Toll-like Receptor 3 Is Required for Development of Retinopathy Caused by Impaired All-trans-retinal Clearance in Mice

Satomi Shiose; Yu Chen; Kiichiro Okano; Sanhita Roy; Hideo Kohno; Johnny Tang; Eric Pearlman; Tadao Maeda; Krzysztof Palczewski; Akiko Maeda

doi:10.1074/jbc.M111.228551

生物化学杂志。2011年4月29日；286(17): 15543–15555.

2011年3月7日在线发布。数字对象标识：10.1074/jbc。M111.228551号

PMCID公司：项目经理3083179

PMID：21383019

Toll样受体3在受损人群视网膜病变发生中的作用-反式-小鼠视网膜清除率^*

Satomi Shiose公司,^‡ 于晨,^‡ 冈野清一郎,^‡ 萨尼塔·罗伊,^§ Hideo Kohno先生,^‡ 曾冠豪,^§^¶ 埃里克·皮尔曼,^§ 前田忠道,^‡^§ 克日什托夫·帕尔琴夫斯基,^‡,¹和前田昭子^‡,²

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摘要

慢性炎症是许多与年龄相关的神经退行性疾病（包括黄斑变性）的重要组成部分。在这里，我们报道了toll-like receptor 3（TLR3）在缺乏ATP-binding caste transporter 4（ABCA4）和视黄醇脱氢酶8（RDH8）的小鼠的锥状营养不良症（CORD）中的作用，这些蛋白对所有人都至关重要-反式-视网膜中的视网膜清除率。toll样受体信号元件的表达增加和炎症改变在第8路^−/−阿布卡4^−/−通过RNA表达分析。不像3个月大的孩子第8路^−/−阿布卡4^−/−发育CORD的小鼠，6个月大第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠没有表现出异常的视网膜表型。光诱导视网膜变性第三阶段^−/−第8路^−/−抗体4^−/−老鼠比第8路^−/−阿布卡4^−/−在小鼠的光照视网膜中检测到TLR3表达增加了2倍第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠与未照明视网膜的比较。TLR3配体Poly（I-C）导致caspase-8非依赖性细胞凋亡。而poly（I-C）在第8路^−/−阿布卡4^−/−和WT小鼠体内和体外，这在缺乏第三阶段视网膜下间隙的侵袭性巨噬细胞/小胶质细胞要少得多，Muller神经胶质细胞的激活较弱第三阶段^−/−第8路^−/− 阿布卡4^−/−小鼠与第8路^−/−阿布卡4^−/−3个月龄和6个月龄的小鼠，表明TLR3的缺失抑制了视网膜的局部炎症。来自死亡/死亡视网膜细胞的聚（I-C）和内源性产物均诱导NF-κB和IRF3活化。这些发现表明，视网膜退化产生的内源性产物刺激TLR3，从而导致细胞凋亡和视网膜炎症，TLR3的缺失可保护小鼠免受CORD的影响。

关键词：免疫学，视网膜，视网膜代谢，转基因，视觉

介绍

以视杆/视锥光感受器视网膜损伤为特征的动物模型通常用于识别和研究与人类致盲性疾病共有的致病机制。重要的是，视黄醇（视觉）周期缺陷的小鼠需要持续再生视觉生色团，11-顺式-视网膜(1)，已被证明会导致视网膜退化(2,三). 如此严重的圆锥肌营养不良（CORD）^三在缺乏视网膜ATP-结合盒转运体4（ABCA4）和视黄醇脱氢酶8（RDH8）的转基因小鼠中迅速发育，视黄醇循环蛋白参与清除所有-反式-视网膜脱离视网膜(4). 明确地，第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠最初表现为脂褐素积聚、水肿和感光细胞/RPE萎缩，随后出现脉络膜新生血管（CNV），这是人类黄斑变性的标志性特征，以Stargardt病和年龄相关性黄斑变性（AMD）为例。值得注意的是，补体在Bruch膜上的沉积第8路^−/−抗体4^−/−小鼠可能表明与先天免疫有关。不仅如此第8路^−/−阿布卡4^−/−视网膜表型与人类Stargardt病和AMD有许多共同特征，但其突变ABCA4公司据报道，该基因与Stargardt病和AMD易感性有关(5,6).

在过去的十年里，越来越多的证据表明异常免疫反应在AMD中起着重要作用(7–16). 此外，慢性低度炎症可能与其他与年龄相关的疾病有关，包括阿尔茨海默病和心血管疾病(17). 因此，在寻找视网膜变性与Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−我们注意到最近有报道称与类收费受体（TLR）家族相关(18)特别是TLR3(19–21). 最近的研究已经开始探索TLR在视网膜固有免疫和大脑中的作用(22). 人视网膜色素上皮（RPE）细胞表达TLRs，TLR3水平最高(19). 最新研究表明，用合成的dsRNA刺激RPE细胞可以以TLR3依赖的方式诱导IFN-β的分泌，而这些RPE细胞反过来对IFN-β的抗病毒作用有反应。此外，TLR3刺激RPE细胞可诱导多种细胞因子、趋化因子和粘附分子的分泌。合成dsRNA Poly（I-C）通过TLR3诱导人和小鼠RPE细胞凋亡(20,21). 因此，由dsRNA触发的TLR3介导的信号可能在视网膜疾病中发挥作用。这些观察结果导致本研究描述了TLR3在CORD发病机制中的参与第8路^−/− 阿布卡4^−/−老鼠。

在这里，我们研究了TLR3在视网膜病变发展中的作用第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠与第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。我们还通过细胞培养实验研究了dsRNA诱导的RPE凋亡和局部炎症。我们的结果表明，TLR3缺乏可保护视网膜免受年龄相关性和光诱导变性的影响第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。有趣的是，由于所有-反式-视网膜导致TLR3依赖性细胞凋亡和炎症，而-反式-视网膜，与视网膜变性的发病机制有关第8路^−/−抗体4^−/−小鼠未激活TLR3。总之，这些观察结果表明TLR3在致盲性视网膜病变中的激活第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。

实验程序

动物

第8路^−/−阿布卡4^−/−如前所述，产生双敲除小鼠，所有敲除小鼠均通过既定方法进行基因分型(4,23).Tlr3^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−三敲除小鼠是通过杂交产生的第8路^−/−阿布卡4^−/−双敲除小鼠第三阶段^−/−老鼠。第三阶段^−/−小鼠由Shizuo Akira博士（日本大阪大阪大学微生物疾病研究所）提供。用以下引物对这些动物及其后代进行PCR基因分型：WT片段（1 kb）、正向5′-CCAGAGCCTGGAGTAAGTTATTGTGCTG-3′和反向5′-TCCAGAATATTGCCC-3′；KO片段（1 kb），正向5′-TCCAGAATATTGGCAGATTATTCGCCC-3′和反向5′-ATCGCCCTTATCGCCTTCTTGACGAG-3′。仅使用RPE65的氨基酸450具有亮氨酸变异的小鼠。所有小鼠都被安置在凯斯西储大学医学院的动物设施中，在那里它们要么在完全黑暗的环境中，要么在12小时的光照（～10勒克斯）/12小时的暗循环环境中。在通过柯达1号安全灯滤光片（透射率>560 nm）透射的微弱红光下进行黑暗实验操作。所有动物程序和实验均由凯斯西储大学动物护理委员会批准，并符合美国兽医协会安乐死专门委员会和视觉与眼科研究协会的建议。

RNA表达分析

通过RT进行RNA表达分析²SABiosciences（Frederick，MD）提供的Profiler PCR阵列系统。通过RiboPure试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）纯化小鼠眼睛中的总RNA。折叠变化归一化为五个看家基因(表1和和22).

