ryanodine受体的异质功能，但不是IP_三受体，在仓鼠提睾肌供血动脉和小动脉中

摘要

肌浆网血管平滑肌细胞（SR）至少含有两种钙²⁺-释放通道：赖氨酸受体（RyRs）和1，4，5-三磷酸肌醇（IP_三)受体（IP_三卢比）(78). RyRs位于Ca下方²⁺火花(15)，它们还可能参与更多的全局细胞内钙²⁺通过Ca的事件²⁺-诱导钙²⁺发布（CICR）(78). G蛋白偶联受体激活过程中的钙释放由IP介导_三Rs和这些Ca²⁺释放通道也是钙的基础²⁺波浪(78). 在某些系统中，RyR和IP_三Rs对Ca的贡献²⁺信号(6,78). 目前尚不清楚的是这些通道在微血管平滑肌和肌源性张力调节中的作用。

RyR介导的钙²⁺视网膜小动脉中观察到火花(21,22,76)和输尿管小动脉(13). 相比之下，最近对从一级大鼠提睾小动脉分离的细胞的研究未能检测到Ca²⁺火花(82). 然而，对输尿管小动脉平滑肌细胞的进一步研究(10)发现RyRs在这些微血管中没有作用。而大多数对大血管平滑肌的研究表明²⁺火花激活肌膜大电导钙²⁺-激活的K⁺（黑色_钙)通道并有助于膜电位和血管张力的负反馈调节(78)对肾小动脉的研究表明，RyRs通过该微循环中的CICR参与血管张力的正反馈调节(三,25,26). 因此，RyRs在微循环中的功能似乎存在显著的区域差异。

同样，IP扮演的角色_三微循环肌源性张力调节中的受体在很大程度上是未知的。最近对输尿管小动脉的研究表明IP_三Rs在Ca中起主导作用²⁺激动剂诱导收缩时这些血管的信号传导(10). 然而，这些研究中的小动脉没有加压，因此IP的功能_三压力诱导肌源性张力期间的Rs未得到解决。在大鼠一级提睾小动脉中，IP_三R拮抗剂2-氨基乙氧基二苯硼酸盐（2-APB）被报道可抑制肌源性张力(71)（与IP的主要角色一致_三Rs）或几乎没有效果(53). 钙的缺乏²⁺含氟加压肠系膜小动脉中观察到的波(64)似乎反对知识产权的主要作用_三这些血管的肌原性基调Rs。因此，IP的功能_三小动脉和阻力动脉平滑肌中的Rs及其在肌源性张力中的作用尚不清楚。

本研究的目的是表征子宫内膜下钙²⁺骨骼肌小动脉平滑肌细胞中的信号与上游供血动脉中的信号进行比较，以验证RyRs和IP_三Rs对Ca的贡献²⁺两种血管类型的信号和肌源性张力。我们发现RyRs参与两种钙²⁺火花和钙²⁺供血动脉平滑肌细胞中的波，有助于这些小动脉肌张力的负反馈调节。相反，在提睾小动脉的平滑肌细胞中，RyRs似乎沉默，对Ca无贡献²⁺火花，Ca²⁺波浪，也不是肌源性张力。另一方面，我们观察到_三Rs和上游磷脂酶C（PLC）对钙有重要贡献²⁺波浪，全球Ca²⁺供血动脉和小动脉平滑肌细胞的水平和肌原性张力。我们的发现强调了RyRs和IP之间的功能差异_三与下游小动脉相比，饲料动脉中RyRs的功能表现出异质性。

方法

动物和血管准备。

所有实验均由密歇根州立大学动物护理和使用委员会批准并按照该委员会的指导方针进行，并按照实验动物护理和使用指南国家研究委员会（19a）。雄性金色叙利亚仓鼠（6-10周，75-150克，哈伦）被CO安乐死₂窒息，随后颈椎脱位。快速移除左右侧的火葬长肌肉，并将其置于4°C Ca中²⁺-游离生理盐溶液（Ca²⁺-游离PSS），含（mM）137 NaCl，5.6 KCl，1 MgCl₂，10 HEPES，10葡萄糖（pH 7.4295 mosmol/kgH₂O） ●●●●。如前所述，在立体显微镜的帮助下，通过手解剖分离出二级托马斯特小动脉(14,41). 通过手术暴露髂动脉，并小心地分离出离托马斯特肌微循环上游的小动脉分支，原位解剖托马斯特肌肉供血动脉。

血管插管。

使用50-100-μl Wiretrol移液管（Drummond Scientific，Broomal，PA）将内皮完整的小动脉和供血动脉转移到插管室，将其插入玻璃微移液管，并使用11-0眼线（Ashaway Line and Twine，Ashaway，RI）将其固定在移液管上。然后将腔室固定在显微镜台上（德国Wetzlar Leica DMIL），在显微镜上观察血管，加热至34°C（提睾小动脉）或37°C（供血动脉），加压至80 cmH₂O并允许发展成肌张力(14,40). 与在Ca中获得的血管的最大直径相比，所研究的所有血管的静息肌源性张力最小为20%²⁺-免费PSS。血管中不断过量注入PSS，其中含有（mM）140 NaCl、5 KCl、1.8 CaCl₂，1氯化镁₂，10 HEPES，10葡萄糖（pH 7.4），单独或含有药物。

钙成像。

用强度钙加载管状血管平滑肌细胞²⁺通过浴孵育法测定指示剂fluo-4。染料溶液中含有5μM fluo-4AM染料（Invitrogen，Carlsbad，CA）和0.5%二甲基亚砜（DMSO），以及0.1%牛血清白蛋白（USB，Cleveland，OH）²⁺-免费PSS。将该溶液在室温下施加到容器中2 h，然后用PSS浸入30 min，以从浴中清洗fluo-4，并允许染料脱酯化和逐渐升高温度。使用长工作距离×40 H对所有血管进行成像₂O浸没物镜（数值孔径为0.8；工作距离为3 mm；徕卡）。使用旋转盘共焦系统（CSU-10B，索拉梅尔，犹他州盐湖城），488 nm激光照明（索拉梅尔）和增强CCD相机（XR Mega-10，斯坦福光电，加利福尼亚州帕洛阿尔托），以30帧/秒的速度采集526 nm的Fluo-4荧光。每个记录周期为16.7秒，由500个1024×1024像素帧组成，以30帧/秒的速度捕获（我们的系统上每像素0.17×0.17μm）。我们的共焦头（50μm针孔）和PSS中规定的目标的z分辨率为1.77μm（参见http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/spinningdisk/introduction.html详细信息）。使用Piper软件（Stanford Photonics）记录图像，并使用SparkAn（由佛蒙特大学M.T.Nelson博士和A.D.Bonev博士提供）和ImageJ进行分析(1)软件。两种钙的出现²⁺火花和钙²⁺通过使用掩蔽程序分别观察血管内的每个平滑肌细胞，并对是否有钙进行评分，从而手动计算波数²⁺回放500帧序列时出现火花和/或波浪。然后使用SparkAn作为荧光的增加来验证这些发生，对于火花，每个细胞的荧光增加至少比基础水平高15%，对于波，荧光增加至少比基础水平高20%。

