DICER1缺陷诱发Alu公司年龄相关性黄斑变性的RNA毒性

摘要

在工业化国家，与癌症一样普遍的老年性黄斑变性（AMD）是致盲的主要原因^1,2与新生血管性AMD相比，更常见的萎缩型AMD缺乏有效治疗^三,4视网膜色素上皮（RPE）广泛萎缩导致严重视力丧失，称为GA，其发病机制尚不清楚。在这里，我们确定了RNase DICER1的失调（参考。5)以及由此产生的Alu公司元素，是人类基因组中最常见的分散重复的小元素⁶作为GA的潜在原因，并演示抑制这种病理学的策略体内.

GA中DICER1缺失导致RPE死亡

在患有GA的人类供体眼睛中（n=10），DICER1标准黄斑RPE中mRNA丰度降低了65±3%（平均值±SEM；P（P）=0.0036; Mann-Whitney U检验）与对照眼的比较（n=11）(图1a). 相比之下德罗莎和DGCR8mRNAs，其基因产物形成复合物，将前miRNAs加工成前miRNAs⁷，或编码Argonaute 2（AGO2）的基因，由EIF2C2系统)，miRNA效应复合物的核心成分^8,9与对照组相比，患有GA的眼睛的RPE中DICER1蛋白表达降低，但神经视网膜中DICER1蛋白表达没有降低(图1b、c和补充图1和2).

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图1

骰子1GA缺陷导致RPE变性

一,骰子1与对照组RPE（n=11）相比，GA组人眼RPE含量较少（n=10）。P（P）=0.004，通过Mann-Whitney U检验。DROSHA，DGCR8公司、和EIF2C2系统（编码AGO2）丰度无显著差异(P（P）>0.11（通过Mann-Whitney U试验）。n=10–11。b条，DICER1定量，通过Western blotting评估(补充图1)，与对照RPE（n＝4）相比，人类GA RPE（n＝4）更低。P（P）=0.003，通过学生t检验。c（c），与对照眼相比，人类GA RPE的DICER1（蓝色）降低。d、 e（电子）、眼底照片(d日)和甲苯胺蓝染色切片(e（电子）)显示RPE变性最佳1Cre；骰子1^{飞行/飞行}小鼠而非对照组。箭头指向RPE的基面。（f），扁平支架染色显示闭塞小带-1（ZO-1；红色）的RPE中断最佳1Cre；Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠与对照组比较。g、 小时、眼底照片(克)甲苯胺蓝染色切片(小时)显示RPE(g、 小时)和感光器(小时)退化骰子1^{飞行/飞行}视网膜下注射AAV1的小鼠-最佳1-Cre但不是AAV1-最佳1-GFP。我，平板显示器骰子1^{飞行/飞行}视网膜下注射AAV1后小鼠RPE变性-最佳1-Cre但不是AAV1-最佳1-GFP。用Hoechst 33342将细胞核染成蓝色。显示了具有代表性的图像。n=16–32(d–f日); 10–12 (g–i类). 比例尺(c、 e，小时)，10µm；(f、 我)20微米。j个，Cre重组酶（Ad-Cre）治疗的腺病毒载体编码减少骰子1^{飞行/飞行}与Ad-Null或未处理（无Tx）细胞相比，小鼠RPE细胞的存活率。k个，与对照反义（Ctrl-as）处理的细胞相比，DICER1反义（as）降低了人RPE细胞的活力。n=6–8。所有误差条均表示平均值±标准误差。

因为DICER1在化学应激细胞中下调⁶，我们测试了DICER1降低是否常见于垂死的视网膜。患有其他视网膜疾病（卵黄状黄斑营养不良、视网膜色素变性、视网膜脱离；补充图3). 也，骰子1在许多视网膜变性小鼠模型中，RPE的丰度没有降低，包括Ccl2公司^−/− 抄送2^−/−（参考文献。^7,8)和内容提供商^−/− 赫^−/−老鼠⁹(补充图3；补充说明). 这些数据表明，患有GA的眼睛RPE中DICER1的缺失并不是一种普通的损伤反应。

