E-Cadherin拮抗转化生长因子β1通过抑制RhoA依赖性Smad3磷酸化在肝星状细胞中诱导基因表达

摘要

E-cadherin（ECAD）是一种跨膜糖蛋白，介导粘附连接，在发育上仅限于极化上皮细胞。^1,2ECAD的重复胞外结构域负责将细胞与相邻细胞结合，并维持上皮的结构完整性和极化。ECAD还通过细胞内连环蛋白（ctn）结合结构域调节信号通路。^1,2钙黏蛋白转换是上皮-间充质转化（EMT）过程中的一种特征性行为。钙粘蛋白转换的一个重要表型变化是ECAD表达的丢失。ECAD的丢失导致细胞与其相邻细胞分离，导致细胞极性的丧失。这反过来又导致调节间充质转化的细胞信号通路的激活。相反，ECAD表达的增加以粘附无关的方式抑制细胞转化和肿瘤细胞侵袭。^三,4

肌成纤维细胞在创伤愈合和病理器官重塑中起着关键作用。⁵肝脏中最被接受的肌成纤维细胞祖细胞是肝星状细胞（HSC），^5,6尽管各种其他常驻细胞被认为是肝肌成纤维细胞的来源。⁵当HSC激活时，ECAD表达水平降低。⁷激活的HSC随后促进细胞外基质（ECM）成分的合成和沉积，并诱导α-平滑肌肌动蛋白(αSMA）。此外，多个信号级联加速激活HSC的生长⁶并有助于肝纤维化的发展。尽管已经研究了HSC中钙粘蛋白转换和EMT过程之间的联系，^7,8目前尚不清楚ECAD是否影响HSC的激活。此外，ECAD拮抗静止HSC中促纤维化基因表达的潜在信号和分子调控机制尚未探索。

几行证据表明转化生长因子β1（TGFβ1） 自分泌或旁分泌来源在激活HSC和增加ECM蛋白的合成以及各种基质蛋白的细胞受体方面发挥作用。⁶TGF公司β1在转录上受转录因子调节，在翻译后受前体的成熟调节。⁶针对TGFβ1，I型和II型TGFβ1受体形成复合物并诱导受体自身磷酸化。TGF公司β1也称为诱导EMT的细胞因子，通过上调转录阻遏物（如蜗牛、Zeb和Twist）抑制ECAD表达。⁹激活的TGFβ1受体传递调控Smad分子（Smad3/2）磷酸化并与co-Smad（Smad4）形成活性复合物的信号。然后，转录因子复合物移动到细胞核，通过与特定Smad结合元件（SBE；也称为CAGA盒）的相互作用促进靶基因的转录。¹⁰据报道，小型企业实体的单个或多个副本位于TGF的上游区域β1的靶基因，如纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）、基质金属蛋白酶（MMPs）和I型胶原。^11,12

尽管发现TGFβ1导致HSC激活并伴有ECAD丢失的表型改变，并导致肝脏ECM蓄积，尚未确定ECAD过度表达是否抑制转化生长因子β1及其下游靶基因。我们研究了ECAD是否负性调节TGFβ1表达；我们还研究了分子基础可能是什么。我们的发现表明转录抑制转化生长因子β1ECAD基因。因此，ECAD的缺失启动了转化生长因子β1诱导，从而促进ECM积累基因的表达。此外，本研究的结果导致了ECAD的p120-ctn结合域被鉴定为与p120-ctn形成复合物所需的位点，该复合物招募ras同源基因家族A（RhoA）；这导致RhoA活性受到抑制。本文提供的数据支持ECAD阻碍RhoA活性的能力，这对Smad信号通路至关重要。

材料和方法

结果

ECAD抑制N-钙粘蛋白（NCAD）、αSMA和波形蛋白水平

重复二甲基亚硝胺（DMN）治疗引起的肝损伤激活HSC并导致肝纤维化。¹³用于确认ECAD损失与HSC激活的关联体内对多次接触DMN的大鼠肝脏进行免疫组化。DMN治疗后，与健康对照组相比，动物的体重增加减少了10%。在大鼠肝脏中观察到坏死和纤维堆积，坏死和纤维化评分增加（数据未显示）。对照大鼠的肝脏切片同时显示GFAP（静止HSC的标记物）和ECAD（上皮表型的标记物；图1A，顶部）。相比之下，DMN治疗导致肝切片中GFAP和ECAD表达降低，而肝组织中GFAP与ECAD的表达则相反增加αSMA，这表明HSC激活(图1A，底部）。免疫组织化学分析证实了纤维化肝脏中ECAD的丢失。这些结果增加了ECAD丢失促进HSC激活的可能性体内.

