调节PKC易位选择性的有效苔藓抑制素类似物的设计、合成和评价

摘要

治疗线索来源于自然、非自然和虚拟来源或受其启发。《自然》杂志的收藏是一个代表38亿年化学进化的图书馆，数量庞大，结构多样，富含有治疗前景的分子(1). 利用生物合成机械的强大功能，例如噬菌体展示，也可以很容易地扩大这个收集范围(2)，工程生物合成(三–5)和合成生物学。补充自然图书馆，全合成图书馆(6,7)与自然界中使用的方法相比，它具有可以从更多不同的键构建方法、原子和构建块集合中衍生出来的显著优势。虚拟库(8,9)提供了第三个全面的线索结构来源，并且仅受联结理论和自我组合结构生成和选择标准的限制。

尽管天然产品已被证明是图书馆线索、传统药物和现代药物的有效来源(10)，它们既没有进化也没有优化以供人类使用。此外，它们往往稀少，过于复杂，无法以实际方式合成，或难以根据需要衍生以优化治疗功能。功能导向合成（FOS）提供了解决这些问题的策略(11). FOS的观点是，天然或非天然化合物的特定功能，无论是治疗、材料、探针、纳米器件、成像剂、诊断、催化剂、导体还是理论上感兴趣的分子，都可以通过合成-信息设计，通过许多甚至简化的结构来实现。由于它适用于治疗导线，FOS基于以下认识：天然产物的性质通常仅由其功能的一个子集决定，通过将这些功能决定特征合并到简化的、因此综合起来更容易访问的结构中，可以重现或改进这种活性。FOS的目标是设计最佳功能和易于合成，该方法的一个吸引人的方面是可以创造性地选择所需的结构、合成、药代动力学和活性目标。从本质上讲，FOS专注于功能，这种方法可以通过设计、多样性导向的合成、生物学导向的合成、转向全合成等来实现。

我们的团队在设计和开发大量简化试剂时采用了这种方法，这些试剂利用结构复杂的天然铅的功能活动。该策略在其他实验室也取得了越来越大的成功(12–16)并与转移全合成的目标和相关概念产生部分共鸣(17,18). FOS的出发点是功能，并且认为功能可以用广泛的设计结构来模拟，因为许多结构类型可以模拟自然产品的形状和电子密度特征。这一观点得到了许多来源的验证，例如，合成β-内酰胺的早期研究。在我们自己的研究中，这种FOS策略的一个早期示例是证明了佛波酯的活性（29步合成）可以通过仅7步即可获得的高度简化的功能类似物进行部分模拟(图1) (19). Bryostatin是这种方法的另一个值得注意的例子，也是本研究的重点。

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图1。

对具有PKC亲和力的佛波酯简化类似物的功能导向合成方法。

苔藓抑制素是由细菌共生体产生的复杂、稀缺的天然产物(20,21)海洋苔藓动物水母据Pettit等人于1970年报道，这种海洋生物的提取物具有抗癌活性(22)但直到1982年，bryostatin 1的结构(图2)是这些提取物的主要活性成分(23). 此后，又有19种苔藓抑制素被描述出来。

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图2。

(左侧)苔藓抑制素1和2的结构和一般模拟设计原则。药效原子为蓝色。构象描述源自晶体结构（bryo 1）或蒙特卡罗MM3构象搜索（模拟1）。为了清楚起见，C20侧链被排除在外（bryo）或被简化为建模效率（模拟1）。(赖特)B环二恶烷类似物的一般合成策略。类似物通过后期酯化/宏观乙酰化偶联协议进行模块化组装。

该家族中研究最彻底的成员是bryostatin 1，它具有与癌症治疗相关的显著甚至独特的生物活性组合，包括调节凋亡功能(24)，逆转多药耐药性(25,26)以及刺激免疫系统(27). 在超过35项I期和II期临床试验中，已经对Bryostatin的抗癌活性进行了研究（参见http://clinicaltrials.gov). 其作为单一药物的疗效因癌症类型而异。最近的研究表明，它可以提高已知溶瘤药物在几种情况下的临床疗效(28–30). 此外，苔藓抑制素或其可调类似物为有希望的癌症免疫治疗方法提供了一个起点(31). 值得注意的是，所需的苔藓抑制素临床剂量非常低(约。50微克/米²); 八周临床治疗周期只需约1毫克。

