NMDA受体传递受损以年龄依赖的方式改变纹状体突触和DISC1蛋白

14-3-3ε和DISC1的生化还原是突触特异性的。

我们通过一种无偏见的蛋白质组学方法来研究NR1-KD小鼠突触变化背后的分子缺陷，以确定可能选择性改变其表达水平的突触蛋白。通过蔗糖密度梯度分离WT和NR1-KD小鼠纹状体制剂中的突触组分，并用于凝胶电泳（DIGE）和MS中的2D差异(图S1). 通过使用这种方法，我们发现NR1-KD纹状体突触部分的14-3-3ε减少，而该蛋白的总水平没有变化(图2). 由于2D-DIGE方法缺乏检测所有蛋白质物种的敏感性，我们假设14-3-3ε的减少可能导致分子途径的额外变化。

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图2。

NR1-KD小鼠突触特异性缺失14-3-3ε和DISC1蛋白。(A类)纹状体总提取物（25μg）和(B类)纹状体突触质膜组分（15μg蛋白）。针对14-3-3ε的单克隆抗体和针对DISC1的多克隆抗体（Invitrogen抗体，I）检测到14-3-3ε的29 kDa同种型以及DISC1的100 kDa和70 kDa同种型。(C类)根据GAPDH标准化的14-3-3ε和DISC1水平表明，14-3-3-ε的突触特异性减少，DISC1的总提取物略有减少，但突触提取物中的DISC1大量耗竭(n个=每个基因型6个*P（P）<0.05，双尾t吨测试）。(D类)通过植入后免疫金传递EM标记DISC1的代表性显微照片。DISC1免疫反应在纹状体不对称突触的突触前膜和突触后膜（带箭头的环形突触）以及线粒体（不带箭头的圆形突触）中检测到。(E类)不对称突触或线粒体内DISC1免疫金标记的定量(n个=每个基因型3只动物*P（P）<0.05，双尾t吨测试）。(F类)对总（25μg）和突触（15μg）纹状体蛋白提取物进行Western blot，以检测WT和NR1KD小鼠PDE4B、LIS1和NDEL1的相对水平。(G公司)GAPDH标准化水平表明PDE4B或NDEL1无变化，总LIS1水平略有下降，突触LIS1增加(n个=每个基因型6个*P（P）<0.05，双尾t吨测试）。

14-3-3蛋白与目标蛋白上的磷酸化位点结合，并调节其活性、稳定性、运输和相互作用(24). 编码14-3-3蛋白家族的基因，包括14-3-3ε(Ywhae公司)与精神分裂症相关(25,26)死亡后精神分裂症患者大脑前额叶皮层中几个14-3-3基因的信息水平降低(27). 此外，已知14-3-3蛋白与DISC1相互作用，将其置于精神分裂症发病的分子途径中(28,29).

DISC1是一种支架蛋白，被认为可以协调其他突触蛋白(30–32)，并且确实在与NMDA受体激活相关联的突触棘维持中发挥关键作用(33). 因此，我们假设，无偏见方法的结果可能反映了突触中涉及DISC1的分子通路的可能缺陷。

我们检测了突触中DISC1的分子状态，发现NR1-KD小鼠纹状体突触质膜部分的DISC1池也显著减少(图2)而DISC1的总水平变化不大。植入后免疫金EM的超微结构分析证实了这种还原的突触特异性(图2). 在NR1-KD纹状体的不对称突触处，DISC1选择性减少，而从相同的树突状末端评估的线粒体DISC1数量没有改变。

纹状体中DISC1的减少最为显著，而额叶皮层和海马体中的减少更为轻微(图S2和第3章). 纹状体内，DISC1复合体蛋白水平的突触减少仅限于DISC1和14-3-3ε，以及其他DISC1相互作用物的水平，如LIS1、NDEL1和PDE4B(30,34)，在NR1-KD小鼠的突触制备中保持不变或略有升高(图2).