为了确定RPE中DICER1降低的后果，我们进行了杂交骰子1^{飞行/飞行}老鼠¹⁰具有最佳1Cre小鼠¹¹在RPE细胞特异性BEST1启动子的控制下表达Cre重组酶。最佳1Cre；骰子1^{飞行/飞行}小鼠均表现出RPE细胞变性，而同窝出生的对照组则没有(图1d–f). 我们还删除了骰子1在BEST1启动子的控制下，通过视网膜下注射编码Cre重组酶的腺相关病毒载体在成年小鼠RPE中¹²（AAV1型-最佳1-Cre）英寸骰子1^{飞行/飞行}小鼠(补充图4). 这些眼睛均匀地发生RPE细胞变性，而对侧的眼睛在视网膜下注射AAV1-最佳1-注射视网膜下AAV1的GFP和野生型小鼠眼睛-最佳1-Cre没有(图1g–i和补充图4). RPE细胞形态异常骰子1-耗竭的小鼠与人类GA眼睛相似(补充图5). 什么时候？骰子1^{飞行/飞行}用编码Cre重组酶（Ad-Cre）的腺病毒载体感染小鼠RPE细胞，细胞活力降低(图1j). 类似地，反义寡核苷酸介导的DICER1标准人RPE细胞中细胞死亡增加(图1k). 总之，这些数据表明DICER1失调参与了GA的发病机制。

DICER1表型并非由于miRNA失调

我们测试了耗尽其他miRNA处理酶是否会导致RPE退化。视网膜下注射AAV1-最佳1-Cre输入德罗莎^{飞行/飞行}（参考。13),图纸8^{飞行/飞行}（参考文献。^13,14)，或二氧化二银^{飞行/飞行}老鼠¹⁵没有损坏RPE(补充图6)表明miRNA失衡与DICER1缺失诱导的RPE变性无关。然而，一些miRNAs是由Dicer1独立于Drosha和Dgcr8产生的（参考文献。^16,17). Ago2是否对miRNA功能至关重要也存在争议^15,18–21.小鼠缺乏1年前,3年前，或4年前RPE正常(补充图7). TRBP（编码人目标值2)将DICER1引入四种精氨酸蛋白，以实现miRNA处理和RNA沉默（参考。22和R.Shiekhattar，个人通信）；目标值2^−/−小鼠也没有RPE变性(补充图7). 这些数据表明，RPE变性是由骰子1消融涉及一种特定于骰子1而不是一般的miRNA机器。

为了进一步研究miRNA失衡是否有助于DICER1缺失表型，我们研究了DICER1外显子5中解旋酶结构域被破坏的人HCT116结肠癌细胞。尽管HCT-DICER1中的miRNA生物生成受损^例5细胞²³，HCT-DICER1之间的基线细胞存活率没有差异^例5和亲本HCT116细胞(补充图8). 这些发现表明，DICER1缺陷导致GA发生的主要生物学效应不是miRNA失调，但不排除miRNA失调通过其他途径促进GA。

Alu公司GA中的RNA积累

由于miRNA的扰动并不牵涉在内，我们推测可能与其他dsRNA的加工受损有关。使用抗体^24,25识别长dsRNA（J2），我们在GA患者的黄斑RPE中检测到丰富的dsRNA免疫反应性（n=10；图2a-c)但对照组无（n=10；图2d). 我们用J2抗体免疫沉淀RPE裂解产物，然后使用T4 RNA连接酶辅助、基于适配器的PCR扩增策略对dsRNA进行测序。在患有GA（12/12）的人眼黄斑视网膜色素上皮中发现了大约300-nt长的dsRNA物种，但在没有GA的人眼中没有发现（0/18）(P（P）=1.210⁻⁸通过费希尔精确测试）(图2e).

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图2

Alu公司GA中RNA积累的触发因素DICER公司减少

a、 b条，RPE中dsRNA免疫定位（蓝色）(a、 b条)和次RPE矿床（drusen；b条)在人类GA中。c、 d日，GA RPE中无同种型抗体染色(c（c）)对照眼中含有抗dsRNA抗体(d日). 比例尺(a–d)，10µm。n=10(a–d)e（电子），免疫沉淀dsRNA的PCR扩增产生与Alu公司在GA RPE中，但不是正常RPE。水分控制（−）未显示扩增，重组dsRNA（+）显示预测的扩增子。（f），增加了Alu公司与对照组相比，GA RPE中的RNA（n=7）。P（P）经Student t检验<0.05。在以下方面无显著差异Alu公司神经视网膜中的RNA。正常眼睛的数值标准化为丰度。