具有额外临床意义的是，苔藓抑制素在动物模型中增强学习和扩展记忆(32,33)部分归因于其诱导突触发生的能力(34). 这些活动表明苔藓抑制素或更容易获得的设计类似物(35)可以成为治疗阿尔茨海默病的一流临床领导者(36)和其他神经退行性疾病(37). Bryostatin在脑缺血动物模型中也显示出神经保护功能，表明其潜在的用途是将中风的破坏性神经影响降至最低(38). 与前列腺素相似，苔藓抑制素具有特殊的近期意义(39)被发现可以激活潜在的艾滋病病毒库，为根除艾滋病提供了潜在的战略(40).

尽管苔藓抑制素具有巨大的治疗潜力，但其天然丰度较低，阻碍了其研究和临床开发。临床用苔藓ostatin的GMP生产仅提供18g来自14吨属于B.内毒碱(0.00014%) (41). 尽管这种供应足以启动对苔藓抑制素的临床前和临床研究，但经济和环境因素限制了该来源的进一步开发。苔藓抑制素相关同源物的产量也同样低（10^-3到10^-8%) (42)而季节变化又进一步使隔离变得复杂。虽然化学合成提供了供应的可能性，但已发表的临床铅或类似强同系物的合成(K（K）_我<10 nM）到目前为止时间太长（>55步），无法影响成本效益的供应(43–47). 同样，工程生物合成虽然前景看好，但仍处于发展的早期阶段(48). 进一步考虑的是，这些策略共同提供的只是苔藓抑制素或密切相关的衍生物，它们既没有进化也没有优化用于人类治疗。

1986年，我们小组着手解决这两个供应问题和使用FOS策略实现与苔藓抑制素相关的治疗优化目标。Bryostatin的活性由其与几个细胞内靶点的相互作用介导(49)包括PKC依赖于二酰甘油（DAG）的亚型，PKC是一个转导内源性DAG和Ca的激酶家族²⁺信号。依赖DAG的PKC分为常规和新型两类（参见SI附录) (50)：传统PKC（α、βI、βII和γ）需要DAG和Ca²⁺而新型PKC（δ、ϵ、θ和η）仅由DAG激活。

该项目的最初目标是确定苔藓抑制素中有助于其活性的功能群。我们与Pettit和Blumberg小组合作，提出了基于结构-功能分析和计算机结构比较的假设，即在苔藓抑制素的所有可能药效团中，C1-羰基、C19-OH和C26-OH组是控制其与PKC亲和力的有力候选组(51). 该假设得到了化学衍生化研究、天然产物活性比较以及苔藓抑制素与结构无关但具有竞争性的PKC配体（例如DAG和佛波酯衍生物）的系统结构比较的支持。该分析表明，苔藓抑制素的南部或C环区域直接与PKC接触，从而充当其“识别域”(52)北部A环和B环区域作为一个重要的支架元件或“间隔域”，影响苔藓抑制素的药效元件的表达，并可能影响细胞内转运和膜结合。

这个假设导致了包含苔藓抑制素样识别域但结构上简化了间隔域的大环的设计(图2). 1998年，我们报道了根据这些设计原则制备的一系列有效的全合成苔藓(53). 自那以后，我们报道了许多强有力的、可调的苔藓，以模拟物为例1(54). 该化合物对PKC具有良好的亲和力(K（K）_我=3 nM），是数量级比bryostatin对几种人类肿瘤细胞系更有效，并且可以以逐步经济的方式（总共29步）合成，以满足临床需求。Keck及其同事最近的工作进一步证明了这种设计策略的有效性(55–58).