药物阻断NMDA受体可降低脊髓密度和突触DISC1。

为了证实抑制NMDA受体可以减少突触数量和突触DISC1，我们用高选择性、非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801亚慢性药物治疗WT小鼠。在成年小鼠（12周龄）中，通过皮下渗透微型泵给药0.2 mg/kg/h，持续1周或2周。此剂量方案不会引起毒性(图S4)，但被证明在WT小鼠中诱导多动并破坏社交行为，其程度与在未经治疗的NR1-KD小鼠中观察到的程度相似(图S5和S6系列). MK801治疗小鼠的脊椎密度呈剂量依赖性降低(图3). 此外，MK801处理的小鼠突触DISC1减少了40%，这支持了突触DISB1对NMDA受体介导的神经传递有反应的概念(图3). 值得注意的是，14-3-3ε水平未受MK801给药的影响，这表明DISC1水平对NMDA受体传递的瞬时减少比14-3-3λ更敏感，可能涉及不同的调节机制。

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图3。

MK-801亚慢性治疗降低成年纹状体的突触数量和DISC1蛋白。(A类)盐水溶液和MK801处理的小鼠（0.2mg/kg/h，7天）MNs的树突轴和棘的代表性显微照片。（比例尺：10μm）(B类)用盐水或0.1或0.2 mg/kg/h MK801处理的小鼠每100μm树突脊柱密度的定量(n个=每个治疗组来自三只动物的6个神经元；P（P）=0.051双尾t吨测试）。(C类)小鼠纹状体总蛋白提取物（25μg）和突触质膜提取物（15μg），分别取自盐水溶液或渗透微型泵（0.2 mg/kg/h）输送的MK-801 14d输注液；Western blot检测14-3-3ε和DISC1（Santa Cruz，S）。(D类)DISC1和14–3-3ε的相对水平归一化为GAPDH水平(n个=每个治疗组6个*P（P）<0.05和**P（P）<0.01，双尾t吨测试）。

蛋白质提取物的亚细胞分离。

根据前述方法制备突触质膜提取物(44,45)，所有步骤均在4°C下在蛋白酶抑制剂的存在下进行（含EDTA的完整片剂；罗氏）。小鼠被颈部脱位杀死，纹状体在冰上迅速解剖。用电动聚四氟乙烯/玻璃均质器在0.32M蔗糖、4mM Hepes（pH 7.4）中均质三到四只小鼠的混合组织。保留总蛋白提取物，剩余样品在900×克去除细胞核。上清液经10000×离心洗涤两次克并在0.32 M蔗糖中重新悬浮，所得颗粒中的膜在水中通过渗透冲击溶解。通过在200000×克收集1.2-M间期膜作为突触质膜。

西部印记。

蛋白质提取物在10%聚丙烯酰胺凝胶上溶解并转移到硝化纤维素膜上。在4°C下进行一级抗体孵育过夜，并使用以下抗体：兔抗DISC1（Mid；1:250；Invitrogen）、山羊抗DISC1（1:500；Santa Cruz）、羊抗PDE4B（1:3000；苏格兰格拉斯哥格拉斯哥大学Miles Houslay赠送）、兔抗LIS1（1:500，Abcam）、大鼠抗NDEL1（1:100；A赠送。Kamiya，Johns Hopkins University，Baltimore，MD），小鼠抗–NR1-CT（1:1000；Upstate），鼠抗GAPDH（1:3000；Abcam）。请参见图S8用于验证F1遗传背景中的DISC1抗体。对于所有抗体，5%牛奶/Tris缓冲生理盐水-Tween-20（TBST）用于阻断和抗体步骤，但抗GAPDH除外，它需要5%BSA/TBST。将适合物种的二级抗体与HRP（Pierce）或红外染料（Rockland Immunochemicals）偶联，并通过增强化学发光（Pierse）检测或Li-Cor Odyssey红外成像。使用ImageJ64（美国国立卫生研究院）对免疫印迹标记进行量化。蛋白质水平归一化为GAPDH，并表示为相对光密度，双尾t吨使用Excel软件进行检验以确定统计显著性。