表1

眼部mRNA表达谱分析第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠TLR信号通路中的分子

仅显示大于2的折叠变化。数据被归一化为家政基因(Gusb、Gapdh、Actb、Hprt1、和Hsp90ab1型).

	浅色/深色（6-8个月大）^{^一}		2-4个月大/6-8个月大^{^b条}
	基因	-折叠	基因	-折叠
Toll样受体
	Tlr2号机组	5.58	Tlr2号机组	8.25
	Tlr8号机组	5.07	Tlr5型	7.74
	Tlr5号机组	4.05	第三阶段	4.07
	第三阶段	3.80	Tlr8号机组	3.85
	Tlr4号机组	2.09	Tlr4型	3.04
			Tlr1号机组	2.16
	Tlr6号机组^{^c（c）}	−2.08	Tlr6号机组	−2.06

适配器TLR-相互作用蛋白
	赫拉斯1	6.93	赫拉斯1	8.72
	地图8ip3	6.81	地图8ip3	7.11
	特里夫	5.85	Myd88（Myd88）	5.74
	贝利1	5.05	特里夫	5.73
	Myd88（Myd88）	3.49	贝利1	4.56
	Pglyrp1型	3.37	特拉普县	3.54
	托利普	2.55	有轨电车	3.39
			Pglyrp1型	2.96
			托利普	2.30

效应器
	Traf6公司	14.83	Traf6公司	12.72
	Tnfrsf1a型	11.16	伊拉克2	5.15
	编号2c2	4.30	Ppara公司	4.31
	伊拉克2	3.89	Ube2v1型	4.16
	Ppara公司	3.89	编号2c2	3.74
	Ube2v1型	3.86	地图3k7	2.02
			案例8	2.01

下游途径和靶基因
NF-κB途径	Rela公司	6.65	Tnfrsf1a型	14.16
	Nfrkb公司	5.68	Nfkb2号	6.67
	Tnfaip3型	5.41	Rela公司	6.56
	Ikbkb公司	5.16	Tnfaip3型	6.42
	天花	4.58	Nfk邮箱1	5.64
	Nfkbil1型	3.83	Ikbkb公司	5.49
	Nfkb2号	3.71	Nfrkb公司	4.90
	小时	3.40	伊利12a	4.32
	伊利12a	3.31	血红蛋白	3.28
	Nfkbia公司	2.97	Nfkbia公司	3.02
	Nfkb1号机组	2.56	地图3k1	3
	Il10号机组	2.55	Tnf公司	2.92
	Iffing公司	2.10	Nfkb1号机组	2.83
	相对	2.05	Il10号机组	2.80
			Iffing公司	2.37
			Il1r1号机组	2.19
	伊尔1b	−2.32
JNK/p38通路	福斯	5.68	六月	5.46
	六月	4.50	麋鹿1	3.90
	麋鹿1	4.14	地图8	3.46
	地图9	4.06	地图9	2.88
	地图8	3.05
	地图3k7	2.01
NF/IL6途径	第2部分	5.07	第2部分	3.78
	伊尔6ra	2.59	伊尔6ra	2.47
IRF途径	红外线3	6.74	红外线3	6.20
	红外1	3.71	红外1	4.61
	Tbk1型	3.09	Tbk1型	3.16
	Cxcl10公司	−5.53	Cxcl10公司	−2.62
	Ifnb公司	−2.72

适应性免疫调节
	80加元	2.86	80加元	2.57

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^一第8路^−/−阿布卡4^−/−使用6-8个月大的小鼠。将小鼠置于12小时光照（10勒克斯）/12小时黑暗周期或黑暗环境中。

^b条第8路^−/−阿布卡4^−/−使用2-4月龄或6-8月龄的小鼠。将动物置于12小时光照（10勒克斯）/12小时黑暗周期下。

^c（c）减号和下划线一起表示减少的表达。

表2

C57BL/6J野生型小鼠眼部mRNA表达谱的变化与第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠

体重6–8个月大/体重2–4个月大		DKO/WT（2-4个月龄）^{^一}		DKO/WT（6-8个月龄）^{^一}
基因	-折叠^{^b条}	基因	-折叠^{^c（c）}	基因	-折叠^{^c（c）}
Cxcl10公司	3.08	Ifnb公司	31.42	Ifnb公司	29.35
第三阶段	2.88	Iffing公司	6.31	Cxcl10公司	3.11
特里夫	2.14	Cxcl10公司	3.65

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^一DKO表示双淘汰第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。

^b条显示大于2的折叠变化。数据被归一化为家政基因(Gusb、Gapdh、Actb、Hprt1、和热休克蛋白90ab1).

^c（c）比率大于3倍。Toll样受体的变化不超过3倍。

原代RPE细胞培养

采用已发表的方法从小鼠眼睛中分离出原代小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞(24)进行了中所述的修改补充材料.

超高分辨率光谱域光学相干层析成像（SD-OCT）和扫描激光眼底镜成像（SLO）

超高分辨率SD-OCT（北卡罗来纳州三角研究园区生物肽）和HRAII（德国海德堡工程公司）用于SLO体内小鼠视网膜成像。通过腹腔注射含有氯胺酮（6 mg/ml）和甲苯噻嗪（0.44 mg/ml）的混合物（20μl/g体重），将小鼠麻醉在10 m米磷酸钠，pH 7.2，含100 m米氯化钠。用1%托吡卡胺扩张瞳孔。使用在B扫描模式下获得的四张图片构建每个最终平均的SD-OCT图像。

维甲酸和A2E分析

如前所述，进行了所有与从解剖的小鼠眼睛中提取、衍生和分离类视黄醇有关的实验程序(23). 对于A2E提取，在玻璃/玻璃均质器中用1ml乙腈均质两只眼睛。蒸发溶剂后，将提取物溶于150μl含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈中，然后通过聚四氟乙烯注射器过滤器（美国国家科学公司，宾夕法尼亚州奎克敦）。将样品（100μl）加载到C18柱（Phenomenex，Torrance，CA）上，并使用乙腈/H流动相梯度的正相HPLC进行分析₂O、 100:0和乙腈/H₂O、 80:20，0.1%TFA，持续30分钟。通过与之前所述制备的纯合成A2E的已知浓度进行比较，通过HPLC对A2E进行定量(25).

组织学

采用的组织学和免疫组织化学程序已建立(23). 抗视紫红质1D4抗体是R.S.Molday博士（温哥华不列颠哥伦比亚大学）慷慨赠送的礼物。抗TLR3多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology，抗巨噬细胞抗体CD11b和F4/80购自AbD Serotec（北卡罗来纳州罗利市）。抗-GFAP抗体购自DAKO（丹麦Glostrup）。用于组织学检查的眼镜固定在2%戊二醛、4%多聚甲醛中，并加工成包埋在Epon中。切片切至1μm并用甲苯胺蓝染色(23).