通过简化和精心的脚手架工程设计，实现了阶梯经济；用二氧六环亚结构取代天然产物的B环四氢吡喃基序，可以通过酯化和酸促大反乙酰化，实现适当功能化识别和间隔域元素的温和、模块化结合(图2). 二氧六环取代吡喃在其他目标简化中也有价值(59). 这种聚合片段耦合策略固有的模块性使其非常适合库合成。最近，我们使用一种与力学相关的Prins大环化反应将收敛片段耦合方法扩展到天然B环四氢吡喃支架(60). 到目前为止，我们已经开发了一个由100多种苔藓植物组成的文库，其中30多种在PKC亲和力或体外测定中表现出个位数的纳摩尔或亚纳摩尔活性(61,62). 这些药剂中最有前途的（例如。，1)目前正在进行用于癌症治疗的临床前研究(63)、阿尔茨海默病(35)以及潜在的HIV激活。

由于PKC在从凋亡到认知的众多生物过程中发挥着作用，因此一个非常重要的新兴目标是了解在控制功能亚型选择性的同时是否可以保持类似物亲和力。虽然在某些情况下PKC亚型在功能上是多余的，但每个亚型都具有独特的作用(64); 因此，同型选择性在优化药物以实现预期功能，同时针对不需要的活性或毒性进行设计方面可能很重要。虽然已经开发出一些亚型或类选择性PKC抑制剂(65,66)，靶向人类激肽组高度保守的ATP结合位点。一种有希望的对异构体选择性PKC调控的补充方法是干扰或模拟参与特定PKC亚型激活和定位的蛋白质与蛋白质相互作用(67). 然而，PKC C1调节域的选择性调节剂的普遍缺乏可能导致功能的获得和丧失，减缓了对该信号通路及其临床影响的研究(68).

如本文所述，系统功能化A环类似物的设计、合成和生物评价4–6为了更好地理解A环功能性和PKC亚型选择性之间的关系，我们进行了研究。我们发现，与去甲基类似物相比，纳入这些类似物的C8-双核二甲基单元增强了它们的效力2和三此外，我们发现这些试剂的A环基序调节了其对代表性PKC亚型的功能选择性，为基于易位动力学开发更具选择性的试剂提供了强有力的先导。

结果和讨论

间隔区结构影响传统PKC活性。

作为本研究的参考点，我们使用先前描述的方案进行了测量(69,70)，天然苔藓蛋白和合成类似物的能力1在CHO-k1细胞中转移具有代表性的传统和新型PKC亚型的GFP融合构建物。该分析依赖于PKC激活和亚细胞定位之间的机制联系：失活的PKC主要位于细胞溶质中，当被苔藓抑制素或其他C1结构域调节剂激活时，会移位到细胞膜(50). 通过亚细胞荧光强度的变化实时测量合成试剂诱导PKC活化的速率和程度，并直接观察活化激酶的定位。此外，通过比较我们的试剂对不同PKC-GFP亚型的相对活性，初步研究了亚型选择性。在本研究中，我们分别使用PKCβ1-GFP和PKCδ-GFP作为代表性的传统亚型和新亚型。

根据文献报道，在200 nM的浓度下，苔藓抑制素1可诱导PKCβ1和PKCδ的快速移位(图3). 不同亚型之间的易位动力学和程度无法区分，治疗几分钟后激活完成。这两种亚型的主要定位是细胞膜。合成模拟1在200 nM时，PKCδ的激活能力与bryostatin 1相似；然而，与天然产物相比，其转运PKCβ1的能力减弱(图3,G公司–我). 的活动1在2000 nM时，与在200 nM时获得的结果几乎没有区别（参见SI附录).

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图3。

(A类–C类)β1-GFP在瞬时转染CHO-k1细胞中的转运(A类)预处理(B类)给药后5分钟，以及(C类)给药后38分钟。(D类–F类)PKCδ-GFP通过200 nM bryo 1在相同时间点的移位。(G公司–我)PKCβ1-GFP，200 nM类似物1，相同的时间点。(J型–L（左）)PKCβ1-GFP，200 nM bryostatin 2，相同时间点。请参阅图6 A类和B类用于量化和时间进程分析。