SparkAn还用于计算平均频率、振幅（F/F_o（o）)和Ca的全持续半最大值（FDHM）²⁺从血管壁细胞记录的事件。在SparkAn中，感兴趣区域（ROI）（10×10像素）位于Ca的峰值²⁺每个单元格上显示至少一个Ca的事件²⁺记录期间发生的事件。因此，频率、振幅和FDHM表示火花或波发生的平均速率、峰值振幅或Ca持续时间²⁺血管内每个细胞的事件。Ca的空间扩散[全宽半最大值（FWHM）]²⁺使用ImageJ测定火花和波浪。首次使用手工绘制的ROI计算停车前/波基底钙²⁺每个平滑肌细胞的水平。接下来，通过比较每个细胞的基础强度和通过每个火花或波的峰值荧光绘制的曲线图来计算FWHM。

使用比例钙评估由咖啡因（10 mM）诱导的平滑肌细胞中的钙瞬变²⁺-前面描述的指示剂fura-2(14,40). 使用DeltaRam X多波长照明器在340和380nm处激发Fura-2，并使用D-104光度计（Photon Technologies International，Birmingham，NJ）测量510nm处的发射。照明器和光度计均使用FeliX软件（Photon Technologies International）进行控制。加载前测量空心小动脉的背景荧光，并从加载血管的荧光值中减去。通过浴敷呋喃-2（5μM）60 min，然后30 min冲洗期，加载空心血管中的平滑肌细胞。使用Diamtrak软件（T.O.Neild，澳大利亚阿德莱德）同时测量直径，如下所述。

确定Ca²⁺仓鼠肠系膜小动脉和仓鼠供血动脉中的波是同步的，使用SparkAn产生微量钙²⁺通过将10×10像素ROI放置在每个显示至少一个波的细胞上，可在多达20个细胞/血管中激活（参见图1C类例如）。然后通过平均F/F将每个ROI的数据合并_o（o）每个时间点的ROI，以产生全球Ca的平均踪迹²⁺记录期间整个容器中的放射性（参见图1C类). 然后对这些平均轨迹进行分析，以确定是否存在荧光>1.2 F的任何峰_o（o）.

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图1。

钙的代表性图像²⁺火葬长的火花和波浪为动脉和小动脉供血。A类：含氟仓鼠供血动脉（HFAs）和仓鼠提睾小动脉（HCAs）的共焦图像，如图所示：基底钙²⁺水平(顶部)和峰值Ca²⁺水平(底部)对于进给动脉火花（箭头指示的位置），进给动脉波和cremaster小动脉波(左边到正确的). 火花出现在平滑肌细胞的一个小而有限的区域，而波则出现在细胞的更大区域。有关更多详细信息，请参阅文本。B类：使用描述振幅（F/F）的SparkAn生成的代表记录道_o（o）)与Ca的时间²⁺火花和Ca²⁺波浪。与钙相比，钙火花（虚线）的振幅和持续时间较小²⁺波浪（实线）。C类：钙²⁺在两条供血动脉中观察到的波(左边)和小动脉(正确的)是异步的：F/F的代表轨迹_o（o）在一个16.7s的记录周期内，同一血管内的10个细胞(顶部)无峰值>1.2 F/F的10条记录道的平均值_o（o）由供血动脉或颈动脉记录(底部). 通过对6条供血动脉的122个细胞和5条小动脉的98个细胞的分析，也得到了类似的结果。

测量容器直径。

在氟-4负荷的供血动脉和小动脉中，稳态直径是从Ca异步测量的²⁺测量值。紧接Ca之前²⁺测量，给药前或给药后，将显微镜聚焦于中平面，用暗淡的586nm光短暂透照血管，获得一系列图像。然后将显微镜重新聚焦到感兴趣的钙平面²⁺测量值。然后使用来自透照图像的ImageJ测量血管内径。在未装载氟-4的血管上进行的初步实验验证了所有药物的直径效应，以验证药物的时间进程，确保达到稳定状态，并确保异步直径测量准确地代表药物的稳态效应。测量通常在药物暴露10-15分钟后进行。在所有其他实验中，使用Diamtrak软件连续测量血管内径（T.O.Neild）(66)，如前所述(14,40).

化学制品。

Ryanodine来自Ascent Scientific（英国布里斯托尔），xestospongin D和2-APB来自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥）。Fluo-4是从Invitrogen获得的。除非文本中另有说明，否则所有其他药物和化学品均来自西格玛阿尔德里奇（密苏里州圣路易斯）。咖啡因和四乙基铵（TEA）直接溶解到PSS中。所有其他药物在二甲基亚砜中溶解，然后在PSS中稀释至最终浓度。单用二甲基亚砜在空心血管中无效。

数据分析和统计。

钙的出现²⁺火花和钙²⁺波以±95%置信区间的比例表示（至少出现1次的细胞数/检查的细胞总数），置信区间使用QuickCalcs实现的修改Wald方法计算(http://www.graphpad.com/quickcalcs/ConfInterval1.cfm). 所有其他数据均以平均值±SE表示。使用Student’s确定统计显著性t吨-检验、方差分析，然后是Tukey检验，用于事后均值比较，或者是Kruskall-Wallis检验，然后是Dunn的多重比较检验，当数据不是正态分布或组方差是异质的时。所有统计比较均在95%置信水平下进行。

结果

钙的表征²⁺供血动脉和小动脉的信号和肌源性张力。

我们观察到两种小的局部Ca²⁺我们归类为Ca的事件²⁺火花和更大、更全球的Ca²⁺事件（Ca²⁺生理温度和压力下研究含氟4的供血动脉中的波(图1,A类和B类、和表1). 两个Ca²⁺信号根据其药理学进行区分（参见RyRs在供血动脉中的作用和IP的作用_三供料动脉中的Rs和PLC)及其在细胞内的空间分布：Ca²⁺火花定位于平滑肌细胞内的小微区，而钙²⁺海浪涉及钙的全球增加²⁺(图1、和表1). 钙波的持续时间和振幅也明显长于钙波²⁺火花，如图1B类和中表1钙波是非同步的，在整个记录期间都能观察到(图1C类).

