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美国国家科学院院刊。2011年4月5日；108(14): 5718–5723.
2011年3月22日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1014660108
预防性维修识别码：项目经理3078371
PMID：21427230

赖氨酸甲基转移酶G9a是DNA从头甲基化和前病毒沉默的建立（但不是维持）所必需的

丹尼·梁朝伟，一 Kevin B.Dong（凯文·B·东），一 伊琳娜·马克萨科娃，a、，b条 普雷蒂·戈亚尔，一 鲁斯·阿帕纳，一 桑德拉李，一 橘真琴，c（c） 新开洋一，c（c） 伯恩哈德·莱内茨，d日 迪克西·马格尔，b条 法比奥·罗西，d日和马修·洛林茨a、，1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

组蛋白H3（H3K9me）赖氨酸9甲基化和DNA甲基化在特定基因和重复元件的转录沉默中起重要作用。在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的I类和II类内源性逆转录病毒（ERV）上检测到这两种标记。最近，我们报道了H3K9me3和mESCs中ERV沉默的维持需要H3K9-特异性赖氨酸甲基转移酶（KMTase）Eset/Setdb1/KMT1E。相反，G9a/Ehmt2/KMT1C是可有可无的，尽管H3K9二甲基化（H3K9me2）和这些逆转录元件的有效DNA甲基化需要这种KMTase。外源性逆转录病毒（XRV）Moloney小鼠白血病病毒的转录在mESCs整合后迅速消失，伴随着DNA的从头甲基化。然而，H3K9 KMT在这一过程中发挥的作用尚未得到解决。在这里，我们证明G9a，而不是Suv39h1或Suv39h2，是沉默mESCs中新整合的Moloney鼠白血病病毒载体所必需的。中的消音缺陷G9a公司−/−细胞在前病毒LTR时伴随着H3K9me2的减少，表明XRV是G9a的直接靶点。此外，新整合的前病毒的从头DNA甲基化在G9a公司−/−在Dnmt3a缺陷的mESCs中观察到前病毒DNA甲基化和沉默缺陷。然而，一旦建立，XRV（如ERV）沉默的维持就完全依赖于KMTase Eset。综上所述，这些观察结果表明，在mESCs中，H3K9 KMTase G9a是建立新整合的前病毒沉默所必需的，但不是维持沉默所需的。

关键词：表观遗传学，共价组蛋白修饰，长末端重复

逆转录病毒已在所有种类的脊椎动物中定植，并导致哺乳动物的一系列病理变化，包括远亲物种中的癌症和人类获得性免疫缺陷综合征。虽然逆转录病毒亚群的生产性逆转录病毒感染是细胞病变，但急性和慢转化类的前病毒成分分别通过表达病毒致癌基因和干扰细胞基因的表达来诱导肿瘤发生。鉴于逆转录病毒感染的潜在有害影响，许多作用于逆转录病毒复制周期转录或转录后阶段的细胞自主途径已经进化为抑制逆转录病毒表达(1，2).

基于外源性逆转录病毒（XRV）Moloney小鼠白血病病毒（MLV）的逆转录病毒载体，例如MFG载体(三)已在实验室和临床中广泛用作基因传递载体。在这两种情况下，转录沉默已被证明是稳定/长期前病毒表达的主要障碍(1，4)，部分原因是前病毒LTR中存在受转录阻遏物约束的负调控元件(5，6)染色质蛋白质的结合，包括组蛋白H1(7，8)和宏H2A1(9). MLV在胚胎癌（EC）和胚胎干（ES）细胞中被抑制，具有特殊的效率(10)，主要是由于存在与脯氨酸tRNA（tRNA）3′端互补的引物结合位点（PBS）重叠的强效阻遏物结合位点赞成)在WT MLV病毒中(11——13). Kruppel-associated box（KRAB）锌指蛋白ZFP809和KRAB相关蛋白1（KAP-1/Trim28/Tif1-β）是一种有效的转录辅阻遏物，最近被鉴定为干细胞特异性阻遏复合物的亚单位(13)与阻遏物结合位点结合(14，15). 为了避免转录沉默，已经产生了一些在这些负调控元件中含有突变的载体(16——18). 小鼠干细胞病毒（MSCV）载体还包括LTR内引入的SP1结合位点以及tRNA格林PBS代替tRNA赞成(18). 尽管这些“优化的”逆转录病毒载体在EC、ES和造血干细胞中的沉默效率低于MFG等WT载体，但这些细胞中仍存在前病毒沉默(7，16，17，19).