我们从12只GA眼睛中的8只中恢复了克隆，并鉴定出两个具有高度同源性的不同序列（E=3.3×10⁻¹⁰³; 1.1×10⁻⁷⁶)至Alu公司核糖核酸(补充图9). 这些序列与Alu公司Sq亚家族共有序列。Alu公司RNA是J2-免疫沉淀GA样本中唯一明确鉴定的dsRNA转录物。我们确认J2承认Alu公司核糖核酸(补充图10). 数量急剧增加Alu公司与对照眼相比，患有GA的人眼RPE中的RNA（n=7），但神经视网膜中没有(图2f,补充图11). 参考基因组没有与这些基因完全匹配Alu公司序列。这可能归因于参考基因组中没有代表的遗传变异或区域，或嵌合Alu公司形成。进一步的研究应该阐明这些基因转录的基因组起源和调控因子Alu公司RNA。

DICER1耗尽诱导Alu公司RNA细胞毒性

我们测试了Alu公司GA RPE中的RNA积累是由于DICER1处理缺陷所致。DICER1标准反义寡核苷酸对人RPE细胞的敲除作用增强Alu公司RNA积累(图3a,补充图12). Ad-Cre感染骰子1^{飞行/飞行}小鼠RPE细胞诱导B1和B2 RNA的积累(图3b，c). DICER1在RPE细胞的细胞核和细胞质中表达，其耗竭诱导了Alu公司/两个隔室中的B1/B2 RNA(图3b–d,补充图13). 重组DICER1，但非热变性DICER1.降解Alu公司核糖核酸(图3e). 在人RPE细胞中强制表达DICER1可减少过度表达的丰度Alu公司核糖核酸(图3f)，与DICER1的降解一致体内这些数据证实DICER1失调可触发Alu公司/B1/B2 RNA积累。

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图3

DICER1标准降级Alu公司核糖核酸

一，DICER1反义（as）增加Alu公司人类RPE细胞中的RNA。b、 c（c），Ad-Cre，但不是Ad-GFP，增加了骰子1^{飞行/飞行}小鼠核内RPE细胞(b条)和细胞质(c（c）).d日，DICER1上调Alu公司人类RPE细胞核（Nuc）和细胞质（Cyt）中的RNA。e（电子），琼脂糖凝胶电泳显示重组DICER1（+）降解，而非热变性DICER1Alu公司从人类GA RPE中分离和克隆RNA。6个实验的图像代表。（f）,Alu公司人RPE细胞中RNA被质粒编码上调Alu公司（pAlu）与pNull或24小时无治疗（无Tx）相比pDICER1降低*P（P）< 0.05. n=4–8(a–d，f). 处理时标准化为对照的值（用于Alu公司)或Ad-GFP感染的细胞（对于B元件）。

因为细胞应激可以诱导广义逆转录转座子激活，我们想知道是否Alu公司GA中RNA的积累可能是视网膜死亡时的一种常见反应。然而，在患有GA的人眼RPE和DICER1缺失的人RPE细胞中，L1.3、人内源性逆转录病毒W包膜或hY3编码的RNA丰度没有增加(补充图14). 这些数据表明Alu公司RNA积累是对DICER1缺失的一种生物特异性反应。

Alu公司RNA上调由DICER1标准塔盖提毒素（一种RNA Pol III抑制剂）抑制了敲除，但α-amanitin（一种RNA-Pol II抑制剂）没有抑制敲除(补充图15). Northern印迹显示Alu公司来自患有GA的人眼RPE的RNA长度约为300-nt，与非嵌入Pol III的长度一致Alu公司抄本。我们的北方探测器专门探测到Alu公司RNA而非7SL RNA，是Alu公司Northern blotting显示GA的RPE和对照眼的7SL RNA丰度没有差异。实时RT-PCR分析表明，7SL RNA在患有GA或患有GA的人眼RPE中没有失调骰子1-耗尽的人RPE细胞(补充图16).DICER1标准敲除并没有上调几个PolⅡ转录基因(ADAR2、NICN、NLRP、SLFN11)内含外显子Alu公司序列。这些数据表明Alu公司GA眼RPE中的RNA是主要的Alu公司转录本，而不是嵌入在其他RNA中的乘客或旁观者序列。这些任务的结论性分配Alu公司作为Pol III转录本的序列必须等待其转录起始位点的精确确定。