树突状脊柱成像和测量。

使用含有（mM）：110氯化胆碱、25NaHCO的冰镇切割液，从出生后第14天（P）、P40突变小鼠和WT同窝小鼠制备急性纹状体薄片（350μm厚）_三，25 D-葡萄糖，11.6抗坏血酸钠，7 MgSO₄，3.1丙酮酸钠，2.5 KCl，1.25 NaH₂人事军官₄和0.5 CaCl₂.切片在气体中孵育（95%O₂/5%一氧化碳₂)人工脑脊液[含（mM）:127 NaCl，25 NaHCO_三，25 D-葡萄糖，2.5 KCl，1.0 MgCl₂，2.0氯化钙₂和1.25 NaH₂人事军官₄]在34°C下放置45至60分钟，然后在室温下放置直至使用。实验在室温（25°C）下在人工脑脊液中进行（流动速度为4-6 mL/min）。包含130 KMeSO的全细胞贴片电极（4-5 MΩ）（单位：mM）_三，10肝素，10磷酸肌酸钠，3抗坏血酸，4氯化镁₂，4钠₂-ATP、0.4 Na-GTP、0.2 EGTA和0.04 Alexa 594。MSNs首先使用60倍相差物镜通过细胞体形状进行鉴定，并在修补后通过膜静息电位（−80 mV）进行鉴定。

使用定制的双光子激光扫描显微镜对修补后的MSN进行成像。使用光电倍增管（R3896；滨松光电）在外荧光模式下检测荧光。图像采集和数据分析由定制软件（Matlab；Mathworks）控制(46).

或者，通过灌注固定组织的二元醇标记测定脊柱密度。用异氟醚麻醉小鼠，并用4%多聚甲醛灌注，pH 7.4。纹状体冠状切片（100μm）由振动仪获得，神经元随机标记为DiI-涂层的1μm金颗粒和BioRad基因枪(47). 标记一小时后，将切片安装在玻璃载玻片上，并通过共焦显微镜成像。通过纹状体内的位置和形态识别MSN。使用尼康元素软件测定脊柱密度。

我们感谢Miles Houslay博士（PDE4B）、Qi Wang博士（D440 DISC1）和Atsushi Kamiya博士（NDEL1）赠送的抗体试剂。我们感谢杜克电子显微镜服务公司的萨拉·米勒博士和菲利普·克里斯托弗博士提供的实验建议和组织处理，感谢坦尼亚·戴格尔博士提供的专家建议，感谢凯瑟琳·哈雷和温迪·霍斯福尔提供的技术援助，感谢萨姆·恩古在金粒子定量方面的帮助。此外，我们感谢尼古拉斯·布兰登博士、劳尔·盖涅丁诺夫博士和阿基科·哈亚希·塔卡吉博士的有益讨论。这项工作得到了国家药物滥用研究所拨款K01DA017703（给A.J.R.）的部分支持；国家心理健康研究所（NIMH）拨款R01MH079201、R01MH0073853和U19MH082441（发给M.G.C.）；NIMH拨款R01MH080047（发给R.Y.）；NIMH拨款R01MH069853、R01MH085226、R01NH088753和MH084018（Silvo O.Conte中心拨款；给A.Sawa）；国家神经疾病和中风研究所拨款R01NS068410（发给R.Y.）；国家精神分裂症和情感障碍研究联盟青年研究员奖（a.J.R.）；国家精神分裂症和情感障碍研究联盟Staglin奖（授予a.Sawa）；斯坦利基金会（A.Sawa）；霍华德·休斯医学研究所（R.Y.）；儿童肿瘤基金会；以及葡萄牙科学技术基金会（A.F.O.）。