此外，基于MLV的载体的转录沉默经常伴随着前病毒的从头DNA甲基化(20，21)甲基DNA-结合域蛋白MeCP2的结合(8，22)，暗示沉默过程中的DNA甲基化。事实上，用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷治疗EC细胞会导致MLV的转录激活(21). 然而，从头甲基化的动力学(20，23)以及缺乏新生DNA甲基转移酶Dnmt3a和Dnmtt3b的小鼠ES细胞（mESCs）中前病毒沉默的持续性(7)表明DNA甲基化无关的沉默途径也必须存在。

有趣的是，全基因组研究表明，内源性逆转录病毒元件（ERV）以mESCs中抑制性组蛋白标记H3K9me2和/或H3K9 me3为标志(24——26). 最近，我们证明，尽管ERV表现出降低H3K9me2（但不降低H3K9me3）和缺乏“常染色”H3K9 KMTase G9a的mESCs中的DNA甲基化(27)，这些寄生元素在转录上保持惰性。随后，我们发现Eset，一种H3K9三甲基化酶，是维持I类和II类ERV处于静默状态所必需的(28). 然而，关于H3K9 KMTases在建立新整合前病毒沉默中的作用，人们知之甚少。在这里，我们表明G9a在建立基于MLV的XRV的沉默中起着至关重要的作用，但对于维持这些元素的沉默是不可或缺的。

结果

建立基于MLV载体的沉默需要G9a。

为了确定G9a是否在抑制新整合的前病毒元件WT（TT2）和G9a公司−/−多功能电子稳定控制系统(29) (图S1)用基于MLV的逆转录病毒载体MFG-GFP转导(三) (图1A类)，在WT多能干细胞中相对于分化细胞表达较差，并传代用于进一步分析(图1B类). 有趣的是，感染后第12天，<5%的WT细胞表达GFP（PI），>20%的感染WT细胞G9a公司−/−流式细胞术测定细胞在同一时间点表达GFP(图2A类). 此外，尽管GFP的百分比+随着时间的推移，两种细胞系中的细胞都减少了，GFP的百分比+中的单元格G9a公司−/−在分析的所有时间点，细胞始终高于WT线(图2B类)，表明G9a是高效建立这种基于MLV的前病毒沉默所必需的。

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逆转录病毒载体和感染模式。(A类)MFG-GFP和MSCV-GFP逆转录病毒载体5′区的图谱。干细胞专用消声器与制造商绑定/tRNA赞成PBS，但不是MSCV/tRNA甘氨酸PBS公司。强调了序列差异。(B类)如图所示，mESCs感染MFG-GFP或MSCV-GFP并传代以进行进一步分析。

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G9a公司−/−mESCs显示MLV前病毒沉默的缺陷。(A类)TT2（重量）和G9a公司−/−mESCs感染MFG-GFP（MFG），并在第12PI进行流式细胞术分析。对未感染细胞进行平行分析。数据显示为前向散射（FSC）与GFP。(B类)通过流式细胞术分析连续时间点PI的GFP表达。(C类和D类)TT2和G9a公司−/−用MSCV-GFP感染mESCs并进行流式细胞术分析。