ERG公司

所有ERG程序均采用公布的方法进行(23). 对于单次闪光记录，调整白光闪光刺激的持续时间（从20μs到1 ms），以提供一定范围的照明强度（从−3.7到1.6 log candela·s/m²). 在闪光刺激之间以足够的间隔（从10秒到10分钟）进行三到五次记录，以便从任何光漂白效应中恢复。

鼠标眼底图像

通过使用连接至CCD相机的手术显微镜（Leica M651 MSD，Werzlar，德国）获得视网膜眼底图像。角膜的异常反射被HOYA HHV Dispo型6d透镜（日本东京HOYA）去除。

合成TLR3配体Poly（I-C）诱导RPE细胞死亡

ARPE19细胞和主要RPE细胞来自第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−,第8路^−/−阿布卡4^−/−,Tlr3^−/−,特里夫^−/−，WT小鼠在24孔板中以5×10的密度培养⁴每孔细胞数（60-70%汇合）。RPE细胞与不同浓度（20、50、100和200μg/ml）的聚（I-C）在37°C下共同培养24小时。共同培养后，用Hoechst 33342（AnaSpec Inc.，Fremont，CA）对RPE细胞染色30分钟，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS:137 m）冲洗两次米氯化钠，2.7米米KCl，4.3米米钠₂高性能操作₄，1.4米米千赫₂人事军官₄). 通过在荧光显微镜（Leica DMI 6000系统）下计数细胞核被Hoechst 33342染料密集染色的细胞数量来进行细胞死亡的评估。ARPE19细胞保存在含有10%胎牛血清的培养基中（Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）），含有10%胎牛血清的α-最小必要培养基改良（Invitrogen）用于原代RPE细胞。

视网膜细胞降解产物诱导RPE细胞死亡

Y79细胞（来源于人视网膜母细胞瘤）以1×10的密度接种到24孔板中⁵细胞/孔，500μl DMEM，含10%胎牛血清，用30μl处理米全部-反式-视网膜在37°C下放置16小时，在存在400单位/ml RNase抑制剂（Invitrogen或新英格兰生物实验室）的情况下导致细胞死亡。然后Y79细胞在与所有细胞共同孵育后-反式-视网膜暴露于紫外线（365 nm；UVP公司的8瓦紫外线灯）15分钟，以破坏所有-反式-视网膜和培养上清液，包括降解Y79细胞的产物，通过12500 rpm离心5 min收集。ARPE19细胞（5×10⁴24孔板中的细胞/孔）与产生的上清液在37°C下共同培养24小时，并如上所述量化细胞活力。RNase A（用于单链RNA）、RNase H（用于RNA-DNA复合物）、RN酶III（用于rRNA和dsRNA）和DNase I购自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州伊普斯威奇），苯并酶®购自西格玛。使用20单位/ml的这些核酸酶与降解Y79细胞的产物共同培养。全部-反式-视网膜是从加拿大多伦多研究化学公司（Toronto Research Chemicals，Inc.）获得的。

视网膜下注射Poly（I-C）

所有手术操作均在手术显微镜下进行（徕卡M651 MSD）。通过腹腔注射20μl/g体重的6 mg/ml氯胺酮和0.44 mg/ml木聚嗪（用10 m稀释）来麻醉小鼠米磷酸钠，pH 7.2，含100 m米氯化钠。使用1.0%托吡卡胺眼用液对瞳孔进行扩张（纽约罗切斯特Bausch&Lomb）。使用33 gauge斜面针（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）作为长矛，在角膜缘后1.0 mm处切开巩膜。这被一个连接到注射系统（UMP-II微型注射器泵和带脚踏开关的Micro4控制器，世界精密仪器）的36 gauge斜面针所取代。针对准视网膜下鼻区，将聚（I-C）溶液（Invivogen，1μg/1.0μl PBS）注入视网膜下间隙。通过观察水泡形成，证实给药成功。气泡形成后，针尖在气泡中停留10秒，然后轻轻抽出针头。作为对照，通过相同的程序将生理盐水注入视网膜下间隙。

NF-κB和IRF3报告者分析

将人TLR3 cDNA（pUNO-hTLR3-GFP，Invivogen）转染ARPE19细胞，获得稳定表达hTLR3的ARPE19（hTLR3-ARPE19）细胞。将含有分泌型碱性磷酸酶（pNiFty2-SEAP）（Invivogen）的NF-κB报告质粒或IRF3报告质粒的561-luc转染ARPE19、hTLR3-ARPE19和HEK293细胞（通过我们的RT-PCR方法无法检测到TLR3）和hTLR3-293细胞在与TLR3配体共同孵育前24小时使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。根据制造商的方案，使用HEK-蓝色检测（Invivogen）检测分泌型碱性磷酸酶的生成。使用双荧光素酶报告基因测定系统（Promega，Madison，WI）进行荧光素酶测定。

p65向细胞核的移位

骨髓细胞来源于6-8周龄C57BL/6，第三阶段^−/−,特里夫^−/−和第9天^−/−老鼠。CO实施安乐死后₂将窒息、股骨和胫骨取出，并在4°C下以10000 rpm的转速离心30 s。将颗粒重新悬浮在1 ml无菌红细胞裂解缓冲液（Ebioscience，圣地亚哥）中2–3 min，在室温下以1200 rpm离心细胞5 min，然后使用无菌DMEM清洗一次。将细胞在含有10%FBS和30%L929条件培养基的DMEM中孵育10天，以将其分化为巨噬细胞(26). 生成的单元格（5×10⁴)在24孔板中的无菌盖玻片上培养，并用LPS（100 ng/ml）、poly（I-C）（10μg/ml）或含有降解Y76细胞的上清液（与30μ米全部-反式-视网膜。激活后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。在室温下用0.1%Triton X-100在PBS中渗透固定细胞1分钟，并在含有10%山羊血清的PBS中用兔抗鼠p65（1:100；Ebioscience）在室温下孵育1小时。将盖玻片用PBS洗涤两次，并在室温下与Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG Ab（Invitrogen）在PBS中孵育1小时，用PBS洗涤，并使用具有DAPI的Vectashield安装介质（Vector Laboratories，Peterborough，UK）放置在载玻片上。图像是用连接到Retiga EXI相机的徕卡DMI 6000 B倒置显微镜拍摄的（Q-imaging，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）。

统计分析

通过单向方差分析检验，比较代表至少三个独立实验结果的平均值±S.D.或平均值±S.E.的数据。

结果

Rdh8显示视网膜变性时TLR信号增强^−/−阿布卡4^−/−老鼠

TLR由不同的模式识别受体家族组成，它们识别来自病毒或内源性细胞降解的成分并触发先天免疫反应(18). 为了研究TLR在视网膜退行性变中的可能作用，我们用提取的RNA对涉及TLR信号传导的84个基因和5个看家基因进行了表达分析第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠的眼睛。视网膜变性发展为CORD第8路^−/− 阿布卡4^−/−在6周龄和3个月龄时变得明显的小鼠第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠的下视网膜广泛变性(4). 最终，一些第8路^−/− 阿布卡4^−/−小鼠在6个月或更大时出现CNV。如果第8路^−/−抗体4^−/−老鼠被关在黑暗中。在这项研究中，Tlr公司-在6-8个月大的视网膜中评估相关mRNA的表达第8路^−/− 阿布卡4^−/−在常规实验室照明条件下（光照）或黑暗条件下（黑暗）饲养的小鼠，比较退化视网膜和非退化视网膜，以及2-4个月龄和6-8个月龄的幼鼠第8路^−/−阿布卡4^−/−将小鼠置于常规实验室光照下，以对比早期退化的视网膜和以CNV为特征的更严重退化的视网膜(表1). 有趣的是，与TLR信号相关的mRNA编码分子的表达水平，包括TLR本身，在光保存的视网膜中高于暗保存的视网膜第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠和小老鼠第8路^−/− 抗体4^−/−与年龄较大的小鼠相比，这些mRNA的表达更高第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。在配体结合后，TLR将细胞内Toll/IL-1受体（TIR）结构域的特异性结合招募到TIR区域。这些包括髓系分化主要反应基因88(我的D88)、含TIR的衔接蛋白、含TIR-域的衔接蛋白诱导干扰素-β（TRIF）/TIR域的衔接分子1（TICAM1）和TRIF-相关衔接分子（TRAM）/TICAM2(27).表1显示，编码这些适配器的mRNA在年轻人和老年人的视网膜中的表达增加第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。在这些小鼠中还检测到TLR效应器（包括TRAF6）和下游靶点（如NF-κB、MAPK和IRF3）的mRNA表达升高。这些数据强烈表明TLR参与了CORD的病理过程第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。此外，在WT小鼠中也发现了CXCL10趋化因子、TLR3和TRIF表达升高的年龄相关性炎症(表2).