表1。

钙的性质²⁺司仪供血动脉和小动脉的信号

	横截面长度，μm	半高宽，μm	频率，Hz	振幅，F/Fo（o）	FDHM	n个
供料动脉
火花	85 ± 1.1 (63)	6 ± 0.3 (63)	0.19 ± 0.02	1.46 ± 0.02	0.56 ± 0.02	21–23
供料动脉
波浪	85 ± 1.0 (63)	57 ± 1.4*(63)	0.39 ± 0.05*	1.68 ± 0.02*	1.12 ± 0.08*	21–23
小动脉
波浪	34 ± 0.5*†(87)	25 ± 0.5*†(87)	0.39 ± 0.05*	1.66 ± 0.05*	1.94 ± 0.33*	29

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数值为平均值±SE；N个，单元数；n个，船只数量。半高宽，全宽，半高；FDHM，全时长，半最大值。对于横截面长度和半高宽，在显示Ca的3个细胞上进行测量²⁺每艘船的事件数。详见正文。

^*P（P）与饲料动脉Ca相比<0.05²⁺火花；

^†P（P）与供血动脉相比<0.05。

在载氟血管中测量共焦切片中平滑肌横截面的长度，并与每个Ca的全宽、半最大值（FWHM）进行比较²⁺事件。平均平滑肌细胞横截面长度为85±1.0μm(n个=来自21条血管的63个细胞）。钙火花的半高宽比横截面长度小得多（6.5±0.02%，n个=来自21条血管的63个细胞），而Ca²⁺波的半高宽（FWHM）非常接近整个横截面长度（68±2%，n个=来自21条血管的63个细胞）。钙火花在频率、振幅和持续时间（FDHM）上与供血动脉中的波有显著差异(表1). 32%的饲料动脉平滑肌细胞中观察到钙火花（95%置信区间=29–36%；531个细胞来自23条血管），而²⁺在55%的细胞中观察到波形（95%置信区间=51–59%，来自23条血管的585个细胞，P（P）< 0.05).

与我们对供血动脉的观察和之前对其他较大血管的研究相比，Ca²⁺在含氟-4的克雷马斯特小动脉平滑肌细胞中未观察到火花：0个细胞显示Ca²⁺29个小动脉中586个细胞的火花。然而，在加压小动脉中常规观察到钙波：321个细胞显示钙²⁺在29个小动脉中检测到586个波（55%；95%置信区间=51–59%）。Ca的频率、振幅和FDHM²⁺波形与在供血动脉中观察到的波形相似(表1). 然而，Ca的半高宽²⁺小动脉平滑肌细胞的波数小于供血动脉（25±0.5，n个=29条血管中的87个细胞）。这与这些血管的较小尺寸一致（小动脉共焦切片的平均横截面长度=34±0.5μm；P（P）与供血动脉相比<0.05，表1)，作为小动脉钙²⁺波浪占切片长度的75±1%，大于在供血动脉中观察到的部分(P（P）< 0.05). 重要的是，Ca²⁺小动脉中的波远大于钙²⁺在供料动脉中观察到火花(表1). 就像加州²⁺在供血动脉、小动脉钙中观察到的波²⁺波是异步的，在整个记录期间都能观察到(图1C类).

SR-Ca的影响²⁺供血动脉和小动脉衰竭。

验证Ca²⁺在供血动脉和小动脉中观察到来自细胞内钙的信号²⁺我们检测了平滑肌（内质网）Ca的作用²⁺-ATP酶（SERCA）抑制剂thapsigargin（100 nM）(58)在含氟的供血动脉和小动脉中(图2). 这种SERCA抑制剂消除了Ca²⁺供给动脉中的火花。在施用thapsigargin（100nM）之前²⁺188个平滑肌细胞中有43个出现火花（22.9%；95%置信区间=17.4–29.4；n个=3条供血动脉），平均振幅为1.63±0.02 F/F_o（o）频率为0.1±0.01 Hz。在thapsigargin的存在下，没有Ca²⁺在任何细胞中都观察到火花（201个细胞中的0个，n个=3条动脉；P（P）< 0.05).

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图2。

存储耗尽抑制Ca²⁺波浪，但增加全球Ca²⁺以及供血动脉和小动脉的肌张力。数据是Ca发生（Occ）的平均值±95%置信区间²⁺波浪(A类和天). 所有其他数据均为Ca振幅（Amp）和频率（Freq）的平均值±SE²⁺波浪(A类和天); 全球fluo-4强度，全球细胞内钙的指数²⁺(B类和E类); 和直径(C类和F类)在不存在[生理盐水溶液（PSS）]或存在肌浆网Ca的情况下²⁺-如图所示，ATP酶抑制剂thapsigargin（100 nM）。相对单位*P（P）与PSS中的值相比<0.05，n个= 3. 中的虚线C类和F类以0 Ca表示血管的最大直径²⁺PSS。

在供血动脉和小动脉中，SERCA的抑制几乎消除了Ca的发生²⁺波浪(图2,A类和天). Thapsigargin（100 nM）也显著降低了剩余Ca的振幅和频率²⁺两条供血动脉中的波(图2A类)和小动脉(图2天). 在这两类血管中，thapsigargin（100 nM）显著增加了fluo-4信号（一种全球Ca指数²⁺级别）(图2,B类和E类)和血管收缩(图2,C类和F类). 细胞外钙的去除²⁺暴露于thapsigargin后，整体fluo-4信号降低至PSS值的60±2和59±3%，血管从158±7扩张至226±8μm，从38±2扩张至77±3μm（见图2,C类和F类)分别在供血动脉和小动脉中(n个=各3）。这些数据表明，thapsigargin诱导了全球Ca的变化²⁺和直径很大程度上是由钙的刺激引起的²⁺大量涌入。

血管内压力对肌源性张力和钙的影响²⁺信号。

不同血管内压力对Ca的影响²⁺供血动脉和小动脉也有信号和肌源性张力的特征(图3和​和4）。4). 两种血管类型的直径对钙存在和不存在时血管内压力变化的反应相似²⁺(图3). 在供血动脉中，血管内压力的增加对钙的发生、振幅或频率没有显著影响²⁺火花(图4). 相反，血管内压的变化对钙的影响相当²⁺供血动脉和小动脉中的波：Ca²⁺与20 cmH相比，40、80和120 cmH时出现的波形增加₂O、 钙²⁺波幅不受压力变化的影响，钙²⁺与20和40 cmH相比，80和120 cmH处的波频率增加₂O（运行）(图4). 在任何压力下，小动脉中均未观察到钙火花。

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图3。

供血动脉和小动脉显示出相似的压力-直径关系。数据为平均值±SE(n个=3）供料动脉(A类)和小动脉(B类)20、40、80和120厘米高时的直径₂钙中的O²⁺-含有PSS（○）和Ca²⁺-无PSS（●）。

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图4。

血管内压力变化对发病率的影响(顶部)，振幅(中间的)、和频率(底部)钙的²⁺火花(左边)和钙²⁺波浪(正确的)如图所示，用于供血动脉和小动脉。压力为20、40、80和120 cmH时₂O、 钙的发生率、振幅或频率没有差异²⁺供血动脉和小动脉之间的波(正确的);P（P）> 0.05. *P（P）<0.05，与血管内压为20 cmH时的等效值显著不同₂O；n个=3条供血动脉或小动脉。

RyRs在供血动脉中的作用。

RyR拮抗剂ryanodine（10μM）对供血动脉的过度融合可消除Ca的发生²⁺火花：从6条供血动脉检查的118个细胞中，有0个显示出这些事件(P（P）< 0.05). Ryanodine（10μM）还显著减少显示Ca的平滑肌细胞数量²⁺波动至13%（95%置信区间7–21%，P（P）< 0.05,n个=6艘船）(图5,A类和B类). 应用ryanodine还导致了全球fluo-4浓度显著增加，表明细胞内Ca增加²⁺(图5C类)和显著的血管收缩(图5天). 因为ryanodine可能会耗尽SR-Ca²⁺在某些系统中存储(80)，使用丁卡因（100μM）重复实验，丁卡因可以阻断RyRs而不会耗尽SR-Ca²⁺商店(22). 获得了类似的结果(图5,E–H（E–H）)：两种钙²⁺火花和波浪被抑制，与钙的全球增加有关²⁺和血管收缩。赖氨酸和丁卡因诱导的全球钙增加²⁺相关的血管收缩与其他系统中RyRs的负反馈作用相一致(78).