在单独的窗口中打开

图1

ECAD对αSMA和vimentin。（A） 纤维化肝脏的ECAD丢失。复制用载体（顶部）或DMN（10）处理过的大鼠的肝脏切片μL/kg体重，每周腹膜内注射3次，持续4周；底部）对ECAD进行免疫化学染色，αSMA或GFAP（红色）。箭头和箭头表示ECAD的强烈强度，αSMA和GFAP。中间一栏中的箭头显示α血管平滑肌周围SMA的表达。这些图片是来自至少六个独立实验的代表性图像。比例尺代表20（左右）或50μm（中间）。（B） HSC中的Cadherin切换。原代HSC在生长培养基中培养6或12天，细胞裂解物（30μg）进行免疫印迹（左）。ECAD和NCAD的表达水平也在HepG2细胞、原代肝细胞或静止HSC（上皮型）的裂解液中以及活化HSC、LX-2细胞或MEF细胞（间充质型；右）的裂解物中测定。（C） 实时PCR分析。这些数据是至少六个独立实验的平均值和标准误差（与第0天相比有显著差异：**P（P）< 0.01). （D） 强制ECAD过度表达对αSMA和波形蛋白水平。用腺病毒重组ECAD感染HSC和LX-2细胞（感染倍数=50）。以腺病毒GFP为对照。结果由三个单独的实验证实。（E） 腺病毒重组ECAD感染LX-2细胞的实时PCR检测（与腺病毒GFP感染显著不同：**P（P）<0.01和*P（P）< 0.05).

了解钙粘蛋白转换与α在原代培养的HSC中监测SMA表达、ECAD表达的时间依赖性变化。GFAP和ECAD在正常大鼠肝脏中共定位(支撑图2A、B)这验证了HSC对ECAD的表达。⁷第0天静止的HSC表现出ECAD的表达，但没有αSMA或波形蛋白，以及肝细胞(图1B，左）；这表明从健康肝脏分离的HSC具有上皮表型。培养后，ECAD的表达水平下降，而转分化标记（NCAD，αSMA和vimentin）增加。此外，NCAD在LX-2细胞（一种活化的HSC细胞系）中的表达显著，并且αSMA和波形蛋白(图1B，右侧）。正如预期的那样，MEF细胞（成纤维细胞系）也显示NCAD的表达增加，αSMA和vimentin。我们评估了转化生长因子的表达β第0天和第12天调控HSC EMT的靶基因（此时ECAD表达明显不同）。骨形态发生蛋白7（Bmp7）和DNA结合抑制剂2（Id2）的信使RNA（mRNA）水平在第12天显著降低，但蜗牛、扭转和PAI-1的水平增加(图1C); 这表明激活HSC中ECAD的丢失可能通过诱导TGF促进EMTβ靶基因。

ECAD的异位表达以粘附无关的方式阻止细胞转化和肿瘤细胞侵袭。^三,4接下来，ECAD过度表达对NCAD水平的影响，α在激活的原代培养HSC中检测SMA和波形蛋白(图1D，左）。ECAD的强制表达抑制了NCAD的表达水平，αSMA和HSC中的vimentin。一贯地，ECAD过度表达导致MEF和LX-2细胞发生类似的变化(图1D、中间和右侧）。此外，ECAD的强制表达增加了EMT、Bmp7和Id2的负调节因子，但反过来降低了EMT、Snail和Twist的正调节因子(图1E). 这些结果表明ECAD的表达改变了HSC的激活状态。