Rdh8中TLRs的表达^−/−阿布卡4^−/−视网膜，初级培养Rdh8^−/−阿布卡4^−/−RPE和ARPE19单元

确定TLR是否(Tlr2号机组,第三阶段,Tlr4型,Tlr5号机组、和Tlr8号机组)在全眼阵列分析中发现表达增加后，在视网膜/RPE中表达(表1)，我们对来自4周龄的全眼、视网膜剥离物和原代培养RPE细胞的RNA进行了RT-PCR第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。RT-PCR显示视网膜（包括RPE）、全眼和原代培养的RPE细胞第8路^−/−抗体4^−/−小鼠表达了所有这些Tlrs公司(补充表S1). RPE和光感受器特异性蛋白RPE65和视紫红质的RT-PCR表明，原代培养的RPE细胞没有受到光感受者的污染。如前所述，随后通过RT-PCR检测ARPE19细胞中TLR3和TLR4的表达(19,28).

TLR3的缺失可保护Rdh8的视网膜变性^−/−阿布卡4^−/−老鼠

第8路^−/−阿布卡4^−/−到3个月大时，小鼠出现视网膜变性，视杆细胞外节厚度减少，视紫红质定位错误，视锥细胞丢失，这些变化在6个月大的时候更为严重第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠，证实这些小鼠表现出如先前报道的进行性视网膜变性(图1一) (4). 相反，第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−6个月大的老鼠没有表现出明显的视网膜损伤，类似于第三阶段^−/−或WT小鼠。ERG显示a波和b波振幅降低第8路^−/−阿布卡4^−/−6个月龄的小鼠与同龄的WT小鼠相比，但在6个月大的小鼠之间未检测到显著变化第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠和WT小鼠(图1B类). 这些数据表明，TLR3的缺失可以保护患者免受年龄相关性视网膜变性的影响Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−老鼠。

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图1。

删除第三阶段防止视网膜退化第8路^−/−抗体4^−/−老鼠。 一，在第三阶段^−/− 第8路^−/−阿布卡4^−/−,Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−,第三阶段^−/−和3个月龄和6个月龄的WT小鼠(米). 用抗视紫红质抗体对3月龄小鼠的冷冻切片进行染色(红色)、花生凝集素凝集素(绿色)，和4′-6-二氨基-2-苯基吲哚(蓝色) (顶部面板). 还显示了3个月和6个月大小鼠的Epon-prepared视网膜(中间的和下部面板). 视网膜明显变性，视紫红质定位错误第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠，而其他小鼠没有表现出明显的视网膜损伤。酒吧指示10μm。操作系统，外段；是，内段；ONL公司，外核层；印度卢比，内核层；零售物价指数，视网膜色素上皮；OPL公司外丛状层；IPL公司，内丛状层。B类，WT的全场ERG响应，Tlr3^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−、和第8路^−/−阿布卡4^−/−6个月大的小鼠。在暗视条件下记录ERG反应。两者a-(左边)和b-(正确的)作为光强函数绘制的波幅在6个月大的婴儿中显著减弱第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠与第三阶段^−/−第8路^−/−抗体4^−/−和野生动物。酒吧注明平均值的S.E(n个> 6; *,第页< 0.01),第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠与Tlr3相比^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−动物。光盘坎德拉。

TLR3的缺失保护视网膜免受光诱导急性变性的影响

除了出现与年龄相关的视网膜变性，显示CORD，第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠在强光照射后出现急性视网膜变性。为了研究TLR3在光诱导急性视网膜变性中的作用，我们第8路^−/−阿布卡4^−/−和第三阶段^−/−第8路^−/− 阿布卡4^−/−用10000勒克斯的光照小鼠15、30和60分钟。因为俄亥俄州克利夫兰外阳光的强度达到80000勒克斯以上，所以这里使用的强度很强，但仍然是生理强度。Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−暴露15分钟后，小鼠表现出明显的视网膜损伤（数据未显示）(29)30分钟的光照破坏了视网膜中央约50%的感光细胞(图2一). 相反，第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠表现出严重的视网膜变性，类似于第8路^−/−抗体4^−/−小鼠只在暴露60分钟后。一直以来，我们在第三阶段^−/−第8路^−/− 阿布卡4^−/−通过SLO检测小鼠，而在第8路^−/−阿布卡4^−/−光照30分钟后的小鼠，这种暴露未能导致WT小鼠的视网膜退化(图2B类). 两组患者的视网膜下自体荧光斑点数量均增加第三阶段^−/−第8路^−/− 阿布卡4^−/−和第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠暴露在60分钟的光照下（数据未显示）。因为在年龄相关性视网膜变性的发展过程中，TLR的表达升高第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠(表1)采用常规RT-PCR和定量PCR（qPCR）检测TLR3的表达。第8路^−/−阿布卡4^−/−用10000勒克斯照射小鼠60分钟，并迅速收集其视网膜，因为照射后感光细胞的损失并不明显。事实上，视网膜的凋亡和死亡/死亡细胞的清除过程需要5-7天的时间(29). 传统RT-PCR显示，与非照明视网膜相比，照明视网膜中TLR3的表达增加(图2C类). qPCR随后证实，光照视网膜的TLR3表达比非光照视网膜增加2倍。

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图2。

Tlr3缺失可保护视网膜免受光诱导的急性退化。 第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−,第8路^−/−阿布卡4^−/−和4周龄的WT小鼠分别暴露于10000 lux光照下30和60分钟，然后在进行SLO和组织学检查时在黑暗中放置7天。一，外核层厚度(ONL公司)如图所示。ONH公司，视神经头。误差线注明平均值的S.D(n个> 3). 年观察到严重的视网膜变性第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠在强光照射30分钟后，但在第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−和WT视网膜。然而，两组患者都出现了严重的光诱导视网膜变性第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠和第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠暴露在强光下60分钟后。B、上部面板，显示了30分钟光照小鼠的视网膜组织学。零售物价指数，视网膜色素上皮；操作系统，外段；是，内段；ONL公司，外核层；OPL公司外丛状层；印度卢比，内核层。酒吧表示20μm。下部面板，给出了4周龄小鼠在10000勒克斯光照射30分钟后7天通过SLO获得的具有代表性的视网膜外侧图像。照明中可见大量自荧光沉积物第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠缺席第三阶段^−/−第8路^−/−抗体4^−/−和WT小鼠。C类，RT-PCR用于第三阶段和aGapdh公司照明与非照明视网膜的内部控制第8路^−/−抗体4^−/−展示的是老鼠。的表达式第三阶段强光照射后增加。

TLR3-活化配体在体外引起RPE细胞死亡

接下来我们研究了TLR3在光感受器/RPE细胞死亡中的作用。我们的理论基础包括TLR3多态性中所报道的AMD的差异易感性(20)，RPE中TLR3表达显著(19)和TLR3诱导的视网膜细胞死亡(20,21)以及我们自己的发现，在年长的WT小鼠和第8路^−/− 阿布卡4^−/−视网膜变性小鼠(表1)和消融第三阶段防止视网膜变性第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠(图1和和22).