为了确定G9a是否在沉默mESCs中“优化”表达的替代MLV载体中发挥作用，我们对基于MLV的载体MSCV进行了类似实验。这种逆转录病毒载体包含LTR和tRNA的突变甘氨酸PBS代替tRNA赞成公共广播系统(图1A类)消融干细胞特异性阻遏物复合物的结合(12，18)至重叠的消音器元件。这些突变的表达水平明显高于MFG载体(7，30)并降低mESC中的沉默率(30).G9a公司−/−用MSCV-GFP病毒转染WT细胞，每周用流式细胞仪分析表达GFP的细胞百分比。尽管MSCV载体在感染后早期约40%的受感染WT细胞中表达，但GFP的百分比显著下降+在培养过程中观察到细胞(图2C类和D类). 相反，该载体在G9a公司−/−细胞。与流式细胞术数据一致，第15天PI的定量RT-PCR（qRT-PCR）分析显示GFP在G9a公司−/−行而不是WT父行(图S2A类). 相对于WT池G9a公司−/−感染细胞池中每个细胞的前病毒拷贝数大致相同(图S2B类)，排除了观察到的表达差异可能是前体负荷差异的结果。

WT，但非催化失活的G9a，挽救了G9a公司−/−mESC。

验证是否删除G9a公司本身负责观察到的表型，并确定前病毒沉默是否依赖于G9a催化活性，G9a公司−/−稳定表达WT的细胞(G9a公司−/−Tg（千克）)或催化不活跃(G9a公司−/−玻璃钢C1168A）G9a公司转基因(31) (图S1)感染MSCV-GFP病毒，如上所述。外源性WT G9a的表达“挽救”了观察到的沉默缺陷G9a公司−/−mESCs，但催化突变体的表达没有(图3A类)表明具有催化活性的G9a对沉默新整合的前病毒至关重要。对相对前病毒拷贝数的定量分析表明，前病毒表达的差异并不是由于前病毒载量的差异造成的。

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引入WT，但不引入催化活性G9a，可以弥补沉默缺陷，而Dnmt3a型−/−mESCs显示前病毒沉默的缺陷，类似于在G9a公司−/−细胞。(A类)TT2（重量）和G9a公司−/−表达a的细胞G9a公司转基因(G9a公司−/−Tg（千克）)或一个催化无效的转基因(G9a公司−/−玻璃钢C1168A)与MSCV-GFP同时感染，并通过流式细胞术分析连续时间点的GFP表达，PI。通过qPCR使用特异性引物测定前体负荷GFP公司基因与内源性β-主要基因作为对照，每个感染人群的相对平均（±SD）前病毒拷贝数/细胞归一化为相应的感染WT亲本系。(B类和C类)J1（重量），Dnmt3a型−/−、和Dnmt3b型−/−多功能电子稳定控制系统(B类)或R1（WT）和Suv39h1/2号−/−(C类)同时感染mESCs并分析GFP表达和前病毒载量。

观察到的沉默缺陷G9a公司−/−观察到的mESCs表型Dnmt3a型−/−mESC。

在WT-mESCs中，基于MLV的载体显示随着培养传代时间的延长，DNA甲基化密度增加(8)，并且密集的DNA甲基化足以使体细胞和EC细胞中的前病毒沉默(8，22，30). 为了确定Dnmt3a和Dnmtt3b缺陷的mESCs是否具有与在G9a公司−/−WT（J1）mESCs同时感染MSCV-GFP病毒和Dnmt3a和Dnmt 3b双基因敲除(Dnmt3a/b公司−/−)单元格(图S3). 与我们在WT TT2 mESCs中的观察结果一致，WT J1 mESCs的前病毒表达在前2周PI中显著降低。与此相反，Dnmt3a/b型−/−细胞表现出类似于G9a公司−/−mESC。为了确定沉默需要哪些从头开始的DNMT，Dnmt3a型−/−（6aa）和Dnmt3b型−/−（8磅）(32)如上所述，mESCs在连续第1天感染并通过FACS进行分析。有趣的是Dnmt3a型−/−细胞表现出与在G9a公司−/−细胞，Dnmt3b型−/−细胞表现出相对温和的沉默缺陷(图3B类). 定量分析相对前病毒拷贝数表明GFP百分比的差异+每个细胞系中的细胞不能用前病毒负荷的差异来解释。综上所述，Dnmt1缺陷细胞在新整合的前病毒的从头DNA甲基化方面只有轻微缺陷(33)这些结果表明，G9a和Dnmt3a2是mESCs中Dnmt3的主要亚型(34)]在mESCs中建立前病毒沉默是必需的。