苔藓抑制素1及其类似物的差异易位活性1在NIH 3T3小鼠成纤维细胞中也观察到传统PKC(71). 在这个系统中，传统的PKCα亚型和新型亚型PKCδ和ϵ的细胞定位通过Western blot评估，以响应与100 nM bryostatin 1或类似物的孵育1结果表示为细胞溶质PKC与膜结合PKC的比值。Bryostatin 1及其类似物1在该系统中表现出激活新型PKC亚型的相同能力；与任一试剂培养5分钟后，观察到PKCδ和PKCϵ的完全膜结合(图4 A类和B类). 镜像PKC-GFP观察结果，模拟1表现出激活传统PKCα同型的能力减弱。然而，苔藓抑制素1诱导了这种亚型的完全膜结合，类似物1培养30分钟后，仅诱导39±4%的易位。对于较长的培养时间，也观察到了这些选择性；bryostatin 1及其类似物1显著占有(ρ=0.0057）下调内源性PKCα的不同能力(图4 C类和D类)，下调是PKC长期激活后的一种典型现象(50). 在与200 nM bryostatin 1孵育24小时后，大多数内源性PKCα被降解；然而，在类似的模拟物暴露后，73±11%的PKCα仍然存在1.

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图4。

(A类和B类)与100-nM试验化合物孵育后NIH 3T3成纤维细胞内源性PKC易位的带密度分析。结果是两到四个实验的平均值；误差条表示SEM(C类)与200-nM试验化合物孵育24小时后，NIH 3T3成纤维细胞中的内源性PKC相对于对照组残留。(D类)24小时降解研究的代表性实验。

作为bryostatin 1和类似物1具有相似的PKC亲和力，这些综合结果表明，在不牺牲整体效价的情况下，可以实现对新型PKC亚型的功能选择性。其他合成类似物也观察到类似结果(72). 在结构上，作为bryostatin 1和类似物的识别域元件1非常相似，我们考虑了这些差异活动的基础包含在间隔域功能中的可能性。

与这一假设相关的是，我们发现bryostatin 2，它具有类似的效力（PKCK（K）_我=5.9 nM）到苔藓抑制素1，仅由于缺乏C7-醋酸盐基团而在结构上有所不同，在200 nM时无法激活CHO-k1细胞中的PKCβ1-GFP(图3). 这一发现暗示了A环区域，特别是C7位置，是传统PKC活性的结构贡献者，因此整体PKC选择性。

模拟设计与合成。

为了初步研究C7功能对PKC选择性的影响，我们最近制备了简化的C7-OAc和C7-OH苔藓2和三(图2) (73). 尽管C7 OAc模拟2(K（K）_我=13 nM）对PKC、C7-OH类似物具有良好的亲和力三(K（K）_我=1000 nM）的效力低于bryostatin 2。由于苔藓抑制素2在新型异型选择性PKC激活剂的开发中起着重要的领导作用，我们被要求确定哪些结构特征可能导致这种效力差异。我们推断C8-宝石天然产物中的二甲基部分可能减轻其C7-OH部分对效力的有害影响。因此，我们设计了C8宝石-二甲基苔藓4–6验证这一假设，并进一步探讨A环功能对PKC亲和力和选择性的作用。C7-OAc和C7-OH类似物4和5旨在探讨C7功能性对PKC选择性的影响，以及C7-脱氧类似物6准备分析C8的任何个人贡献-宝石二甲基部分。

我们探讨了类似物的合成4–6通过普通A环内酯8(图5)，它派生自宝石-二甲基酮9和已知的醛10（请参见SI附录). 这些伙伴之间的非对映选择性羟醛反应优先生成羟基酮11虽然1,3-反对的使用烯醇酸锂，该反应的非对映选择性较差（1.5∶1）9环己基硼烯醇化物的非对映体比率提高（3∶1）。这个反对的∶同步器使用异菌根苯甲酰硼配体进一步将比率提高到9∶1。在5克的范围内，该过程提供羟基酮11分离产率为64%。与我一起减少₄国家卫生局（OAc）_三(74)以精致的方式进行反对的提供二醇的选择性12再结晶后屈服85%。酸驱动的内酯化使生成的二醇基序发生分化，从而形成结晶羟基内酯8该常见中间体被甲硅烷基化用于合成C7氧基类似物4和5或者，脱氧生成内酯14分两步进行，91%的产率可用于C7-脱氧模拟6.