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图5。

Ryanodine受体对钙的贡献²⁺火花，Ca²⁺克雷马斯特供血动脉中的波和肌源性张力。A–D：存在和不存在ryanodine（10μM）的血管数据。E–H（E–H）：存在和不存在丁卡因（100μM）的血管数据。数据是Ca发生的平均值±95%置信区间²⁺火花和波浪(A类,B类,E类、和F类)或Ca的平均值±SE²⁺波幅（F/F_o（o）); 频率（Hz）；全球fluo-4信号，全球细胞内钙的指数²⁺(C类和G公司); 和直径(天和H（H）)在80 cmH的含氟克雷马斯供料动脉中₂在没有（PSS）和有ryanodine（10μM，n个=6）或丁卡因（100μM，n个=3）如图所示*P（P）<0.05，与PSS中的值显著不同。动脉的最大直径用虚线表示天和H（H）.

为了进一步验证RyRs参与饲料动脉张力负反馈调节的假设，我们比较了ryanodine和BK的血管舒缩作用_钙通道阻滞剂paxiline（100 nM）(51)或TEA的浓度（1 mM），我们之前已经证明其可选择性抑制BK_钙仓鼠血管平滑肌的通道(11,12). 我们验证了帕罗西汀（100 nM）和TEA（1 mM）对饲料动脉直径的影响是相等的。从155.4±3.8μm的静止直径开始，帕罗西林（100 nM）使供血动脉收缩37.7±3.9μm。在相同的血管中，TEA（1 mM）产生类似的收缩作用，为43.8±6.3μm(n个= 4,P（P）> 0.05). 因此，BK的浓度_钙所使用的通道阻滞剂在这些血管中似乎具有同等效果。

单独使用，两种paxiline(图6A类)和赖安诺定(图6,B类,天、和E类)导致供血动脉显著收缩。然而，在帕罗西林（100 nM）的存在下，兰尼定（10μM）没有引起额外的收缩(图6A类)与RyRs和BK功能耦合的已发表研究一致_钙通道(78). 如果颠倒用药顺序，瑞安定（10μM）只能减弱帕罗西林引起的供血动脉收缩(图6B类). TEA（1 mM）获得了相同的结果(图6,C类和天). 这些数据表明，虽然RyR的活动在功能上可能与BK有关_钙渠道，他们不是BK的唯一监管机构_钙渠道活动。

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图6。

阻止大电导率钙²⁺-激活的K⁺（BK）_钙)通道抑制赖氨酸诱导的供血动脉收缩。数据为无BK（PSS）或有BK时的平均直径±SE_钙通道阻滞剂paxiline（100 nM，n个= 4;A类和B类)或四乙基铵（TEA，1 mM，n个= 6;C类); ryanodine受体拮抗剂ryanodine（10μM；A–F); 电压门控钙²⁺通道激动剂Bay K 8644（5 nM，n个= 6;F类); 或帕西林+赖氨酸定的组合(A类和B类)，TEA+赖氨酸定(C类和天)或Bay K 8644+ryanodine(F类)如图所示*P（P）<0.05，与PSS显著不同。ψP（P）<0.05，与PSS有显著差异，但与相邻组无显著差异(P（P）> 0.05). **P（P）<0.05，与PSS及邻近组有显著差异。

验证抑制对兰尼定（10μM）反应的不仅仅是帕西林（100 nM）或TEA（1 mM）引起的收缩(图6,A类和C类)，在缺乏RyR拮抗剂的情况下检查其作用(图6E类)以及L型钙诱导的类似程度的收缩²⁺通道激动剂Bay K 8644（5 nM）(图6F类). 如图所示图6F类ryanodine（10μM）仍能诱导Bay K 8644预狭窄动脉的血管收缩。这些数据表明，在帕罗西汀（100 nM）或TEA（1 mM）存在下观察到的对赖氨诺丁的反应丧失(图6,A类和C类)不仅仅是由于这些BK引起的收缩_钙通道阻滞剂。

此外，还检测了TEA在含氟4的供血动脉中的作用(图7,A–C). 与ryanodine（10μM）的作用相反，BK_钙通道阻滞剂增加钙的发生率、振幅和频率²⁺波浪，同时增加全球Ca²⁺收缩动脉(图7,A–C). 钙的发生率和频率增加²⁺波浪阻碍了对饲料动脉钙的准确定量²⁺TEA存在时的火花活动。

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图7。

BK封锁_钙通道增加钙²⁺波浪，全球Ca²⁺以及供血动脉和小动脉的肌源性张力。数据是Ca的平均值±95%置信区间²⁺波浪发生(A类和天)或Ca的平均值±SE²⁺波幅（F/F_o（o）)或频率（单位：Hz；A类和天); 全球fluo-4信号，全球细胞内钙的指数²⁺(B类和E类); 或直径(C类和F类)在BK缺席或在场的情况下_钙如图所示，通道阻断剂TEA（1 mM）*P（P）<0.05，与PSS中的等效值有显著差异；n个=3，对于供料动脉，以及n个=6（对于小动脉）。

RyRs在小动脉中缺乏作用。

与钙的缺乏一致²⁺我们发现，兰尼定（10μM）对钙无明显影响²⁺这些微血管中的信号：在赖氨酸定、钙的存在下²⁺仍观察到波浪(n个= 10,P（P）> 0.05). 为了排除使用的瑞安定浓度不足的可能性，我们使用较高浓度的这种生物碱（50μM）重复了这些实验，并获得了类似的结果：瑞安定（50μM）对钙没有影响²⁺波的出现、振幅或频率(图8,A–C). 与赖氨酸定对钙缺乏影响一致²⁺波，这种生物碱对总细胞内钙也没有显著影响²⁺(图8B类)和小动脉直径(图8C类). 将利多卡因（100μ，图8,D–F型)另一种RyR拮抗剂对任何测量参数也没有显著影响。

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图8。

Ryanodine受体对钙无贡献²⁺提睾小动脉的信号或肌源性张力。在80 cmH的含氟套管小动脉中₂O、 钙²⁺波浪，但不包括Ca²⁺定期观察火花。数据是Ca的平均值±95%置信区间²⁺波浪产状(A类和天)或Ca的平均值±SE²⁺波幅（F/F_o（o）)，加利福尼亚州²⁺波频率（Hz）(A类和天); 全球fluo-4强度，全球细胞内钙的指数²⁺(B类和E类); 和直径(C类和F类)在没有（PSS）或存在ryanodine受体拮抗剂ryanodie（50μM，n个= 6;A–C)或丁卡因（100μ，n个= 3;D–F型)如图所示。在存在ryanodine受体拮抗剂的情况下，未观察到PSS与值之间的显著差异(P（P）> 0.05).