表达TLR3的ARPE19细胞与不同浓度的TLR3活化配体聚（I-C）共同孵育24小时，然后用Hoechst 33342染色细胞以评估细胞凋亡。有趣的是，越来越多的细胞显示出染色质凝集，且呈剂量依赖性(图3,一和B类). 免疫印迹法检测caspase-8、p53和Bax的表达，因为已有报道称caspase-8/TLR3依赖性凋亡细胞死亡(30). 令人惊讶的是，免疫印迹没有在ARPE19细胞中发现任何caspase-8。Bax表达升高表明poly（I-C）诱导ARPE19细胞中Bax依赖性但胱天蛋白酶-8非依赖性的凋亡。据报道，HEK293细胞显示多聚（I-C）诱导的caspase-8激活（caspase-8全长断裂）(补充图S1).

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图3。

聚（I-C）诱导ARPE19细胞和原代培养RPE细胞死亡第8路^−/−阿布卡4^−/−和WT小鼠，但不是来自第三阶段^−/−Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−,第三阶段^−/−，或特里夫^−/−老鼠。一将ARPE19细胞（人RPE）与TLR3配体poly（I-C）在0、50、100和200μg/ml的浓度下孵育24 h，然后用Hoechst 33342对细胞进行染色。显示了代表性的ARPE19细胞图像。凋亡细胞显示染色质凝集。B类，染色质浓缩细胞数/mm²被计算在内。Poly（I-C）以剂量依赖性方式导致ARPE19细胞死亡。误差线注明平均值的S.D(n个> 3).C类，从6周龄婴儿中分离出原代RPE细胞第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−,第8路^−/−阿布卡4^−/−,第三阶段^−/−,特里夫^−/−和WT小鼠，如“实验程序”所述。RPE细胞在培养8天后的典型图像如插图。数字用Hoechst 33342/mm染色的染色质浓缩细胞²被计算在内。在RPE细胞中观察到聚（I-C）诱导的细胞死亡Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−和WT小鼠在37°C共同孵育24小时后，而在来自Tlr3^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−和第三阶段^−/−老鼠(第页<0.001，聚（I-C）为100μg/ml）。RPE来自特里夫^−/−小鼠表现出一些聚（I-C）诱导的细胞死亡，但其数量远低于WT小鼠(第页在100μg/ml时<0.001）。误差线注明平均值的S.D(n个> 3).

为了进一步表征TLR3配体多聚体（I-C）诱导的TLR3依赖性RPE细胞死亡，首次从第三阶段^−/−Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−,第8路^−/− 阿布卡4^−/−,第三阶段^−/−和WT小鼠，然后将聚（I-C）混合到细胞培养基中。正如预期的那样，在来自第8路^−/−阿布卡4^−/−和WT小鼠，但不是来自第三阶段^−/−第8路^−/− 阿布卡4^−/−或第三阶段^−/−老鼠(图3C类). 这些数据提供了人工dsRNA poly（I-C）激活TLR3可以诱导RPE细胞凋亡的证据。此外，主要RPE来自特里夫^−/−小鼠表现出明显较少的聚（I-C）诱导的细胞死亡，表明TLR3和TRIF也参与了这种细胞死亡的产生。

视网膜下注射聚（I-C）诱导小鼠视网膜变性

由于poly（I-C）以TLR3依赖的方式导致小鼠ARPE19细胞和原代培养的RPE细胞死亡，因此将poly（I-C）（PBS中1μl的1μg/μl）注射到8周龄WT的视网膜下，第三阶段^−/−、和特里夫^−/−研究TLR3依赖性事件的小鼠体内注射后1、2和4周通过光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）检查视网膜形态。大多数接受治疗的眼睛在注射后1-2周内发生视网膜下注射导致的视网膜脱离(补充图S2一). 重要的是，在多聚体（I-C）注射的WT视网膜中可以看到广泛的严重视网膜变性，而在注射部位只观察到由针头损伤引起的局部变性第三阶段^−/−和特里夫^−/−小鼠注射后4周(图4一和补充图S2). 注射载体（PBS）只产生局部视网膜损伤，与注射聚（I-C）类似第三阶段^−/−和特里夫^−/−视网膜。此外，在多聚体（I-C）注射WT视网膜的眼底图像中，普遍存在视网膜萎缩(图4B类). 这些结果提供了poly（I-C）通过TLR3/TRIF导致视网膜变性的证据体内并且该途径参与了小鼠某些类型视网膜变性的进展。

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图4。

聚（I-C）诱导WT视网膜变性。将聚（I-C）（1μl，PBS中1μg/μl）注入8周龄WT的视网膜下间隙，第三阶段^−/−、和特里夫^−/−老鼠。注射后第0-3天，对注射了聚（I-C）或PBS的眼睛使用不含抗炎药的抗生素滴眼液。一视网膜广泛受损，外核丢失(ONL公司)SD-OCT显示WT小鼠的光感受器层，而在第三阶段^−/−或特里夫^−/−小鼠注射后4周。B类术后4周，用连接CCD相机的手术显微镜（徕卡M651 MSD）采集眼底图像。用HOYA HHV Dispo型6d透镜去除角膜的异常反射。聚乙烯（I-C）注射WT眼出现萎缩性改变粉红色与PBS注射WT视网膜相比，着色。萎缩变化的区域由黄色箭头.

TLR3级^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠自身荧光视网膜下巨噬细胞/小胶质细胞数量减少，视网膜炎症反应减弱

越来越多的证据表明，自荧光视网膜下巨噬细胞和小胶质细胞在衰老和光诱导视网膜变性过程中积累(31–33). 在这里，我们用SLO检查了视网膜中的这些细胞。尽管两组中的自荧光斑点都随着年龄的增长而增加第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−和第8路^−/− 阿布卡4^−/−老鼠，第三阶段^−/−第8路^−/−抗体4^−/−小鼠自身荧光斑点明显减少(图5,一和B类). 在6个月大的婴儿中检测到较少的自体荧光斑点第三阶段^−/−以及WT小鼠。这些斑点的出现是在相似的年龄或视网膜退化开始之前发现的。年龄相关性视网膜变性第8路^−/− 阿布卡4^−/−老鼠只出现在下视网膜(4)这表明大多数散布在整个视网膜上的自荧光斑点与视网膜结构恶化无关。组织学分析发现视网膜下细胞数量增加(补充图S3一)这些细胞抗巨噬细胞/小胶质细胞抗体（Ab）阳性，如抗F4/80 Ab和抗CD11b Ab(补充图S3B类). 这些数据表明，SLO检测到的自体荧光点代表巨噬细胞/小胶质细胞，它们已经迁移到感光细胞和RPE之间的空间，TLR3的缺乏会延迟这些细胞在视网膜中的转运第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。这些自荧光斑点也在光照后观察到第8路^−/− 阿布卡4^−/−老鼠(图2B类). 在第三阶段^−/−Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−和第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠比在Tlr3^−/−3个月龄和6个月龄的WT小鼠与RPE中A2E自身荧光沉积量密切相关(补充图S4). 由于进入视网膜下间隙的巨噬细胞/小胶质细胞数量增加表明局部免疫激活，因此还通过检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）来评估视网膜的炎症反应，这表明Muller细胞的反应性胶质增生反映了视网膜炎症(34). 3个月大的Muller细胞第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠全身显示GFAP免疫反应，而在第三阶段^−/−Rdh8型^−/− 阿布卡4^−/−,第三阶段^−/−和同龄的WT小鼠(图5C类和补充图S3C类). 这种胶质增生也见于Rdh8型^−/−阿布卡4^−/−小鼠（数据未显示）。这些数据表明老年人的整个视网膜存在炎症变化第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠和TLR3的丢失阻止了这些变化。