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图5。

(A类)用于模拟合成的间隔域合成。试剂和条件：（a）酮9，（+）-Ipc₂BCl等_三N、 等₂O、 0°C，然后10，-98°C，然后是H₂O（运行）₂，MeOH，pH 7缓冲液，90∶10 d.r.，64%分离11; （b） 我₄国家卫生局（OAc）_三，1∶1 HOAc∶MeCN，-15℃，重结晶收率85%；（c） （±）-CSA，PhH，回流，90%再结晶收率；（d） 何时X（X）=OTBS:TBS-OTf、2,6-联苯胺、CH₂氯₂; 什么时候X（X）=高度：(我)我₂CS、CH₂氯₂, (ii（ii）)布_三SnH、AIBN和PhCH_三110°C；（e） 乙酰乙酸乙酯，LDA，THF，-78°C；（f） TFA等_三瑞士SiH₂氯₂; （g） Ru[（R）-BINAP]氯₂（2 mol%），EtOH，H₂（78巴），35–40摄氏度；（h） 利波黑₄，THF，（i）2,2-二甲氧基丙烷，PPTS，DMF；（j） 萘化锂（THF）；（k） TEMPO（目录）、NaClO（目录）和NaClO₂，MeCN，pH 7缓冲液。(B类)完成苔藓4–6试剂和条件：（l）2,4,6-三氯苯甲酰氯，Et_三N、 菲律宾中央银行_三，然后7DMAP；（m） HF·吡啶、THF；（n） TESCl、DMAP、CH₂氯₂，然后是Ac₂O；（o） HF·吡啶，THF。

内酯13和14两者都清洁地使乙酰乙酸乙酯的二烯酸酯烷基化。C9-内酯产品用TFA和Et脱氧_三SiH提供吡喃15和1650%和51%的产量分别经过两个步骤。用[（R）-BINAP]RuCl进行Noyori氢化₂相应的羟基酯具有良好的非对映选择性（>95∶5）。使用LiBH进一步减少了这些产品₄并作为丙酮保护17和18总产量优良。脱苄和氧化提供完整的羧酸间隔区片段19和20.

间隔域的高度收敛耦合19和20到前面描述的识别域7(54)使用山口的酯化反应完成(图5B类). 用HF·吡啶处理所得产物，在随后的一个步骤中，去除所有硅烷保护基团并进行宏观乙酰化反应，以获得类似于苔藓抑制素2的C7-OH类似物4和C7-脱氧模拟6在65%和83%的条件下，两个步骤的产率分别为。模拟4很容易转化为类似于苔藓抑制素1的C7-OAc类似物5通过C26的原位甲硅烷基化，随后C7的酰化和随后的脱硅。

模拟PKC亲和力和选择性。

抄送8-宝石二甲基苔藓4,5、和6是鼠脑PKC同工酶混合物的有效配体(75)，使用K（K）_我分别为19 nM、2.0 nM和1.4 nM。与相比时des（目标）-甲基类似物1–3，C8-二甲基部分增强了具有极性C7官能团的类似物的PKC亲和力。C7-OAc模拟5是其效力的6.5倍des（目标）-甲基类似物2(K（K）_我=13 nM）。更引人注目的是，C7-OH模拟4是50倍比des（目标）-甲基类似物三(K（K）_我=1000nM）。这种亲和力增强在C7-脱氧序列中较少；二甲基类似物的效力6和模拟1非常相似。两者之间巨大效力差异的来源三和4尚待完全阐明，但一种可能的解释是，空间要求的C8-二甲基部分部分地去溶剂化邻近的C7-OH，减少与蛋白质结合和/或膜结合相关的惩罚。

PKC-GFP易位分析表明，C7修饰影响PKC亚型的功能选择性。如上所述，在CHO-k1细胞中测量类似物激活PKCδ-GFP和PKCβ1-GFP的能力。类比4,5、和6诱导新PKCδ的显著激活(图6A类)200 nM时。细胞液中的荧光转位立即被诱导，并持续了38分钟的观察期。这种亚型的主要定位是细胞膜，尽管也观察到一些细胞内的分隔(图6,我–K（K）).