Suv39h1和Suv39h2不需要沉默新整合的Provirus。

为了确定“异色”H3K9 KMTases、Suv39h1和Suv39h2中缺失的mESCs是否在前病毒沉默中发挥作用，将WT（R1）mESCs与MSCV-GFP同时感染Suv39h1号机组和Suv39h2号双重缺陷(Suv39h1/2号−/−)mESCs，如上所述，并在连续几天的PI中进行分析。与…对比G9a公司−/−mESCs，与之前的报告一致，该系内源性MLV的DNA甲基化没有降低(35)，MSCV-GFP载体在Suv39h1/2号−/−多功能电子稳定控制系统(图3C类). 事实上，前病毒沉默在某种程度上对Suv39h1/2号−/−可能是由于HP1蛋白的重定位(36)和/或Dnmt3b(35)远离这些细胞的着丝粒周围隔室。

年MSCV-GFP前病毒5′LTR/启动子区H3K9me2降低G9a公司−/−mESC。

正如预期，G9a公司−/−H3K9me2在全球范围内被耗尽，而Suv39h1/2型−/−细胞的表观遗传标记没有减少(26) (图4A类). 确定是否在G9a公司−/−细胞与前病毒H3K9甲基化降低有关，对从WT TT2和G9a公司−/−细胞，使用针对H3K9me2或H3K9 me3的抗体。这些抗体对ChIP分析的特异性通过使用针对Mage-a2杂志基因启动子和主要卫星重复序列(图4B类和图S4). 与之前的观察结果一致(27，29)，的Mage-a2（Mage-a2）相对于IgG对照，该基因表现出高水平的G9a-依赖性H3K9me2富集，但H3K9 me3富集非常低。相比之下，主要的卫星重复序列，之前发现其标记为H3K9me3，与G9a无关(26，27)，WT中H3K9me3水平较高G9a公司−/−单元格(图S4).

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H3K9me2在前驱LTR降低G9a公司−/−mESCs。(A类)消耗H3K9me2 inG9a公司−/−个单元格，但不在Suv39h1/2号−/−Western blot分析证实。对感染MSCV-GFP的TT2和G9a公司−/−mESCs使用H3K9me2-和H3K9 me3-特异性抗体或IgG作为对照。(B类)qPCR使用内源性Mage-a2杂志基因。显示了技术复制的平均浓缩水平[表示为输入的百分比（±SD）]。(C类)用针对MSCV 5′LTR和GFP区域的特异性引物扩增显示，在5′LTR5′处，H3K9me2的表达量减少G9a公司−/−行。(D类)使用H3K4me2-和H3K9ac特异性抗体进行ChIP，并通过qPCR进行分析，如上所述。

对相同染色质分离物中MSCV LTR的分析显示，H3K9me2的富集在G9a公司−/−线路(图4C类)第22天PI。相反，同一区域的H3K9me3富集水平虽然高于对照IgG观察到的水平，但在两个品系之间没有显著差异，这表明另一种KMTase负责XRV的H3K9me3。虽然前病毒整合子的不同亚群是否以H3K9me2或H3K9 me3标记尚不清楚，但这些结果与我们之前的研究结果一致，即Eset负责mESCs中MSCV-GFP前病毒的H3K9-me3(28). 对GFP区域的分析显示，两种细胞系中都有高水平的H3K9me2和H3K9-me3，这表明H3K9和H3K 9me3标记了不依赖G9a的前病毒转录区(图4C类). 以前曾报道过基因体中存在H3K9me2和/或H3K9 me3(37，38).