RyRs在小动脉中表达的功能证据和ryanodine的疗效。

由于赖氨酸定对小动脉没有影响，我们使用RyR激动剂咖啡因检测了RyRs的功能表达(78)（10毫米，图9)以及ryanodine阻断咖啡因作用的能力作为ryanodine疗效的测试(图9,C类和天). 类似于Hill等人(34)，我们发现咖啡因对细胞内钙有双相作用²⁺小动脉血管直径加压至80 cmH₂O难以解释(图9A类). 然而，压力为20 cmH的容器₂O、 对咖啡因（10 mM）的持续反应是细胞内钙的典型短暂增加²⁺这与短暂的收缩有关(图9B类,n个= 7,P（P）< 0.05). 在单独的实验中，我们发现瑞安定（10或50μM）可以消除咖啡因诱导的收缩(图9,C类和天)证实了ryanodine有效地阻断了小动脉中的RyRs。如上所述，雷尼定单独使用不会影响静息小动脉直径(图9,C类和天).

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图9。

克remaster小动脉中ryanodine（Ryd）受体的功能证据。A类：340 nm/380 nm照明（右轴，点迹）下直径（左轴，固体轨迹）和fura-2发射强度比的典型记录，以响应加压至80 cmH的小动脉中10 mM咖啡因（重黑线）₂O.所示数据标准化为基线值，以便与B类10 mM咖啡因的应用引起了双相反应：呋喃-2比率的短暂增加和直径的减小叠加在呋喃2比率缓慢但持久的下降和扩张上。在另外6个小动脉中也获得了类似的结果。B–D类：数据为平均值±SE。B类：加压至20 cmH的小动脉直径（归一化为咖啡因前浓度值，左轴，上迹线）和呋喃-2比率（归一化为咖啡因前基线，右轴，下迹线）₂O.粗实线表示接触咖啡因的时间（10 mM），如图所示；n个= 7.C类和天：咖啡因（10 mM）和收缩的小动脉，这种收缩在瑞安定的存在下被阻断(C类，10微米，n个= 8; 和天，50微米，n个=7）如图所示*P（P）<0.05，与PSS显著不同。

与赖氨酸定对钙缺乏影响一致²⁺信号或直径，ryanodine对BK诱导的反应也没有影响_钙通道阻滞剂paxiline（100 nM，图10,A类和B类)或TEA（1 mM）(图10,B类和C类)表明RyRs和BK_钙小动脉中的通道没有功能耦合。因此，与我们在供血动脉中的发现相反，RyRs在小动脉平滑肌细胞中似乎沉默，对Ca无贡献²⁺在我们的实验条件下，小动脉中既没有信号也没有肌源性张力。

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图10。

瑞安定对BK阻断引起的收缩无影响_钙托马斯特小动脉内的通道。数据为无BK（PSS）或有BK时的平均直径±SE_钙通道阻断剂帕罗西汀（100nM，n个= 4;A类和B类)或TEA（1 mM，n个= 6;C类和天)兰尼定受体拮抗剂兰尼定（10μM，A–D)或帕西林+赖氨酸定的组合(A类和B类)或TEA+赖氨酸定(C类和天)如图所示*P（P）<0.05，与PSS显著不同。ψP（P）<0.05，与PSS有显著差异，但与相邻组无显著差异(P（P）> 0.05).

类似于TEA对钙的影响²⁺供血动脉中的波，这个BK_钙通道阻滞剂显著增加钙的发生²⁺小动脉中的波(图7天). 钙的振幅和频率有增加的趋势²⁺在TEA存在下出现波动，但这些没有达到统计学意义。然而，全球fluo-4浓度显著增加(图7E类)伴随着直径的显著减小(图7F类)如上所述。

IP的作用_三供料动脉中的Rs和PLC。

接下来我们调查了IP所扮演的角色_三钙生成中的Rs²⁺饲料动脉平滑肌细胞的信号和肌源性张力。与ryanodine对钙的影响类似²⁺这些船只中的波浪，IP_三R拮抗剂xestospongin D（5μM）几乎消除了Ca的发生²⁺波的振幅和频率显著降低，剩下的波很少(图11B类). 使用2-APB（100μM）获得了类似的结果(图11F类)，另一个假定的IP_三R拮抗剂。与IP角色一致_三和IP_三钙作用机制中的Rs²⁺我们还发现PLC抑制剂U-73122（10μM）大大减弱了Ca的发生、振幅和频率²⁺饲料动脉平滑肌细胞中的波(图11J). 该化合物的无活性类似物（U-73343，10μM）无作用：Ca²⁺火花和钙²⁺波形发生率、振幅和频率与PSS和整体Ca值无显著差异²⁺血管直径也不受U-73343的影响(P（P）> 0.05,n个= 6). 然而，与ryanodine对Ca的影响形成鲜明对比²⁺火花，也不是IP_三R拮抗剂（xestospongin D或2-APB）或PLC抑制剂（U-73122）对Ca的发生、振幅或频率有任何影响²⁺饲料动脉平滑肌细胞中的火花(图11,A类,E类、和我). 类似地，Ca的空间扩散（FWHM）和持续时间（FDHM）²⁺xestospongin D、2-APB或U-73122对火花没有显著影响(表2).

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图11。

肌醇1,4,5-三磷酸（IP_三)受体和磷脂酶C对钙的贡献²⁺波和肌原性张力，但不包括钙²⁺船员补给动脉中的火花。数据是Ca发生的平均值±95%置信区间²⁺火花(A类,E类、和我)或Ca²⁺波浪(B类,F类、和J). 所有其他数据均为振幅（F/F）的平均值±SE_o（o）)和Ca的频率（Hz）²⁺火花(A类,E类、和我)和钙²⁺波浪(B类,F类、和J); 全球fluo-4强度，全球细胞内钙的指数²⁺(C类,G公司、和K（K）); 和直径(天,H（H）、和L（左）)在没有（PSS）或IP在场的情况下_三受体拮抗剂xestospongin D（5μM，n个= 5;A–D)或2-氨基乙氧基二苯硼酸盐（2-APB，100μM，n个= 6;E–H（E–H）); 或磷脂酶C拮抗剂U-73122（10μM，n个= 6;I–L型). *P（P）<0.05，与PSS值有显著差异；n个= 6. 中的虚线天,H（H）、和L（左）以0 Ca表示血管的最大直径²⁺PSS系统。