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图6。

(A类和B类)易位研究中的正常细胞溶质荧光读数。细胞在2.5分钟时给药。胞浆荧光降低表明PKC激活。(C类–O（运行）)细胞PKC-GFP易位分析的典型共焦图像。(C类–E类,F类–H（H）、和L（左）–N个)PKCβ1移位200 nM5,6，或4分别在给药后0、5和38分钟。(我–K（K）)PKCδ移位200 nM4在相同的时间点。(O（运行）)200 nM初始处理后PKCβ1由200 nM bryo 1移位4.

另一方面，合成苔藓4–6差异激活了传统的PKCβ1亚型。最引人注目的是，与其激活PKCδ、C7-OH模拟物的能力相比4在200-nM浓度下，仅诱导PKCβ1的最小易位(图6,B类和L（左）–N个). 因此，在治疗相关浓度下4显示了新型PKCδ亚型相对于传统PKCβ1亚型的功能选择性。孵育后4200 nM的bryostatin 1可诱导PKCβ1的易位(图6O（运行）)表明在这些实验中存在反应性激酶。

相反，C7-OAc模拟5和C7-脱氧模拟6在200 nM时能够激活PKCβ1(图6,B类和C类–H（H）); 然而，相对于苔藓抑制素1，这些药物的活性减弱。观察到的这些试剂对新型PKCδ的选择性与观察到的类似1。与1，剂量增加10倍5或6没有显著增强PKCβ1活性（参见SI附录).

这些综合观察结果表明，苔藓抑制素及其类似物的A环调节这些药物对传统PKC的活性。我们发现C8-宝石二甲基对于增强C7-OH类似物（例如类似物4); 这一点很重要，因为这些化合物似乎对新型PKC亚型具有高功能选择性。有趣的是，合成类似物1,5、和6能够激活传统的PKC，尽管其激活程度低于bryostatin 1。这种差异有助于苔藓抑制素能够更有效地下调传统的PKCα同工酶(图4). 这些和以前的研究提供了一系列设计的类似物，涵盖了一系列选择性：一些成员模仿苔藓抑制素，而其他成员表现出互补性选择性。因此，天然产物及其合成类似物构成了一套有价值的工具，用于探索所需的生物功能与PKC家族成员的选择性调节、激活和下调之间的关系。

结论

研究的路径从获取信息到理解，再到创造性地利用所得知识来生产解决方案和产品。后续功能的筛选结构提供了沿此路径的入口点，当结构引线有限或不存在时，通常需要该入口点。天然产品通常提供更高级的切入点，因为人们通常知道其活动（功能）。然而，许多药物太稀少或太复杂，无法进行合成和调整以用于研究或临床进展。如上所述，这些问题可以通过FOS战略部分解决。在许多情况下，只需要自然结构的一部分即可实现后续功能。因此，对这种结构-功能依赖性的了解可以用于设计具有可比或优越活性的更简单化合物，这些化合物可以以实用、逐步经济的方式合成。

上述研究表明，可以制备简化的苔藓抑制素类似物，其效力与天然产物相当或优于天然产物。此外，这些药物表现出与天然产物相当或互补的PKC选择性。这些类似物的合成比已发表的高效天然产物同源物的合成短25步。尽管随着越来越多的逐步经济合成苔藓抑制素的报道，这一差距无疑将缩小，但简化类似物的使用也将得到改善。考虑到苔藓抑制素和苔藓原木的可比效力，领导类似物的合成路线1包括29个步骤，现在可以用于临床研究。重要的是，这些研究允许快速获得设计的可调类似物，并有机会研究其丰富的化学生物学、靶激活的选择性以及与癌症、阿尔茨海默病和HIV根除相关的治疗潜力。

材料和方法

所有以前未描述的化合物的合成程序和化合物表征数据，以及PKC亲和力、活化、移位和降解分析的实验协议，可在SI附录.

补充材料

致谢。

脚注

工具书类