我们测试了Alu公司RNA积累可诱导GA。用编码Alu公司（pAlu）细胞活力降低(补充图17). 两种不同编码质粒的视网膜下转染Alu公司RNAs或B1或B2 RNAs诱导野生型小鼠RPE退化(图4a,补充图17和数据未显示）。用281-nt长Pol-III衍生的重组物治疗人RPE细胞Alu公司从人胚胎癌细胞系中分离的RNA剂量依赖性地增加细胞死亡(图4b)，表明内源性DICER1降解少量Alu RNA但可能会不堪重负。因此，DICER1过度表达阻断了pAlu诱导的人类RPE细胞死亡和野生型小鼠RPE变性(补充图17).

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图4

DICER1标准保护RPE细胞免受Alu公司RNA细胞毒性

一，视网膜下pAlu，但不为pNull，诱导野生型小鼠RPE变性（眼底照片，顶行；ZO-1染色（红色）平板，底行）。b条,Alu公司RNA诱导的人类RPE细胞毒性。值标准化为pNull或vehicle*P（P）经Student t检验<0.05。n=4-6。c（c），视网膜下Alu公司从人GA-RPE中分离和克隆的RNA诱导野生型小鼠RPE变性。d日，视网膜下注射Alu公司与假叶鼠相比，用DICER1切割RNA时，未诱导野生型小鼠RPE变性（眼底照片，顶行；平板，底行）Alu公司RNA。蓝色箭头勾勒出的退化(a、 c、d). 比例尺（20µm）。n=10–15。

视网膜下注射Alu公司野生型小鼠RPE细胞的RNA(补充图18)与具有双重基序的长RNA进入细胞的能力一致²⁶.我们克隆了一个302-nt长的Alu公司用GA从人眼RPE中提取RNA并转录在体外生成模拟的部分和完全退火结构Alu公司分别由Pol III和Pol II转录的RNA。其中任何一种的视网膜下注射Alu公司RNAs诱导野生型小鼠RPE变性(图4f,补充图19)支持疾病因果关系的赋值。相反，视网膜下注射Alu公司用DICER1消化的RNA不会导致RPE退化(图4g,补充图19). 当这些Alu公司RNA受到模拟DICER1消化，它们诱导RPE退化，这表明DICER1在防止Alu公司RNA诱导的变性。

相反，在野生型小鼠中，转染转移RNA或编码7SL RNA的质粒或两种不同的初级miRNA的视网膜下转染并不会导致RPE变性(补充图20). 化学合成的模拟病毒dsRNA的dsRNA可通过激活toll样受体-3（TLR3）诱导RPE变性²⁷; 然而，pAlu转染并没有在人RPE细胞中诱导TLR3磷酸化，并且确实在第三阶段^−/−小鼠(补充图21). 因此，Alu公司RNA诱导的RPE变性不能仅仅归因于其重复性或双链性质，因为它的作用不同于其他长度相似的结构化dsRNA。

GA中RPE细胞死亡的机制尚不明确。GA已在人眼RPE细胞中鉴定出DNA片段²⁸、和骰子1敲除与诱导不同组织中的细胞凋亡有关^10,29我们现在提供了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在GA患者的人眼RPE变性区域中分裂的证据(补充图22). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解也在RPE细胞中观察到最佳1Cre；骰子1^{飞行/飞行}小鼠和inAlu公司RNA刺激或过度表达的人RPE细胞。这些数据表明Alu公司GADICER1失调引起的RNA诱导RPE细胞凋亡。

研究长链产生的小RNA物种是否存在失衡Alu公司RNAs可能导致RPE退化，我们将人类RPE细胞或野生型小鼠暴露于Alu公司RNA。这些片段的视网膜下转染并没有破坏野生型小鼠RPE细胞，并且联合应用这些片段并不能阻止pAlu诱导的RPE细胞变性(补充图23). 同样，这些片段也不能阻止由Alu公司RNA过度表达。这些数据表明Alu公司RNA而非不平衡Alu公司RNA衍生的小RNA片段负责DICER1还原诱导的RPE变性。