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图5。

第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠自身荧光视网膜下巨噬细胞/小胶质细胞数量减少，Muller胶质细胞激活较弱。SLO视网膜图像取自3个月和6个月大的婴儿第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−,第8路^−/−阿布卡4^−/−,第三阶段^−/−、和WT小鼠(一)，并显示已识别荧光点的数量(B类). 3个月大时出现自体荧光斑点第8路^−/−抗体4^−/−小鼠，在6个月大的时候发现数量要多得多第8路^−/−阿布卡4^−/−动物。然而，第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠显示的这些斑点远远少于第8路^−/−抗体4^−/−老鼠。6个月大的Epon-prepared组织切片第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠表现出迁移的巨噬细胞/小胶质细胞(黄色箭头)在视网膜下部光感受器和视网膜色素上皮之间(B、插入).操作系统，外段；是，内段；ONL公司，外核层。酒吧表示10μm。C类，检测GFAP的表达第8路^−/−阿布卡4^−/−和第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−视网膜。用抗GFAP抗体对3个月龄小鼠的下视网膜冷冻切片进行染色(红色)和DAPI(蓝色). 3个月大的Muller细胞第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠全身显示GFAP免疫反应，而在第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。公共关系光感受器；ONL公司，外核层；OPL公司外丛状层；印度卢比，内核层；IPL公司内丛状层；GCL公司神经节细胞层。酒吧表示10μm。

暴露于全反式激活TLR3的死亡/死亡细胞的内源性成分

因为视网膜色素上皮细胞损伤在黄斑变性中有很好的记录，而且视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍/死亡可由所有视网膜的延迟清除引起-反式-视网膜内第8路^−/−阿布卡4^−/−接下来，我们确定死亡的光感受器是否为RPE破坏提供内源性TLR3活化配体。Y79人视网膜母细胞瘤细胞（1×10⁵)首先与所有人一起孵化-反式-视网膜（30μ米)在RNase抑制剂存在下放置16 h，并用紫外线照射15 min，然后将含有受损/死亡Y79细胞产物的上清液与ARPE19细胞孵育。如前所述(29)，全部-反式-视网膜导致大量Y79细胞死亡，该培养上清液含有约120 ng/μl的DNA/RNA，由NanoDrop测量（Thermo Scientific，Waltham，MA）(补充图S5). 用紫外线照射15分钟，消除所有残留-反式-上清液中的视网膜(补充图S6). 将ARPE19细胞与来自降解Y79细胞的辐照上清液共同孵育24小时后，观察到比ARPE19与来自未经所有处理的Y79活细胞的上清液共孵育时更多的凋亡细胞-反式-视网膜治疗(补充图S7一). 当ARPE19细胞与未降解或降解Y79细胞的含有上清液的产物共同孵育时，NF-κB被激活，而当它们与降解的Y79细胞上清液共同孵育时，NFκB的激活更大(补充图S7B类). 此外，ARPE19细胞通过2¹⁵-qPCR分析显示，与降解Y79细胞的上清液产物以及聚（I-C）共同孵育后，折叠的NF-κB活性更高(图6一). 表达人TLR3的HEK293细胞（hTLR3-HEK292）与聚（I-C）或含有降解Y79细胞上清液的产物共同孵育后，NF-κB活化程度也高于HEK299细胞(图6B类). 为了进一步检测TLR3下游信号，对HEK293细胞进行了干扰素调节因子3（IRF3）报告子分析，因为TLR3的激活导致IRF3和NF-κB的激活。当hTLR3-HEK293细胞与含有降解Y79细胞或poly（I-C）产物的上清液孵育时，IRF3活性增加，而与经苯甲酸酶®处理的上清物共同孵育后IRF3的活性降低，以消除DNA/RNA(图6C类). 与所有人一起孵化-反式-视网膜（3μ米)并且脂多糖（LPS）（20μg/ml）持续6小时未激活IRF3(图6C类). 当RNase A（用于单链RNA）、RNase III（用于rRNA和dsRNA）和Benzonase®（用于RNA和DNA）存在时，hTLR3-HEK293细胞中NF-κB的激活趋于减少，而当RNaseH（用于DNA/RNA复合物）或DNase I存在时，这种活性保持不变(补充图S5). 由于巨噬细胞是表达TLR的专业清除剂，负责先天免疫的初始防御，因此用来自第三阶段^−/−，第9层^−/−，特里夫^−/−和WT小鼠，以确定培养的RPE细胞中记录到的反应的特异性。第9天^−/−使用小鼠是因为内源性染色质（DNA）-IgG复合物是TLR9激活配体(35). 含有降解Y79细胞和poly（I-C）产物的上清液在WT和第9天^−/−小鼠在以剂量依赖性和孵育时间依赖性的方式孵育后，但在来自第三阶段^−/−和特里夫^−/−老鼠。苯甲酸酶®处理可将DNA和RNA消化成长度小于5 bp的片段，防止WT和第9天^−/−老鼠(图6D类和补充图S8). 这些发现表明，降解的感光细胞的内源性产物，最可能是RNA，作为TLR3激活配体发挥作用。

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图6。

与所有细胞共同培养的感光细胞产生的内源性产物-反式-视网膜激活TLR3。 一将含有过度表达hTLR3（hTLR3-ARPE19细胞）的ARPE19和ARPE19电池与含有降解Y79细胞产物的上清液（40μl HEK-Blue检测介质中的20μl上清液）或聚（I-C）（50μg/ml）在96个平板中共同培养，在37°C下共同培养6小时后，通过监测620 nm处检测介质的吸光度来评估NF-κB的报告活性。误差线注明平均值的S.D(n个> 3).B类此外，还对HEK293细胞的NF-κB报告活性进行了测量，该细胞具有或不具有过度表达的hTLR3（hTLR3-HEK292），与含有降解Y79细胞产物的上清液（40μl HEK-Blue检测介质中的20μl上清液）或聚（I-C）（50μg/ml）在96 well平板中共同培养。在37°C下共同培养16小时后，在620 nm处监测吸光度。误差线注明平均值的S.D(n个> 3).C类，IFR3的报告活性是通过hTLR3-HEK293的荧光素酶测定来测定的，hTLR3与含有降解Y79细胞产物的上清液（200μl）共同培养(H（H）)或40微升(L（左）)300或460μl培养基中的上清）、含有降解Y79细胞产物的上清（300μl培养液中的上清液为200μl），用苯甲酸酶®（20单位/ml）预处理1 h，并在70°C下加热5 min以使酶poly（I-C）（50μg/ml(H（H）)或10μg/ml(L（左）))、脂多糖(液化石油气10μg/ml），或全部-反式-视网膜（3μ米)在24孔板中。在37°C共孵育6小时后测量萤光素酶活性，并计算PBS处理的细胞的倍数变化。误差线注明平均值的S.D(n个> 3).D类，NF-κB p65亚单位核转位用来自第三阶段^−/−，特里夫^−/−和WT小鼠与含有降解Y79细胞产物的上清液（未经任何稀释的上清）孵育后，上清液含有用苯甲酸酶®（20单位/ml）预处理1小时并在70°C下加热5分钟以使酶或聚（I-C）（10μg/ml）失活2小时的降解Y79电池产物。含有降解Y79细胞和poly（I-C）产物的上清液可诱导p65核移位，但Bensonase®治疗可阻止WT巨噬细胞的这种移位。骨髓来源的巨噬细胞第三阶段^−/−和特里夫^−/−小鼠未能转移p65亚单位。