表2。

血栓素海绵蛋白D、2-APB或U-73122对钙缺乏影响²⁺供料动脉中的火花特性

治疗	半高宽，μm	FDHM	n个
PSS系统	5.6 ± 0.4 (30)	0.49 ± 0.06	10至11
干海绵蛋白-D（5μM）	5.0 ± 0.4 (15)	0.39 ± 0.04	5
2-APB（100μM）	5.4 ± 0.4 (15)	0.34 ± 0.07	5至6
U-73122（10微米）	5.2 ± 0.3 (15)	0.41 ± 0.07	5至6

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数值为平均值±SE；N个，单元数；n个，船只数量。2-氨基乙氧基二苯硼酸盐；PSS，生理盐水溶液。对于FWHM，在显示Ca的3个细胞上进行测量²⁺每艘船的事件数。P（P）>0.05，与PSS中的值相比，FWHM或FDHM值之间没有检测到统计学上的显著差异。详见正文。

与赖氨酸或丁卡因对全球钙的影响相反²⁺供血动脉的直径、xestospongin D、2-APB或U-73122均降低了总Ca²⁺信号和扩张的供血动脉(图11,C类和天,G公司和H（H）、和K（K）和L（左）). IP的巨大影响_三供血动脉中的R拮抗剂表明，与RyRs不同，IP_三Rs不参与这些小动脉肌源性张力的负反馈调节。

IP的作用_三小动脉平滑肌中的Rs。

与我们在供血动脉中的观察结果类似，我们发现IP拮抗剂_三Rs（xestospongin D或2-APB）和PLC抑制剂（U-73122）几乎消除了Ca的发生²⁺克雷马斯特小动脉中的波，并显著降低了剩余波的振幅(图12,A类,天、和G公司). 2-APB和U-73122也显著降低了残余波的频率(图12,天和G公司). 干海绵蛋白D倾向于降低钙²⁺波频率，但未达到统计显著性(P（P）= 0.07;图12A类). 正如在供血动脉中观察到的那样，这些拮抗剂还降低了总钙²⁺水平并扩张小动脉(图12,B类和C类,E类和F类、和H（H）和我).

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图12。

IP（IP）_三受体和磷脂酶C对钙的贡献²⁺克remaster小动脉的波和肌源性张力。数据是Ca发生的平均值±95%置信区间²⁺波浪(A类,天、和G公司). 所有其他数据均为振幅（F/F）的平均值±SE_o（o）)和Ca的频率（Hz）²⁺波浪(A类,天、和G公司); 全球fluo-4强度，全球细胞内钙的指数²⁺(B类,E类、和H（H）); 和直径(C类,F类、和我)在没有（PSS）或IP在场的情况下_三受体拮抗剂xestospongin D（5μM，n个= 5;A–C)或2-APB（100μM，n个= 6;D–F型); 或磷脂酶C拮抗剂U-73122（10μM，n个= 4–8;G–I型). *P（P）<0.05，与PSS中的值显著不同。中的虚线C类,F类、和我以0 Ca表示血管的最大直径²⁺PSS系统。

讨论

我们的研究强调，RyRs在调节两种肌下膜Ca中所起的作用存在显著差异²⁺供血动脉及其下游小动脉的信号和肌源性张力，并显示RyRs和IP_三Rs在调节肌源性张力方面发挥着不同的作用。我们发现RyRs是Ca的基础²⁺火花，有助于钙²⁺并参与肌源性张力在供血动脉中的负反馈调节。然而，RyRs在提睾小动脉中似乎沉默，对平滑肌Ca的调节无作用²⁺这些微血管中的信号或肌源性张力。相比之下，IP_三Rs对Ca有重要贡献²⁺波和肌源性张力，可能通过供血动脉及其下游小动脉中的正反馈机制。

先前的研究已经描述了钙的形态和动力学²⁺许多血管床的平滑肌细胞产生火花。大多数研究都集中在分离的细胞上，几乎所有的研究都着眼于大脑的平滑肌细胞(8,24,28,43,56,67,74,77,85)，肠系膜的(72,86,87)，或肺部(73,81,84,87)血管。在所有这些研究中，观察到了广泛的火花特性：频率范围为0.3–2.85 Hz，振幅范围为1.2–3.2（F/F_o（o）)FWHM的范围为0.85–4.03μm，FDHM的范围为13.3–190 ms。研究完整血管火花特性的研究明显较少，其中大多数研究都集中在未加压的血管上，无论是无肌原性张力的血管(21,22,28,45,48)或以高K人为产生的音调⁺解决方案(16,79). 在这些研究中，火花特性也发生了变化：频率范围为0.12–1.53 Hz，振幅范围为1.36–1.93（F/F_o（o）)，FDHM范围为27–60.7 ms。其中只有两项研究观察了FWHM，并观察到1.25的空间扩散(21)和1.59(22)μm。四项研究，大脑(33,61)或肠系膜(54,64)血管，已调查钙²⁺完整加压血管的火花特性，其中三项研究使用了具有显著肌源性张力的血管(33,61,64). 上述三项研究也仅测量了钙的频率²⁺火花，使研究之间的比较变得困难。因此，钙似乎有相当大的可变性²⁺火花形态和动力学。

在仓鼠火葬场饲动脉中，我们观察到局部钙²⁺RyR拮抗剂ryanodine（10μm）、丁卡因（100μm）和SERCA抑制剂thapsigargin（100 nM）抑制但不受IP影响的信号_三R拮抗剂xestospongin D（5μM）或2-APB（100μM），或PLC拮抗剂U-73122（10μM）。基于其较小的空间分布(表1)根据药理学，我们将这些信号归类为钙²⁺火花。这些Ca的振幅²⁺火花出现在其他系统报告的数值范围内（见上文）。然而，我们报告的空间扩散（FWHM）和持续时间（FDHM）似乎大于在其他系统中观察到的值（见上一段）。我们无法解释这种差异。上述所有研究均使用不同血管床和不同动物种类的血管或分离细胞，实验条件（温度、压力、溶液等）在研究之间存在显著差异。因此，很难确定我们报告的火花特征差异是否与物种相关、与血管床相关，或者仅仅是由于用于研究这些细胞的工具的差异。很可能所有这些因素的组合导致了明显的异质性，需要做更多的工作，尤其是在完整的血管中，以明确定义钙的属性²⁺天然血管平滑肌细胞中的火花。

在控制条件下，供血动脉和小动脉均产生非同步钙²⁺波，而只有供血动脉产生钙²⁺火花。这些差异并不是非等效血管内压力的结果，因为四个不同的压力步骤导致肌源性张力和钙的类似变化²⁺两种血管类型的信号。我们的数据与Mufti等人最近对脑动脉的研究一致(65)表明血管内压力的增加对非同步钙的发生和频率有更大的影响²⁺压力阶跃低于80 cmH时的波₂O.然而，我们的研究与Jaggar的不同(42)谁发现血管内压力的增加导致钙的增加²⁺脑动脉平滑肌的放电频率，而压力对Ca的发生、幅度或频率没有影响²⁺在类似的压力范围内激发我们的研究火花。