抑制基底TGFβ1和靶基因表达

TGF公司β1刺激HSC活化和肝纤维化。^6,13因此，ECAD的强制表达对转化生长因子β1在随后的实验中对该基因进行了监测。ECAD的过度表达导致荧光素酶活性从转化生长因子β1在MEF细胞中构建启动子，但在转染NCAD的细胞中未观察到(图2A，左）。相反，TGFβ1荧光素酶活性因NCAD过度表达而适度增加。基础TGF降低βECAD也证实1在LX-2细胞和HSC中表达(图2A、中间和右侧）。实时PCR分析验证了ECAD抑制转化生长因子β1基因(图2B). TGF公司β1通过激活下游靶基因如PAI-1和MMPs促进ECM的重塑和沉积。^6,11,12同意镇压转化生长因子β1ECAD在MEF和LX-2细胞中的过度表达均抑制了PAI-1、MMP2和MMP9的基础荧光素酶活性(图2C). 正如预期的那样，ECAD表达降低了PAI-1、MMP2、MMP9、胶原型IA（COL1A）和α座椅模块组件(图2D). 我们的结果支持ECAD具有抑制TGF的能力的论点β1基因表达，从而抑制其下游靶基因。

在单独的窗口中打开

图2

ECAD对TGF的影响β1及其靶基因反式激活。（A） 抑制基础TGFβ1 ECAD基因表达。用TGF转染MEFβ1荧光素酶构建物与编码ECAD或NCAD的构建物（模拟转染的pCEP4）结合。LX-2细胞或HSC被腺病毒GFP或ECAD感染。荧光素酶的活性通过β-半乳糖苷酶。（B） 实时PCR分析。TGF公司β在稳定转染ECAD的MEF中测量1 mRNA水平。（C） 报告基因活性。（D） 用ECAD稳定转染的MEFs的实时PCR分析。这些数据是至少三个单独实验的平均值和标准误差（与模拟转染或腺病毒GFP感染相比有显著差异：**P（P）<0.01和*P（P）< 0.05).

抑制TGFβ1诱导的SBE活性和Smad3/2磷酸化

转化生长因子激活的信号通路β1涉及TGFβ1受体介导的细胞信号传导。为了确定ECAD对TGF的监管基础β1信号通路，我们测量了ECAD强制表达对TGF的影响β1介导自身基因的诱导。原发性HSC暴露于TGFβ1（5 ng/mL，持续12小时）导致TGF增加2.8倍β与对照组相比，1个报告基因活性，ECAD消除了这一活性(图3A，左）。同样，TGFβ1-诱导型转化生长因子βECAD也降低LX-2细胞的荧光素酶活性(图3A，右侧）。评估ECAD是否抑制SBE介导的基因诱导对TGF的反应β1处理后，我们在用pGL3-（CAGA）转染的MEFs或LX-2细胞中进行了报告基因测定⁹-MLP荧光素酶。正如预期的那样，ECAD过度表达显著降低TGFβ这些细胞中的1-诱导SBE荧光素酶活性(图3B)：瞬时转染和稳定转染的效果相当。MEF中的SBE报告活性低于LX-2细胞的10%。

在单独的窗口中打开

图3

ECAD对TGF的影响β1-诱导报告基因活性。（A） TGF公司β1个报告基因活性。用TGF处理细胞β1（5 ng/mL，持续12小时）。（B） Smad记者活动。将ECAD瞬时转染的MEF或LX-2细胞与SBE-驱动的报告构建物结合，用TGF处理β1持续12小时。在稳定转染ECAD的MEF中也测量了报告活性。数据是三个独立实验的平均值和标准误差（与模拟转染相比有显著差异：*P（P）<0.05和**P（P）< 0.01).

TGF公司β1受体介导的细胞信号依赖于Smad3/2磷酸化；这允许磷酸化的Smad3/2与Smad4形成低聚物。合成的复合物转移到细胞核中，在那里起到转录激活剂的作用。¹⁰解决ECAD和TGF之间的下游链接β1抑制，我们评估了ECAD对TGF的抑制作用β1依赖性Smad3/2磷酸化。TGF治疗模拟转染MEF或GFP感染的LX-2细胞β1增强Smad3/2磷酸化(图4A). 有趣的是，ECAD过表达减弱了Smad3的磷酸化，在较小程度上减弱了Smad2的磷酸化。TGF处理的LX-2细胞也观察到类似的变化β1例ECAD腺病毒感染后。正如我们预期的那样，ECAD抑制Smad3从SBE驱动的报告者或TGF诱导荧光素酶活性的能力β1个报告构造(图4B). 我们的结果表明，ECAD抑制Smad3/2磷酸化，从而拮抗Smad-依赖性基因转录。

在单独的窗口中打开

图4

ECAD过度表达对Smad活性的影响。（A） 磷酸化Smad3和Smad2的免疫印迹。用TGF处理稳定转染ECAD的MEF或感染ECAD的LX-2细胞β1（5纳克/毫升）。（B） Smad和TGFβ1个报告基因活性。数据是三个独立实验的平均值和标准误差[与模拟转染（左）或Smad3转染（右）相比有显著差异：**P（P）< 0.01].