使用针对H3K4me2和H3K9ac（通常与转录活性基因相关的标记）的特异性抗体进行的ChIP分析显示了相反的模式，在Mage-a2杂志和前病毒5′LTR启动子区G9a公司−/−线路比WT线路(图4D类). 在WT系的前病毒LTR中，这些活性标记以显著高于背景的水平存在，这可能反映了在该感染细胞池中存在组成型表达的前病毒整合子(图2D类). 综上所述，这些结果表明G9a通过直接标记与新整合的前病毒相关的染色质，有助于mESCs中的前病毒沉默。

MLV-基XRV的高效DNA甲基化需要具有催化活性的G9a。

我们之前发现MFG-GFP前病毒的5′LTR/PBS和GFP区域在G9a公司−/−相对于第18天PI的WT细胞(27). 在感染MFG-GFP的前病毒LTR中观察到一个更显著的从头甲基化缺陷Dnmt3a/b公司−/−第18天PI分离的mESCs(27); 这些亚硫酸氢盐数据总结如下图S5A类为了检测MSCV载体的DNA甲基化是否也依赖于G9a，从MSCV-GFP感染的TT2和G9a公司−/−利用MSCV 5′LTR/PBS区域特异性引物对第4天和第18天培养的细胞进行亚硫酸氢盐分析。虽然在TT2和TT2中检测到前病毒DNA甲基化增加G9a公司−/−在传代培养的细胞中，检测到DNA甲基化水平大约低三倍G9a公司−/−两个时间点的细胞与WT细胞的比较(图5A类). 值得注意的是，前病毒DNA甲基化水平G9a公司−/−第18天PI的细胞与第4天PI的WT细胞相似，表明在缺乏G9a的情况下，DNA甲基化的积累速度要慢得多。为了确定有效的前病毒DNA甲基化是否依赖于G9a的催化活性G9a公司−/−Tg（千克）和G9a公司−/−Tg（千克）在第4天和第18个PI天通过亚硫酸氢盐测序分析C1168A细胞。只有在G9a公司−/−Tg（千克）第18天PI的C1168A线路(图5B类)，证实新整合前病毒的从头DNA甲基化需要G9a的酶活性。

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前病毒DNA从头甲基化率在G9a公司−/−和G9a公司−/−TgC1168A型细胞。TT2、，G9a公司−/−，G9a公司−/−Tg（千克）、和G9a公司−/−TgC1168A型mESCs感染MSCV-GFP。来自TT2和G9a公司−/−(A类)或G9a公司−/−Tg（千克）和G9a公司−/−TgC1168A型(B类)mESCs在d4和d18 PI处分离，并使用前病毒5′LTR特异性引物进行亚硫酸氢盐测序分析。每个测序分子中存在甲基化CpG，用黑色椭圆形表示，每个数据集显示甲基化Cp Gs/测序分子的平均百分比。

相反，从WT R1和Suv39h1/2号−/−第18天PI的细胞显示MSCV LTR中DNA甲基化的差异小于1.2倍(图S5B类)，与之前的一份报告一致，该报告显示Suv39h1/2号−/−单元格(35). 综上所述，这些结果表明，尽管H3K9me2需要具有催化活性的G9a，而mESCs中基于MLV的前病毒元件的有效从头DNA甲基化，Suv39h1和Suv39h2对于这些过程是不必要的。

mESCs暂时性沉默的维持并不依赖于G9a。

在证明了G9a是建立XRV沉默所必需的之后，我们接下来希望确定这种KMTase是否也在mESCs中维持XRV的沉默中发挥作用，特别是考虑到我们之前的观察结果，即维持ERV的沉默需要Eset，而不是G9a(28).G9a公司条件淘汰赛(39)和整定误差CKO公司(28)mESCs与MSCV-GFP同时感染(图6A类)，和GFP−细胞，约占每个群体的50%(图6B类)在第14 PI天通过流式细胞术分离。FACS证实了这些感染池中前病毒沉默的稳定性，其中前病毒负荷大致相等(图6C类). 随后，这些GFP−用4-羟基三苯氧胺（4-OHT）处理水池，其诱导Cre-ER重组酶介导的G9a公司和整定误差分别为。引人注目，尽管删除了G9a公司对GFP的百分比没有影响+单元格，删除整定误差导致GFP百分比增加五倍+单元格(图6C类). 耗尽G9a公司和整定误差使用针对缺失外显子的特异性引物，通过qRT-PCR确认4-OHT处理的CKO细胞系中的RNA(图6D类). 此外，尽管Mage-a2杂志基因，先前显示在G9a公司−/−多功能电子稳定控制系统(29)，在删除G9a公司，在这些细胞中未观察到前病毒表达的变化(图6D类)，与流式细胞仪结果一致。相反，前病毒表达在整定误差CKO线路。综上所述，这些结果表明，尽管Eset在维持mESCs前病毒沉默中起着关键作用，但G9a在这一过程中是不可或缺的。