剖析Alu公司在DICER1缺陷的情况下，RNA积累与miRNA失调对RPE变性的影响相比，我们重新检查了HCT-DICER1^例5miRNA生物发生受损，但由于RNase III结构域的完整性，dsRNA长片段被保留的细胞。Alu公司HCT-DICER1之间的RNA水平没有差异^例5和亲代HCT116细胞(补充图24). 相反，HCT116细胞中DICER1敲除上调Alu公司RNA。也，Alu公司RNA在HCT-DICER1中诱导相似水平的细胞毒性^例5和亲本HCT116细胞，表明共存的miRNA表达缺陷不会增加Alu公司RNA诱导的RPE变性。结合射频消融术和射频消融术之间RPE退行性表型的不一致骰子1以及其他各种小RNA生物发生途径基因在小鼠中的表达，我们的发现表明Alu公司RNA积累对DICER1还原诱导的细胞毒性至关重要。

RPE变性被阻断Alu公司RNA抑制

我们测试了DICER1还原诱导的细胞毒性是否是由于Alu公司RNA积累。反义寡核苷酸靶向抑制DICER1敲低诱导的人RPE细胞毒性Alu公司RNA序列，但不通过扰乱反义控制(图5a和补充图25). Ad-Cre感染骰子1^{飞行/飞行}小鼠RPE细胞降低了细胞活力，这被靶向B1/B2 RNA的反义寡核苷酸阻断，但没有被扰乱的反义对照阻断(图5b和补充图25). 视网膜下注射减少B1/B2 RNA积累的反义寡核苷酸抑制AAV1的RPE变性-最佳1-经Cre-treated处理骰子1^{飞行/飞行}小鼠(图5c和补充图25)，提供证据体内功能性救援。

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图5

DICER1标准动态调节通过以下途径诱导RPE细胞死亡Alu公司RNA积累

一，DICER1诱导的人类RPE细胞毒性Alu公司RNA as。值标准化或与对照（Ctrl）进行比较。b条，Ad-Cre但非Ad-Null诱导骰子1^{飞行/飞行}小鼠RPE细胞毒性。B1/B2 RNA作为，而非对照（Ctrl）作为，挽救了生存能力。值标准化为未处理细胞（无Tx）*P（P）经Student t检验<0.05。n=4–6(a、 b条).c（c），视网膜下AAV-最佳1-Cre诱导的RPE变性（眼底照片中的蓝色箭头，顶行；ZO-1染色（红色）扁平支架，底行）骰子1^{飞行/飞行}注射后20天，小鼠在AAV后10天被视网膜下胆固醇结合的B1/B2-as抑制，但不被胆固醇结合的Ctrl-as抑制-最佳1-Cre注射。值规范化为Ctrl作为处理。n=8。比例尺，20µm。d日与Ctrl as相比，DICER1 as在人类RPE细胞中诱导了全局miRNA表达缺陷Alu公司as和Ctrl as处理的DICER1耗尽细胞。n=3。

我们测试了Alu公司抑制还挽救了miRNA表达缺陷，这可能是DICER1耗竭诱导的RPE变性的功能拯救的一个潜在解释。正如预期的那样，人类RPE细胞中的DICER1基因敲除减少了大量miRNAs的丰度(图5d). 然而，抑制Alu公司RNA没有恢复miRNA的表达。因此，通过Alu公司尽管存在持续的全球miRNA表达缺陷，但RNA抑制表明DICER1缺陷诱导的RPE变性是由于Alu公司RNA积累而非miRNA失调。

总的来说，这些数据支持一个模型，其中主要Alu公司转录物是RPE退化的原因。类似的病理是否也可能由尚未定义的Pol II转录物的上调引起Alu公司序列是一种有趣的可能性，需要进一步研究。重要的是，我们证明了Alu公司人类疾病的转录本升高Alu公司转录物重述了相关实验模型中的疾病，并靶向抑制Alu公司转录物成功抑制了这种病理学。这些观察结果与预防和治疗GA的临床策略直接相关。