RhoA对Smad3/2磷酸化的调控及基因诱导

除了Smad途径，TGFβ1受体信号传导激活其他途径，如小鸟嘌呤三磷酸酶（GTPase）、丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶。¹⁰这些通路可能与Smad信号相互作用。^10,16特别是，RhoA调节Smad磷酸化和Smad依赖性基因诱导以响应TGFβ1¹⁶验证RhoA在TGF中的调节作用β1依赖性Smad激活，在用细胞渗透性C3毒素（RhoA抑制剂）处理的细胞或转染ras同源基因家族a（DN-RhoA）显性阴性突变的细胞中监测Smad3/2的磷酸化状态。用C3毒素处理LX-2细胞导致Smad3/2磷酸化降低，从而抑制TGF的能力β1诱导SBE荧光素酶活性(图5A). 此外，DN-RhoA转染抑制TGFβ自身基因或SBE报告基因的1依赖性诱导(图5B). 类似地，C3毒素处理或DN RhoA转染显著减弱了Smad3诱导的SBE报告基因活性(图5C)这证实了RhoA抑制拮抗Smad3依赖的基因转录。此外，用编码ras同源基因家族a（CA-RhoA）组成活性突变体的构建物转染逆转了ECAD抑制TGF的能力β1-诱导或Smad3-诱导SBE荧光素酶活性(图5D、E). 这些结果表明，ECAD对Smad活性的抑制可能与RhoA抑制有关。

在单独的窗口中打开

图5

RhoA与ECAD抑制Smad活性的关联。（A） C3毒素对Smad3/2磷酸化和Smad-driven报告活性的影响。在用TGF处理的LX-2细胞中测量磷酸化Smad3/2的水平β在细胞渗透性C3毒素处理4小时后1小时。（B） DN RhoA对转化生长因子的抑制作用β1-诱导型转化生长因子β1名记者或Smad记者活动。在用TGF处理的LX-2细胞中测量荧光素酶活性β1转染后12小时。（C） RhoA抑制抑制Smad3诱导的SBE报告活性。在Smad3转染后用C3毒素处理或用DN-RoA转染的细胞的裂解物上测量SBE萤光素酶活性。（D） CA-RhoA逆转ECAD抑制TGF的能力β1-诱导SBE荧光素酶活性。（E） 通过CA-RhoA逆转ECAD抑制Smad3诱导的SBE荧光素酶活性的能力。数据是三个独立实验的平均值和标准误差（与模拟转染相比有显著差异：**P（P）< 0.01).

ECAD的p120-ctn结合域在TGF中的作用β1压制

ECAD通过钙粘附素的细胞外重复结构域对粘附连接产生影响，而ECAD的细胞内结构域调节信号通路。^1,2ECAD包含直接与p120-ctn或β-集装箱。¹为了更深入地了解ECAD和RhoA的机制，我们测量了ECAD的几种突变结构抑制TGF的能力β1个报告基因活性(图6A，上部）。用编码E-cadherin（ECDT）C末端细胞内结构域的构建物转染（瞬时）导致TGF降低β1荧光素酶活性与用全长ECAD获得的荧光素酶活性相当(图6A，底部），这支持了细胞内结构域负责TGF的概念β1基因抑制。任一ECAD/α-ctn，用于编码与融合的ECADα-ctn或ECAD–Δβ-ctn，编码ECAD突变β-ctn结合域，也抑制TGFβ1个类似程度的记者活动。相反，ECAD–Δp120-ctn的转染在p120-ctn结合域中表达突变的ECAD，未能抑制TGFβ1基因转录。因此，TGF的抑制βECAD的1基因可能依赖于p120-ctn结合域。此外，ECAD–Δp120-ctn对PAI-1、MMP2或MMP9荧光素酶活性缺乏抑制作用，证实了p120-ctn结合域在抑制基因中的重要作用(图6B). 根据这些结果，我们得出结论，ECAD的p120-ctn结合结构域可能参与抑制TGFβ1或其下游基因诱导。