在供血动脉中，我们发现RyR拮抗剂ryanodine（10μM）和丁卡因（100μM）以及SERCA拮抗剂thapsigargin（100 nM）均抑制Ca²⁺火花和钙²⁺波浪导致全球Ca升高²⁺，并产生血管收缩。这些数据与许多先前的研究一致，并进一步支持RyRs可能通过其与BK的功能耦合的假设_钙通道，参与阻力动脉肌源性张力的负反馈调节(27,52,68). 与此假设一致，我们发现在BK存在的情况下，赖氨酸诱导的供血动脉收缩被消除_钙通道阻滞剂帕西林（100 nM）或TEA（1 mM）。因此，我们认为，在供血动脉中，RyR功能的丧失是由于RyR（ryanodine或tecaine）的阻滞或Ca的耗竭所致²⁺存储（thapsigargin）导致BK下降_钙通道活性、膜去极化和钙增加²⁺通过电压门控钙的流入²⁺先前假设的通道(68). Ca的一部分²⁺thapsigargin（100 nM）引起的增加和血管收缩可能是由钙引起的²⁺储存消耗诱导的阳离子进入导致去极化和钙²⁺如前所示，大鼠第一级提睾小动脉增加(71).

与BK的效果相反_钙通道阻断对瑞诺定的反应，瑞诺定只能减弱帕西林或TEA诱导的供血动脉血管收缩。这些数据表明Ca²⁺通过RyRs的释放仅提供负责BK活性的信号的一小部分_钙通道和Ca²⁺其他来源可能有助于BK的监管_钙仓鼠体内的通道供养动脉。

我们的观察表明，赖氨酸或丁卡因也抑制钙²⁺供血动脉中的波支持先前对几种平滑肌的研究(19,29,32,37)包括视网膜小动脉平滑肌细胞(76)其中RyRs有助于Ca²⁺可能通过CICR。我们的研究与肾传入小动脉的报道不同，在肾传入小血管中，兰尼定扩张小动脉并减少激动剂引起的血管收缩(三). 这些数据支持我们的观点，即血管平滑肌细胞中RyRs的功能存在显著的区域异质性。兰尼定（10μM）对钙的抑制作用也是可能的²⁺饲料动脉中的波动是由赖氨酸诱导的细胞内储存物耗竭引起的(36,38)或兰尼定或丁卡因对IP的其他影响_三R介导的钙²⁺信号(59). 然而，我们发现Ca²⁺二级托马斯特小动脉中的波不受兰尼定（10-50μM）或丁卡因（100μM）的影响，这表明这种离靶效应不太可能发生。需要进一步的研究来确定RyRs在Ca中所起的确切作用²⁺供血动脉中的波发生。

与我们在供血动脉中的发现相反，我们无法检测到钙²⁺使用相同的方法在克雷马斯特小动脉中产生火花。支持这些观察，我们发现RyR拮抗剂ryanodine（10-50μM）或丁卡因（100μM）对钙无影响²⁺波动动力学，全局细胞内钙²⁺、肌原性张力或BK引起的收缩_钙通道阻滞剂帕罗西林（100 nM）或TEA（1 mM）在加压二级提睾小动脉中。这些数据表明RyRs不参与Ca²⁺至少在我们的实验条件下，二级骨骼肌小动脉中肌原性张力的信号传递。我们不能排除这样一种可能性，即我们可能错过了由RyRs在小动脉中介导的一些持续时间短、振幅低的事件。然而，如果存在此类事件，则它们不会与其他Ca耦合²⁺信号或对这些微血管肌原性张力的调节，因为兰尼定（10-50μM）和丁卡因（100μM）在小动脉中均未产生任何显著影响。根据咖啡因诱导的钙离子浓度评估，尽管存在功能明显的RyRs，但小动脉中缺乏赖氨酸（10-50μM）和丁卡因（100μM）的作用²⁺瞬变和收缩也表明，在供血动脉中观察到的赖氨酸和丁卡因的作用并不仅仅如上文所述的那样偏离目标。

我们对无钙的发现²⁺二级提肌小动脉平滑肌细胞中的火花与Yang等人最近从大鼠一级提肌微动脉分离出的平滑肌细胞的研究一致(82)他也没有检测到Ca²⁺他们实验中的火花，以及输尿管和输精管毛细血管前小动脉的最新观察(10). 然而，与Yang等人的研究相反(82)通过压力肌电图研究发现，瑞安定显著收缩了大鼠一级提睾小动脉，我们发现瑞安定（10–50μM）和丁卡因（100μM）均未对直径或细胞内钙产生任何显著影响²⁺二阶仓鼠cremaster小动脉中的信号。小动脉分支顺序之间的差异可能意味着一级小动脉是供血动脉之间的过渡，我们发现赖氨酸或丁卡因抑制钙²⁺火花和波动产生强烈的血管收缩和二级小动脉，RyRs似乎沉默。我们认为我们的数据不能用RyRs的完全缺乏或ryanodine在小动脉中的疗效的缺乏来解释。咖啡因产生强健的钙²⁺小动脉平滑肌细胞的短暂变化，证明RyRs的功能存在。此外，我们能够用赖氨酸定（10-50μM）阻断咖啡因的作用，验证了我们使用的这种生物碱的浓度有效地抑制了RyRs。因此，我们的数据表明，与动脉平滑肌中报告的负反馈作用相比，RyRs在二级仓鼠小动脉基础肌原性张力的调节中几乎没有作用(44,52,68,83). 我们的发现也与在大鼠视网膜小动脉中的观察结果形成对比，其中RyR-based Ca²⁺此前曾报道过火花(21,22)并似乎对全球Ca有贡献²⁺信号(76). RyRs似乎也有助于大鼠肾小球前小动脉的正反馈CICR(25,26). 从我们的结果来看，视网膜和肾小动脉的这些数据支持这样的假设，即小动脉平滑肌细胞中RyR的功能存在显著的区域差异，以及小动脉和上游供血动脉之间RyR功能的差异。

瑞安定（10-50μM）和丁卡因（100μM）对钙的影响不足²⁺信号、肌源性张力和帕西林或TEA诱导的二级小动脉收缩也表明钙的来源²⁺负责BK的监管_钙这些微血管中的通道可能与报道的动脉平滑肌不同，动脉平滑肌中的钙²⁺火花重要控制BK_钙通道功能与平滑肌兴奋性(27,44,52,68). 神经元研究(5,30,75)和冠状动脉平滑肌(31)暗示Ca²⁺通过电压门控Ca流入²⁺通道也可以调节BK_钙频道。我们对托马斯特小动脉的初步研究与这一假设相一致(7). 还需要进一步的研究来在微循环中严格检验这一假设。