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在mESCs中维持前病毒沉默不需要G9a。(A类)生成包含无声XRV的细胞的模式。(B类)的池G9a公司和整定误差用流式细胞术在d4 PI和GFP分析感染MSCV-GFP的CKO mESCs−在第14PI天用FACS分离细胞。(C类)GFP公司−池与4-OHT并行处理，以诱导G9a公司和整定误差分别在删除前和删除后第7天通过FACS进行分析。平均相对前病毒载量（±SD）通过qPCR测定，所用引物针对GFP公司基因，标准化为β-主要基因(插入). (D类)从未经处理和4-OHT处理的CKO细胞中分离出RNA，并且在表达G9a、Eset、Mage-a2和MSCV-GFP（归一化为β-肌动蛋白)通过qRT-PCR测定了未处理野生型亲本的相对含量。

MEFs前体DNA甲基化的维持不依赖于G9a。

为了确定G9a是否影响体细胞类型中前病毒DNA甲基化，我们分析了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），其表达Dnmt1型，Dnmt3a1号机组、和Dnmt3b型(40). 最初的MEF培养是从携带条件等位基因的胚胎中建立的G9a公司和永生克隆显示G9a的条件耗竭和H3K9me2的伴随损失(图S6A类). 尽管MSCV-GFP前病毒在MEF中不能有效地从头甲基化(41)并且在这些细胞中不会沉默(图S6B类)，ERV在MEF中以Dnmt3b依赖方式甲基化(40). 因此，我们比较了G9a缺陷MEF和mESCs中ERV的DNA甲基化状态。虽然Southern blot分析显示MLV和IAP元件的DNA甲基化降低G9a公司−/−多功能电子稳定控制系统(图S6C类)，如前所述(27)，两种ERV的DNA甲基化在G9a公司−/−MEF公司(图S6D类). 综上所述，这些结果表明G9a在mESCs前病毒元件的从头甲基化中起着关键作用，但不需要维持mESCs或MEF前病毒元件DNA甲基化。

讨论

H3K9甲基化作用于植物和丝状真菌DNA甲基化的上游，并在这些真核生物转座元件的沉默中起着关键作用(42). 在mESCs中，ERV标记为H3K9me2和H3K9 me3(24——26)H3K9me3和这些元件的消音需要Eset(28)表明哺乳动物中也存在类似的途径。然而，奇怪的是，尽管G9a是mESCs中ERVs的DNA甲基化所必需的，与它的催化活性无关(27)，这对于保持这些元件的静音是必不可少的。相反，催化活性G9a是建立新整合XRV沉默和DNA甲基化所必需的。为了调和这些观察结果，我们提出G9a起着两个可分离但至关重要的作用：建立转录沉默（最初需要其催化活性）和从头开始的DNA甲基化（不需要）。根据这个模型，G9a的催化活性是XRV DNA甲基化所必需的，而ERV的催化活性则不需要，因为只有前者才具有最初的转录活性。

基于MLV的逆转录病毒载体与本研究中使用的载体类似，已广泛用于基因转移研究和为治疗目的传递基因(43). 尽管MLV优先整合在基因启动子区域内或附近(44)，DNA甲基化和此类载体的转录沉默经常被观察到(1)部分解释了为什么它们的疗效有限。本文的结果表明，G9a在mESCs中这种载体的沉默中发挥着重要作用，并提出了G9a在其他细胞类型中是否发挥类似作用的问题。