在单独的窗口中打开

图6

ECAD突变体对TGF表达的影响β1个基因或其靶基因。（A） TGF公司β1荧光素酶活性。示意图显示了主要的蛋白质结合域。基础TGFβ用ECAD的每个突变体构建物瞬时转染MEF细胞，测量1个报告者的活性。（B） 报告基因活性。数据是至少三个单独实验的平均值和标准误差（与模拟转染相比有显著差异：**P（P）< 0.01). 缩写：NS，不重要。

招募RhoA到绑定到ECAD的p120-ctn

ECAD通过p120-ctn调节小GTPase的活性。^1,17为了理解ECAD和RhoA之间的联系，我们探索了p120-ctn在这些分子相互作用中的作用(图7A). 正如预期的那样，根据免疫沉淀和免疫印迹分析，ECAD的强制表达显著增加了其与LX-2细胞中p120-ctn的相关性。此外，强制ECAD表达增加了p120-ctn和RhoA之间的相互作用：ECAD促进RhoA募集到其与p120-ctn的复合体，尽管它没有改变p120-cln和RhosA的基本表达水平。RhoA通过p120 ctn结合被募集到ECAD的假设通过在用ECAD–Δp120 ctn转染的细胞中缺乏ECAD与RhoA的结合来验证(图7B).

在单独的窗口中打开

图7

ECAD通过p120-ctn结合与RhoA的相互作用。（A） IP-IB分析。对ECAD免疫沉淀物进行p120-ctn免疫印迹。为了评估蛋白质相互作用，对RhoA免疫沉淀物进行p120-ctn或ECAD免疫印迹；10%的总裂解物用作输入对照。K18作为阴性对照。（B） 通过p120-ctn将ECAD与RhoA关联。用ECAD或ECAD–Δp120-ctn转染LX-2细胞。（C） RhoA活性测定。用TGF处理LX-2细胞，测定RhoA活性βECAD感染后15分钟。（D） p120-ctn敲除对ECAD抑制RhoA能力的影响。用腺病毒ECAD构建物感染LX-2细胞，转染p120-ctn-siRNA，然后暴露于TGFβ1.（E）RhoA与ECAD和RhoA活性的结合。在第0天和第12天在HSC中测量RhoA和ECAD之间的相互作用（左）以及RhoA活性（右）。（F） p120-ctn敲除对TGF的影响β1-诱导型Smad3磷酸化。这些数据是至少三个单独实验的平均值和标准误差（与用TGF治疗的GFP感染细胞相比有显著差异β1). 缩写：IB，免疫印迹；IgG、免疫球蛋白G；IP，免疫沉淀；K18，细胞角蛋白18；NS，不显著。

由于RhoA在Smad信号通路中的调节作用，在TGF处理的细胞中测定了ECAD对RhoA活性的影响β1.如预期，TGFβ与对照相比，1处理增加了RhoA活性，该活性被ECAD过表达完全拮抗(图7C). 靶向p120-ctn的siRNA逆转了ECAD介导的RhoA抑制(图7D). 此外，我们在第0天和第12天检查了HSC中RhoA和ECAD之间的物理相互作用。正如预期的那样，ECAD在第0天与RhoA相互作用，但在第12天由于ECAD的缺陷而消失(图7E，左）。激活的HSC中RhoA活性持续增加(图7E，右侧）。同样，在LX-2细胞或原代HSC中，ECAD抑制Smad3磷酸化的能力被p120-ctn敲低而减弱(图7F).