讨论

我们的研究结果阐明了DICER1通过功能性沉默毒性而发挥的关键细胞生存功能Alu公司抄本。这种意想不到的功能表明，在解释Dicer1失调系统的表型时，应考虑RNAi非依赖性机制。例如，测试Dicer1消融术是否对小鼠神经视网膜产生细胞毒性是很有趣的³⁰和心脏³¹也可能涉及B1/B2 RNA的积累。更广泛地说，认识到DICER1迄今尚未确定的功能是来自最丰富的基因组重复元件的转录物的重要控制器，可以阐明核糖核酸酶在细胞保护监测中的新功能。DICER1在GA中表达减少，DICER的部分缺失促进RPE退化；因此杂合性缺失DICER1标准可能是GA发展的基础，其功能类似于单倍体抑癌剂^32–34.

据我们所知，这也是如何Alu公司可能通过直接的RNA细胞毒性而不是通过逆转录转座子诱导染色体DNA重排或插入突变导致人类疾病，这与α-地中海贫血等疾病有关³⁵，结肠癌³⁶、高胆固醇血症^37,38和神经纤维瘤病³⁹.未来的研究应确定Alu公司GA中积累的RNA元素以及能够实现其生物发生的转录和转录后机制的性质。

除了处理miRNAs⁵，DICER1与异染色质组装有关^40,41.自Alu公司异染色质中含有丰富的元素⁴²着丝粒沉默中的扰动是否是GA发病机制的基础。染色质重塑的发现Alu公司重复序列可以调节miRNA的表达⁴³提出了DICER1和Alu公司。在Dicer1-null小鼠胚胎干细胞中积累的着丝粒卫星重复序列是否也有待研究^44,45可能参与了GA的发病机制。

在小鼠生殖系中，Dicer1与从重复元件产生内源性小干扰RNA（endo-siRNAs）有关^46,47如果这一过程在哺乳动物体细胞组织中是保守的，那么了解内源性siRNAs是否在阻止GA的发展中起到稳态作用将是一件有趣的事情。因为caspases可以裂解Dicer1并将其转化为DNA酶，从而促进线虫的凋亡⁴⁸，我们的发现Alu公司RNA诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活使DICER1和Alu公司触发前馈疾病放大回路。

引起GA患者RPE特异性DICER1降低的刺激事件尚不清楚。潜在的罪魁祸首可能包括氧化应激，这被认为是AMD发病机制的基础⁴正如我们发现过氧化氢下调DICER1标准在人类RPE细胞中(补充图26). 虽然DICER1失调的上游触发因素和其他DICER依赖性、DROSHA/DGCR8-非依赖性小RNA在GA中的作用尚待阐明Alu公司抑制DICER1缺失诱导的RPE细胞毒性诱导的RNA反义寡核苷酸为研究Alu公司RNA抑制或DICER1增强作为GA的潜在治疗方法。

方法总结

使用Pico注射器（PLI-100，哈佛仪器）进行视网膜下注射（1µL）。质粒转染体内使用10%Neuroporter（Genlantis）。使用dsRNA抗体（克隆J2，English&Scientific Consulting）、DICER1（Santa Cruz Biotechnology）、zonula occludens-1（Invitrogen）、Cre重组酶（EMD4Biosciences）或裂解caspase-3（Cell Signaling）进行免疫标记。用40µg J2在4°C下免疫沉淀均质组织裂解物16小时，分离出dsRNA。纯化的dsRNA与锚定引物连接，并通过MinElute凝胶萃取柱（Qiagen）纯化。将连接的dsRNA变性、反转录并通过PCR扩增。扩增的cDNA产物克隆到PCRII TOPO载体（Invitrogen）并测序。与…相同Alu公司使用CENSOR确定一致序列。使用CellTiter 96水溶液细胞增殖试验（Promega）评估细胞活力。使用qScript cDNA SuperMix（Quanta Biosciences）逆转录总RNA（1µg），并使用Power SYBR绿色主混合物通过实时定量PCR（Applied Biosystems 7900 HT）进行扩增。相对表达由2^-ΔΔCt方法。使用All-in-One™miRNA qRT-PCR检测试剂盒（GeneCopoeia）定量miRNA丰度。

完整的方法任何相关的参考文献都可以在论文的在线版本中找到，网址为www.nature.com/nature（自然）.

方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类