我们之前表明，需要G9a才能招募Dnmt3a加入ERV(27). 尽管据报道G9a与每个DNMT直接互动(45，46)，我们的结果与G9a在调节mESCs中Dnmt3a介导的从头甲基化中的作用最为一致。事实上，最近的实验表明，在mESCs中，建立与MSCV密切相关的MLV载体沉默需要Dnmt3l(47)是体内Dnmt3a2介导的从头DNA甲基化的关键调节器(48). 因此，G9a可能与Dnmt3l协同作用，促进Dnmt3a2的从头甲基化。值得注意的是，Dnmt3a2和Dnmt31l通常在体细胞中不表达，这可能解释了为什么MEF中G9a的缺失对ERV的DNA甲基化没有影响。

最近，ZFP809(15)共表达载体KAP1被鉴定为与MLV PBS结合的干细胞特异性阻遏物复合物的成分(13，14). 在KAP1缺陷的EC细胞中，MLV载体沉默的效率降低，表明该阻遏物在前病毒沉默中起重要作用。然而，在MSCV载体中，WT-PBS被tRNA互补序列取代格林(图1A类)消融干细胞特异性阻遏物结合(13，14). 鉴于MSCV载体在WT细胞中随时间而沉默，G9a依赖性沉默途径也必须在mESC中独立于PBS沉默元件运行。

虽然G9a显然是建立DNA甲基化和XRV沉默所必需的，但这种KMTase对于维持mESCs的前病毒沉默是不可或缺的。类似地，在MEF中，IAP元件的DNA甲基化依赖于Dnmt1和Dnmt3b，但不依赖于Dnm t3a(40，49)G9a不需要保持这些元素处于密集的甲基化状态。此外，与新整合的基于MLV的载体观察到的沉默缺陷相反，G9a公司−/−mESCs显示内源性MLV的表达没有增加(27). 解释为什么集成XRV在G9a公司−/−细胞，而ERV和XRV在删除G9a公司G9a耗竭后仍处于抑制状态，我们认为G9a主要通过在H3K9上沉积抑制性二甲基标记和促进Dnmt3a2向新整合的前病毒募集，从而建立前病毒沉默。

有趣的是，染色质重塑剂LSH与G9a相互作用，建立了mESCs中许多基因的沉默(50). 因为LSH也是逆转录转座子沉默所必需的，G9a可能在一个也涉及染色质重塑的途径中建立前病毒沉默。一旦建立，XRV的沉默由DNA甲基化和/或H3K9me3维持，这分别由Dnmt1和Eset以G9a-独立的方式维持。综上所述，我们的数据揭示了在前病毒沉默的建立和维持过程中，H3K9 KMTases和从头DNA甲基化之间以前未被认可的相互作用。

材料和方法

病毒感染和流式细胞术。

通过Phoenix A系统将MFG-GFP和MSCV-GFP逆转录病毒构建物导入靶细胞，并按照前面所述进行分析(28). 使用从感染细胞中分离的基因组DNA和GFP基因特异性引物，通过qPCR测定前体拷贝数。所有引物序列列于表S1。

成立G9a公司CKO MEF和mESC。

推导G9a公司CKO mESCs如前所述完成(39). 建立的协议G9a公司CKO MEF如所述SI材料和方法。

DNA甲基化分析。

根据制造商的说明，使用EZ DNA甲基化金试剂盒（Zymo Research）分离基因组DNA并进行亚硫酸氢钠转化，然后使用MFG和MSCV载体的5′LTR特异性引物进行半巢式PCR。详细协议描述见SI材料和方法如前所述进行Southern blot分析(27).

Western Blot分析、天然ChIP、RNA提取和RT-PCR

详细协议见SI材料和方法。

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢不列颠哥伦比亚大学流式细胞术和核酸蛋白服务设施以及En Li博士和Thomas Jenuwein博士提供的mESC系列。这项工作得到了加拿大卫生研究院77805（给M.C.L.）和92090（给M.C.L.和D.L.M.）的资助，以及日本教育、科学、技术和文化部的资助（给M.T.和Y.S.）。M.C.L.是迈克尔·史密斯健康研究学者基金会和加拿大健康研究院新研究员。

脚注

作者声明没有利益冲突。

*这篇直接提交的文章有一个预先安排的编辑。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/lookup/supl/doi:10.1073/pnas.1014660108/-/DC补充。

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院