我们的研究没有阐明血管间RyR功能差异的机制。然而，先前对其他平滑肌的研究表明，RyR亚型表达模式可以显著改变RyR的功能(20,49,50,57,87). RyR亚型1和/或2似乎对钙至关重要²⁺火花形成(20,49)，而RYR3(57)或这种亚型的拼接变体(50)可能对钙有抑制作用²⁺火花。小鼠乳糜喂养动脉及其下游小动脉的初步研究与我们在仓鼠血管中进行的功能研究一致，表明RyR亚型表达的差异可能是动脉和小动脉之间功能差异的基础(55). 需要进行更多的研究来确定RyR亚型表达的差异是否是供血动脉和小动脉之间观察到的差异的基础。

我们发现，受压小动脉及其下游小动脉中的平滑肌细胞（发展成类似水平的肌张力）持续显示Ca²⁺在没有添加激动剂的情况下波动。我们的观察结果与在大鼠肠系膜小动脉中获得的观察结果不同(64)其中只有7%的细胞生成Ca²⁺压力诱导肌源性张力引起的波，以及最近对大鼠肠系膜和输精管小动脉和动脉的研究，其中Ca²⁺在没有血管收缩剂激动剂的情况下，在未加压血管中未观察到振荡(10). 这些数据支持这样的观点，即在调节钙的机制和潜在钙的机制方面存在显著的区域差异²⁺信号转导和肌源性张力。

我们发现一种PLC抑制剂（U-73122，10μM）和两种结构不同的IP_三R拮抗剂（xestospongin D，5μM；或2-APB，100μM）几乎消除了Ca的发生²⁺波，全球细胞内钙减少²⁺抑制供血动脉和提睾小动脉的肌张力。这些数据支持大量证据表明PLC与肌源性张力的发生有关(2,17,39,46,47,69)并扩展了最近关于输精管小动脉的报道，表明IP在其中起着核心作用_三受体在激动剂诱导的小动脉张力调节中的作用(10). 最近的研究表明，U-73122可能会消耗细胞内钙²⁺商店(60). 我们不认为钙的消耗²⁺商店可以解释U-73122对钙的抑制作用²⁺我们观察到的波动，因为这种PLC抑制剂对RyR-基钙没有影响²⁺饲料动脉中的火花。在平滑肌中，RyRs和IP_三Rs似乎访问同一个Ca池²⁺(62). 因此，U-73122对钙缺乏作用²⁺斯帕克斯反对这种通过细胞内钙耗竭发挥作用的药剂²⁺储存在我们的研究中。此外，我们发现SERCA抑制剂thapsigargin（100 nM）在消除Ca²⁺火花和钙²⁺海浪，也使全球Ca显著增加²⁺以及供血动脉和小动脉的血管收缩，与U-73122和IP的作用相反_三R拮抗剂。随着U-73122对钙缺乏作用²⁺sparks博士认为，储存损耗是U-73122对供血动脉和小动脉产生影响的主要手段。两个2-APB(9)和xestospongins(70)除IP外，已知对其他离子通道有影响_三Rs.As Ca（以Ca计）²⁺供血动脉中的火花不受这些药物的影响，我们可以排除细胞内储存的耗尽或对RyRs的影响是常见的非靶向机制。因此我们推测细胞内钙的下降²⁺U-73122、xestosponin D和2-APB随后观察到的血管扩张是由于抑制IP_三R基钙²⁺波浪和Ca的损失²⁺抑制IP导致的信号放大_三形成（U-73122）或封锁IP_三Rs（xestospongin D或2-APB），而不是因为抑制剂可能的非靶向效应。用thapsigargin（100 nM）抑制SERCA也消除Ca²⁺但由于钙的消耗²⁺储存，钙的刺激²⁺通过存储依赖机制进入，以及可能的去极化诱导的钙激活²⁺通过电压门控钙的流入²⁺先前观察到的通道(59). 因此，thapsigargin使全球Ca增加²⁺和血管收缩以及钙的抑制²⁺供给动脉和钙中的火花²⁺供血动脉和小动脉中的波。

通过电压门控钙的钙内流²⁺在正常情况下，通道和其他离子通道对肌源性张力起重要作用(23,35). 我们发现PLC-IP的主要作用_三-知识产权_三R通路在全球钙调节中的作用²⁺肌源性色调提示IP_三Rs可能发挥正反馈作用，可能放大Ca²⁺来自其他来源的信号和对Ca的贡献²⁺-小动脉和小动脉中肌源性张力的依赖成分。在小动脉中，RyRs可能有助于这种放大（我们发现ryanodine不仅抑制Ca²⁺火花和钙²⁺仓鼠供血动脉中的波），如上文所述，供血动脉RyRs的主要功能似乎是对肌源性张力进行负反馈调节。因此，RyR和IP_三Rs在供血动脉肌源性张力的调节中起着截然不同的作用，而只有IP的正反馈功能_三R在托马斯特小动脉中表现出功能性。

在我们的研究中，我们不能排除内皮可能的调节作用，因为所有使用的血管都是内皮完整的。我们认为，由于以下原因，观察到的任何反应都不是严格依赖内皮细胞的。我们之前已经证明，仓鼠二级提睾小动脉的内皮细胞似乎不表达功能性RyR，因为咖啡因（10 mM）不会诱导Ca²⁺这些电池中的瞬态(18). 因此，至少在小动脉中，我们认为瑞安定和丁卡因缺乏作用不能用对内皮细胞的某些作用来解释。IP抑制剂_三途径（xestospongin D、2-APB和U-73122）均应抑制内皮细胞Ca²⁺信号(18)而且，如果有的话，往往会产生血管收缩。这与在供血动脉和小动脉中观察到的情况相反。相反，thapsigargin应增加内皮细胞Ca²⁺并产生血管舒张(63)与在两类血管中观察到的情况相反。然而，我们不能排除内皮可能减弱某些观察到的影响的可能性。这是我们实验设计的局限性。

总的来说，我们的研究表明，两种平滑肌细胞Ca的调节存在重要差异²⁺供血动脉及其下游小动脉之间的信号和肌源性张力。RyRs在肌源性张力调节中所起的负反馈作用在二级仓鼠前肢小动脉中似乎并不成立。相反，PLC和IP_三在乳糜喂养动脉和小动脉平滑肌细胞中，Rs的功能类似。我们观察到的供血动脉和下游小动脉之间的差异提醒我们，即使在密切相关的血管中，动脉中收集的数据也可以推断为小动脉，反之亦然。这些机制上的差异也指出了潜在的、新的治疗靶点，以调节小动脉的张力，例如，独立于上游阻力动脉。这种微血管特异性治疗靶向性将允许调节组织血流和器官内血流分布，而不会对全身血压和副作用产生实质性影响，如直立性低血压、，这通常是由非特定靶向阻力动脉和小动脉的药物引起的。

赠款

这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所拨款RO1-HL-32469和PO1-HL-070687以及美国心脏协会奖学金0815778G的支持。

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

致谢

参考文献