与碱基切除修复元素的蛋白质成功地将细胞基因组去甲基化，这是我用来提高SCNT效率的潜在方法的一个例子（Kim等人，2010年）。

材料和方法

补充材料

致谢

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