讨论

在这里，我们描述了TLR3在年龄相关和急性光诱导视网膜变性小鼠中的作用-反式-视网膜清除率。缺乏ABCA4和RDH8的双敲除小鼠表现出具有人类黄斑变性标志性特征的CORD，包括A2E/脂褐素积聚、视锥/视杆光感受器死亡、RPE萎缩、核果、基底层沉积、布鲁赫膜增厚、补体激活和CNV。这些变化大多出现在出生后的前2至3个月，并因强光照射而加剧(4). 显然，啮齿类动物模型并不能完全再现灵长类动物视网膜的所有结构特征，因为它们没有黄斑，锥体的数量明显较少。尽管视觉过程不是人类疾病的完美模型，但在所有哺乳动物物种中，视觉过程在遗传/生理上仍然是保守的第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠模型具有与人类黄斑变性相同的几个特征。因此，这种和其他啮齿动物模型可以用于识别和研究影响视网膜的病理生理机制，特别是因为它们可以通过基因和环境进行操纵。

Toll样受体参与Rdh8的年龄相关性视网膜变性^−/−阿布卡4^−/−老鼠

有证据表明，先天免疫和慢性炎症参与人类黄斑变性的发病机制，其中包括与补体激活相关的关键分子的某些单核苷酸多态性增加了个体对AMD的敏感性，小鼠的视网膜变化也可能与炎症相关成分的破坏有关。尽管有报道称TLR3和TLR4的单核苷酸多态性可以调节AMD的易感性(20,36)，一些相互矛盾的报告表明AMD和这些TLR之间的关系较弱，这突出了除单核苷酸多态性分析以外的研究的必要性(37–42). 为了研究TLR在视网膜变性中的生物学作用，我们对TLR信号分子的基因表达进行了分析第8路^−/−阿布卡4^−/−患有年龄相关性视网膜变性的小鼠，其先天免疫激活包括布鲁赫膜上的补体沉积(4)巨噬细胞/小胶质细胞侵入视网膜下间隙，GFAP过度表达，表明Muller细胞在局部炎症反应中激活(图5和补充图S3). 在2-4个月大的婴儿中观察到TLRs（包括TLR3）的表达升高第8路^−/−阿布卡4^−/−视网膜退化和6-8个月大的小鼠第8路^−/−阿布卡4^−/−视网膜明显退化的CNV小鼠。此外，较年轻的小鼠比年长的小鼠表现出更大的TLR信号活性。这些数据表明，在2-4个月大的小鼠中，TLR激活与光感受器/RPE细胞死亡的关系更为密切，并且在老年人中有时观察到的CNV形成中发挥的主导作用较小第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。这一观察结果也可能解释已发表的数据，这些数据表明TLR3与干型AMD而不是湿型AMD与其特征性CNV的发展有较强的相关性(20). 与年轻WT小鼠相比，TLR3、TRIF和CXCL10趋化因子的表达显著增加在老年WT小鼠中也很明显。连同巨噬细胞/小胶质细胞渗入老年WT小鼠视网膜下间隙的证据（数据未显示）(31)我们的阵列分析有力地支持了慢性炎症在正常衰老中的重要作用以及小鼠年龄相关性视网膜变性的病理学。

TLR3激活导致炎症和RPE死亡

TLR的激活诱导1型细胞因子的表达，如IFN和ILs，最终激活炎症和细胞凋亡相关的通路(27). 据报道，TLR3-活化配体dsRNA通过多种途径诱导多种细胞类型的凋亡(43,44). TLR3的激活也可能直接触发癌细胞的凋亡(45)和人类RPE细胞(20). 最近的研究表明TLR3/TRIF/caspase-8在黑色素瘤细胞中具有促凋亡活性(30). 在本研究中，poly（I-C）导致HEK293细胞中caspase-8断裂，但在ARPE19细胞中未检测到caspase-9表达。相反，ARPE19细胞显示Bax相关和caspase-8非依赖性凋亡(补充图S1). 在人类RPE（ARPE19）细胞和原始RPE细胞中观察到聚（I-C）诱导的细胞死亡第8路^−/−阿布卡4^−/−和WT小鼠，但不在来自第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−和第三阶段^−/−老鼠(图3). 重要的是，RPE细胞死亡是由所有人杀死的退化视网膜细胞释放的产物引起的-反式-视网膜毒性。通过诱导线粒体相关凋亡(29,46)，全部-反式-视网膜对细胞有直接毒性。我们的阵列分析表明，在老年性视网膜变性中，几种TLR被激活Rdh8型^−/− 阿布卡4^−/−老鼠(表1)，并且从这些退化的视网膜细胞释放的产物可能激活其他TLR和/或炎症途径。事实上，越来越多的证据表明TLR介导的疾病和TLR内源性配体的鉴定已经被报道(18,47,48). 与紫外线照射的上清液和所有上清液共同培养的ARPE19细胞中NF-κB活化显著增加-反式-视网膜介导的活性Y79细胞也提示由不同的潜在机制引起的炎症反应(补充图S7B类). 虽然TLR3引发的炎症可能与RPE死亡有关，但本研究中的一些观察结果表明TLR3激活是该病理学的主要原因。这些数据表明，原始RPE细胞来自第8路^−/−阿布卡4^−/−和WT小鼠经历了poly（I-C）诱导的死亡，尽管在来自第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−和第三阶段^−/−老鼠(图3C类). 此外，在TLR3过表达的培养细胞中，NF-κB和IRF3的激活高于对照细胞(图6,A–C)在RNase A、RNase III或苯并酶®存在的情况下，NF-κB和IRF3活化降低(图6C类和补充图S5B类). 值得注意的是，通过苯甲酸酶®处理消除DNA和RNA，NF-κB p65的核移位减少(图6D类和补充图S8)和巨噬细胞第9天^−/−小鼠表现出与WT巨噬细胞相似的p65易位。总之，这些数据表明来自感光细胞的内源性RNA被所有-反式-视网膜诱导TLR3依赖性炎症和细胞死亡。有几条证据支持这一概念。首先，发现快速降解细胞释放的RNA是一种内源性TLR3配体(49). 其次，坏死细胞的mRNA可以激活TLR3(50). 第三，在系统性红斑狼疮患者中，抗DNA和RNA的自身抗体导致RNA诱导的免疫激活。第四，阿尔茨海默病斑块中神经元mRNA占优势(51,52)阿尔茨海默病患者的单核细胞显示TLRs（包括TLR3）转录降低(53). 最近的研究也支持视网膜中存在内源性dsRNA作为microRNA(54–56). 在急性光诱导视网膜变性中，光感受器层形成核酸相关沉积物，用DAPI、Hoechst染料和Sytox染料染色，与甲苯胺蓝一起识别核酸(57)所有这些都表明在这种组织变性过程中存在dsRNA-like内源性产物。这些数据表明，TLR3在人类视网膜疾病的慢性炎症和配体诱导的RPE/感光细胞死亡中都起着作用。

TLR3参与Rdh8视网膜病变的发展^−/−阿布卡4^−/−老鼠

尽管第8路^−/−抗体4^−/−小鼠表现出两种不同的视网膜变性表型，即年龄相关性变性（由CORD证明）和明亮光诱导的急性视网膜变性，这两种表型最初都显示出延迟清除所有-反式-视网膜(4). 所有物质的毒性-反式-视网膜作为一种活性醛，包括细胞通透性增加和线粒体损伤(29). 所有的累加共轭-反式-视网膜、A2E和所有-反式-可通过氧化应激诱导RPE死亡并抑制RPE吞噬作用的视网膜二聚体(58,59)已观察到体外以及动物研究。累积A2E的数量直接反映了所有-反式-视黄醇循环期间的视网膜形成。有趣的是，尽管消融TLR3可以改善老年性视网膜变性第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠，Tlr3^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠仍表现出巨噬细胞/小胶质细胞浸润受损，A2E积累无变化，表明慢性免疫反应的调节-反式-视网膜水平）与小鼠年龄相关性视网膜变性有关。我们的qPCR显示，与所有人共同培养后，ARPE19细胞中TLR3的表达没有升高-反式-视网膜和A2E，而poly（I-C）导致TLR3表达增加（数据未显示），这表明类视黄醇不可能作为TLR3活化配体。