为了显示ECAD功能在临床情况下的生物学相关性，我们比较了轻度或重度纤维化患者组的ECAD表达水平。轻度纤维化患者的ECAD水平明显高于重度纤维化患者(图8A，左）。相反，αSMA表达水平随着疾病的进展而增加。对人类肝脏样本的多重分析表明，ECAD的表达与纤维化的严重程度相互关联(图8A（右），并验证了ECAD在人类肝纤维化中的生物学功能和相关性。

在单独的窗口中打开

图8

ECAD表达与纤维化。（A） 轻度纤维化（Ishak纤维化评分≤2）或重度纤维化（Ishak纤维化=6）患者的ECAD表达。对肝脏切片（每组9名患者）进行H&E和ECAD染色（红色）和αSMA（绿色）免疫组织化学。这些图片是有代表性的图片。比例尺代表50μm.使用图像分析软件在肝脏切片上测定ECAD的面积分数（%）。数据为平均值和标准误差（n=9；与轻度纤维化相比差异显著）。（B） ECAD预防Smad3依赖性TGF的拟议信号通路β1基因诱导。缩写：H&E、苏木精和曙红。

总之，所有这些结果都提供了令人信服的证据，证明ECAD通过将RhoA招募到与p120-ctn结合域结合的p120-ctn来抑制RhoA活性，从而阻止HSC中依赖RhoA的Smad信号通路(图8B).

讨论

在健康肝脏中，静止的HSC没有纤维形成表型，增殖能力低。这些HSC是主要的维生素A储存场所。任何病因的反复损伤都会触发各种炎症过程，例如细胞因子的产生、炎症细胞的募集以及HSC向更具收缩性和纤维生成性肌成纤维细胞的表型转变。⁶具有肌纤维母细胞样表型的活化HSC失去其脂滴，增殖，迁移至腺泡3区，并产生I、III、IV型胶原和层粘连蛋白。因此，活化的HSC负责发展和建立纤维化，这是肝硬化的一种准备状态。肝硬化导致肝实质细胞破坏，形成间隔和结节，以及血流改变。⁶

ECAD在静止HSC中表现为主要形式⁷上皮组织中的大多数正常细胞。当HSC被激活时，ECAD表达水平通过钙粘附素转换过程（即从ECAD表达转换为NCAD表达）而降低。因此，这是向NCAD表达的转换，然后是ECAD的丢失。活化的HSC随后改变基因表达谱并获得迁移表型。^1,6,7研究表明，在静止HSC向肌纤维母细胞HSC的培养相关转变过程中，ECAD和其他上皮标记物下调，而间充质标记物增强。⁷刺猬和ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物（Rac）信号可能调节HSC的EMT。^7,8然而，没有关于ECAD在抑制HSC激活方面的重要性的信息。我们的结果表明异位ECAD表达阻止HSC激活。因此，ECAD的缺乏可能促进HSC的激活或运动。有时，在不改变ECAD表达的情况下增加NCAD的表达称为钙粘蛋白转换。在一项研究中，¹⁸上皮细胞运动性增强被认为与NCAD上调有关。因此，HSC的激活可能部分是由于NCAD的表达增加以及ECAD的损失。

除了肝脏的纤维化过程外，钙粘附素转换还参与其他生理和病理条件，如胚胎发育的正常生理、慢性炎症以及癌细胞的侵袭和转移。^1,2在临床研究中，许多上皮源性癌细胞中ECAD的丢失促进了上皮表型向运动性更强、极化程度更低的间充质表型的转化。^1,19一直以来，约40%的肝细胞癌样本中观察到ECAD表达降低。²⁰活化的HSC在肝癌发生过程中充当肝脏特异性周细胞，并可能有助于肿瘤相关ECM的重塑和沉积。¹³由于ECAD丢失与EMT病理过程之间的联系，ECAD信号的分子基础信息可能有助于了解肝细胞癌的发展和进展。

TGF公司β1抑制ECAD的表达并促进以下时序：细胞连接的解体、上皮极性的丧失、细胞骨架重组和细胞-基质粘附重塑。⁹转录因子如蜗牛、扭曲、Slug和Zeb通过与细胞内的特定序列结合来负性调节ECAD的表达ECAD公司这些序列被称为电子盒。这些蛋白参与EMT的病理过程，从而增强ECM的积累。尽管在肝病HSC激活期间，ECAD缺陷或钙粘蛋白转换已被认识到，⁷ECAD在纤维生成中的抑制作用尚未研究。此外，尽管TGF分解和分解细胞-细胞连接的过程众所周知β1、关于ECAD是否对TGF有抑制作用的信息β1个基因表达不可用。我们的结果表明，ECAD阻止了转化生长因子β1基因及其下游基因，而ECAD的丢失会启动它并促进肝纤维化。