除了CORD中TLR表达增加外(表1)，TLR3表达增加2倍第8路^−/−阿布卡4^−/−强光照射后急性视网膜变性小鼠(图2C类). 但视网膜变性第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠的严重程度远低于第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠暴露于10000lux光照15和30分钟(图2,一和B类). 总之，这些观察结果表明TLR3在急性和慢性退行性变中的作用第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。然而，视网膜损伤在第8路^−/−阿布卡4^−/−和第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠在60分钟的强光照射后。这一观察结果表明，TLR3相关的视网膜变性在较温和的光照环境中可能会减少，但其他细胞死亡机制，如氧化应激诱导的机制，可能在大量暴露于强光下后占主导地位。

本研究结果与人类AMD的相关性

AMD是一种病因复杂的疾病，其中多种遗传和环境因素影响疾病进展。编码补体因子H的基因(7–14)，HtrA丝氨酸肽酶1（HTRA1）(60–63)，并补充组件2和3（C2和C3）(15,16)据报道易患AMD，人类和小鼠的研究都证明了AMD病变处的补体沉积(64–66). 此外，TLR3的F412L多态性(20)和TLR4的D299G(36)已经有报道，但这些发现被多个小组驳斥(37–42). 因此，人们逐渐达成共识，即先天免疫在AMD的发病机制中起着重要作用。事实上，最近的动物研究表明，受到干扰的免疫反应与视网膜变化有关。用羧乙基吡咯修饰的小鼠血清白蛋白免疫小鼠，诱导具有类似干性AMD表型的视网膜病变(66). 对编码单核细胞趋化蛋白-1（CCL2）、C-C趋化因子受体-2（CCR2）或CX3C趋化素受体-1（CX3CR1）的基因进行靶向性缺失，模拟了小鼠AMD的某些特征。Ccl2公司^−/−抄送2^−/−特别是小鼠已被接受为AMD模型动物(65,67,68); 然而，最新的特征Ccl2公司^−/−小鼠表明，这些小鼠中所描述的AMD的大多数特征可以用正常衰老来解释(31). 补体因子H敲除小鼠(Cfh（立方英尺）^−/−)在24个月大时，仅显示Bruch膜变薄、脂褐素沉积和感光细胞外段紊乱(69). 虽然AMD的病理学很可能涉及炎症反应，但诱导炎症反应的分子机制仍不清楚。在这项研究中，在年龄相关性视网膜变性患者中观察到TLR信号增强第8路^−/−阿布卡4^−/−老鼠。我们还发现TLR3在人和小鼠RPE中表达，RPE细胞死亡是通过TLR3由所有-反式-除了合成的dsRNA外，视网膜暴露的感光细胞。重要的是，第三阶段^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−在缺乏TLR3的情况下，小鼠没有发生与年龄相关或强光诱导的视网膜变性。因此，我们得出结论，TLR3在所有-反式-小鼠的视网膜相关视网膜变性，它是旨在改善人类视网膜变性的治疗的潜在靶点，包括Stargardt病和AMD。这项工作是第一项将视黄酸循环异常功能引起的视网膜病变与人类Stargard病和AMD的免疫机制联系起来的研究。

补充材料

补充数据：

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鸣谢

我们感谢L.T.Webster，Jr.博士、K.Ishikawa博士、V.Chauhan博士、S.Matsuyama博士、M.S.Matosky博士和S.Roos博士（凯斯西储大学）的评论和技术支持。

^*这项工作得到了国立卫生研究院K08EY019031、K08EY19880、EY009339、EY021126和P30 EY11373的全部或部分支持。这项工作还得到了退伍军人事务医疗中心职业发展拨款、预防失明研究基金会、与失明作斗争基金会和俄亥俄州狮子眼睛研究基金会的支持。

本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充的“实验程序”，图S1-S8，表1和附加参考.

^三使用的缩写如下：

绳索: 锥细胞退化
高级工程师: 二锡吡啶乙醇胺
AMD公司: 年龄相关性黄斑变性
ERG公司: 视网膜电图
GFAP公司: 胶质纤维酸性蛋白
聚（I-C）: 聚肌苷-：多囊酸或聚肌苷多囊酸钠盐
零售物价指数: 视网膜色素上皮
SD-OCT公司: 光谱域光学相干层析成像
SLO公司: 扫描激光检眼镜
TLR公司: toll样受体
CNV公司: 脉络膜新生血管
TIR公司: Toll/IL-1受体
TRIF公司: TIR域适配器诱导干扰素-β
dsRNA: 双链RNA
定量PCR: 定量PCR
抗体: 抗体
小时: 人类。

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文章来自生物化学杂志由提供美国生物化学和分子生物学学会

Toll样受体3在受损人群视网膜病变发生中的作用-反式-小鼠视网膜清除率*

Satomi Shiose公司

于晨

冈野纪一郎

萨尼塔·罗伊

Hideo Kohno先生

曾冠豪

埃里克·皮尔曼

前田忠道

克日什托夫·帕尔琴夫斯基

前田昭子

关联数据

摘要

介绍

实验程序

动物

RNA表达分析

表1

表2

原代RPE细胞培养

超高分辨率光谱域光学相干层析成像（SD-OCT）和扫描激光眼底镜成像（SLO）

维甲酸和A2E分析

组织学

ERG公司

鼠标眼底图像

合成TLR3配体Poly（I-C）诱导RPE细胞死亡

视网膜细胞降解产物诱导RPE细胞死亡

视网膜下注射Poly（I-C）

NF-κB和IRF3报告者分析

p65向细胞核的移位

统计分析

结果

Rdh8显示视网膜变性时TLR信号增强−/−阿布卡4−/−老鼠

Rdh8中TLRs的表达−/−阿布卡4−/−视网膜，初级培养Rdh8−/−阿布卡4−/−RPE和ARPE19单元

TLR3的缺失可保护Rdh8的视网膜变性−/−阿布卡4−/−老鼠

TLR3的缺失保护视网膜免受光诱导急性变性的影响

TLR3-活化配体在体外引起RPE细胞死亡

视网膜下注射聚（I-C）诱导小鼠视网膜变性

TLR3级−/−第8路−/−阿布卡4−/−小鼠自身荧光视网膜下巨噬细胞/小胶质细胞数量减少，视网膜炎症反应减弱

暴露于全反式激活TLR3的死亡/死亡细胞的内源性成分

讨论

Toll样受体参与Rdh8的年龄相关性视网膜变性−/−阿布卡4−/−老鼠

TLR3激活导致炎症和RPE死亡

TLR3参与Rdh8视网膜病变的发展−/−阿布卡4−/−老鼠

本研究结果与人类AMD的相关性

补充材料

鸣谢

参考文献

Toll样受体3在受损人群视网膜病变发生中的作用-反式-小鼠视网膜清除率^*

Rdh8显示视网膜变性时TLR信号增强^−/−阿布卡4^−/−老鼠

Rdh8中TLRs的表达^−/−阿布卡4^−/−视网膜，初级培养Rdh8^−/−阿布卡4^−/−RPE和ARPE19单元

TLR3的缺失可保护Rdh8的视网膜变性^−/−阿布卡4^−/−老鼠

TLR3级^−/−第8路^−/−阿布卡4^−/−小鼠自身荧光视网膜下巨噬细胞/小胶质细胞数量减少，视网膜炎症反应减弱

Toll样受体参与Rdh8的年龄相关性视网膜变性^−/−阿布卡4^−/−老鼠

TLR3参与Rdh8视网膜病变的发展^−/−阿布卡4^−/−老鼠