肝细胞的持续损伤激活了慢性肝病患者的纤维化机制。成纤维细胞（即肌成纤维细胞）可能来源于肝细胞、胆道上皮细胞、门静脉成纤维细胞或骨髓和HSC的局部间充质细胞。^5,6所有这些细胞的ECAD表达都随着NCAD表达的增加而减少。尽管人们认识到不同钙粘蛋白形式的表达允许选择的细胞群体与其他细胞类型分离，但ECAD本身是否直接影响促纤维生成信号传导尚不清楚。ECAD的细胞内区域包含ctn结合域并调节ctn介导的信号传导。¹我们研究的重要发现是，p120-ctn被鉴定为HSC中RhoA的对接分子。以下观察结果支持这一点：ECAD–Δp120-ctn未能抑制TGF的表达β1及其靶基因，以及p120-ctn的siRNA敲除逆转了ECAD对RhoA活性和Smad3磷酸化的抑制。因此，与ECAD结合的p120-ctn介导的信号通路似乎与转化生长因子β1抑制上皮型细胞。研究还表明，上皮细胞中NCAD的强制表达通过增加降解，导致ECAD的下调，¹⁸这也可能与p120-ctn的功能有关。

p120-ctn稳定钙粘蛋白并影响细胞迁移、形态发生和增殖。²¹因此，p120-ctn的定位改变和表达降低与某些癌症的恶性程度有关。²¹因为钙粘蛋白/p120-ctn复合物调节小GTPase（例如Rho）的活性，^1,17p120-ctn可能抑制某些类型细胞中的RhoA活性。在本研究中，抑制Rho活性可阻止Smad3/2磷酸化和基因反式激活，这与Rho/Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂改善肝纤维化和TGF的发现一致β1表达式。²²此外，我们的数据表明，ECAD对Smad活性的抑制被CA-RhoA逆转，这支持RhoA补充对ECAD的生理重要性。本研究的另一个重要发现是，ECAD介导的RhoA停滞依赖于p120-ctn结合。在其他研究中，激活的HSC显示另一个Rho家族成员Rac1持续激活，而Rac1活性的扰动阻止了表型转换。^8,23

转化生长因子下游信号β1受体激活与主要转录因子（包括Smads）融合。值得注意的是，Smad3和Smad2被TGF差异激活βHSC中1个；在静止的HSC中，TGFβ1受体激活促进Smad2磷酸化，而在转分化HSC中，它促进Smad3磷酸化。²⁴我们的研究结果一致表明，在LX-2细胞（活化的HSC）和MEF中，ECAD激活Smad3的缺失程度大于Smad2。这与Smad3缺陷改善上皮变性和纤维化的观察结果一致。²⁵总的来说，我们的结果表明，ECAD通过在p120-ctn结合域向p120-ctn招募RhoA来抑制Smad3/2磷酸化（即在p120-ctn池中增加非活性RhoA），并且它们提供了有关ECAD如何对抗肝纤维化的重要信息。因此，钙粘蛋白转换导致的ECAD丢失上调TGFβ1及其靶基因。

ECAD还与内皮生长因子（EGF）受体相互作用，通过限制受体的流动性，抑制EGF依赖的信号传导。²⁶激活蛋白1是TGF激活的另一种转录因子复合物β1,¹³它是EGF介导的生物效应所必需的。然而，c-Jun N末端激酶缺陷对活化蛋白1的抑制并不影响Smad3/2磷酸化²⁷; 这两个转录复合物的激活之间没有显示出串扰。因此，ECAD可能阻止一组细胞表面受体的聚集，并抑制受体介导的细胞信号和基因诱导。因为VE-cadherin与细胞表面受体的相互作用也可能有助于TGFβ1信号，²⁸ECAD过度表达和其他钙粘蛋白的抑制可能共同转换细胞信号并阻止EMT过程。

总之，ECAD通过在p120-ctn结合域向p120-ctn募集RhoA来抑制Smad3/2磷酸化，而钙粘蛋白开关导致的ECAD丢失促进TGF的表达β1及其靶基因并促进肝纤维化。我们的结果表明，ECAD的表达与人类肝脏样本中的纤维化严重程度之间存在相互关系，这强化了这一概念。

补充材料

致谢

缩写

脚注

工具书类