厄洛替尼抑制EGFR-STAT3信号通路可预防化学诱导小鼠口腔鳞癌模型的致癌

摘要

简介

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种毁灭性疾病，其死亡率约为50%，几十年来一直没有改变(1). 除了高复发率外，HNSCC还与第二原发性肿瘤（SPT）的频繁形成有关，每年3-7%，是所有恶性肿瘤中最高的(2). SPT的高发病率归因于“田间癌变”的发生，“田间癌化”是斯劳特发明的一个术语，等。定义暴露于致癌物后上呼吸道粘膜的整体分子变化(三). 因此，HNSCC是化学预防的一个特别合适的靶点。化学预防剂可以作为恶性病变前期患者或患有HNSCC且有复发和/或SPT高风险的患者的适当治疗。如果该药物安全且无重大副作用，也可考虑用于HNSCC的一级预防。

根据早期观察，维生素A缺乏的牛更容易发生上消化道和肺部肿瘤(4)，研究大剂量维甲酸类药物作为HNSCC的化学预防治疗，证明其在延缓人类致癌方面具有疗效，但与相当大的毒性相关(5,6). 自那时以来，涉及可耐受剂量的维甲酸类药物的权威性试验并没有一致证明可以预防HNSCC(7,8). 显然，需要确定预防HNSCC的新方法。最近的临床试验证明，HNSCC的化学预防已采用绿茶(9-11)和大豆衍生的Bowman-Birk抑制剂(12). 研究环氧合酶（COX）-2和表皮生长因子受体（EGFR）抑制在HNSCC化学预防中的潜在作用目前也在进行中(13). 在本研究中使用的临床前致癌模型中，其他已证明对预防致癌有效的化合物包括雷帕霉素(14)和血管生成抑制剂ABT-510(15).

在当前的研究中，我们重点关注EGFR-STAT3信号通路。EGFR是ErbB受体家族之一，在80%以上的HNSCC肿瘤中过度表达，是HNSCC患者预后不良的标志(16). 最近的一项研究发现，EGFR基因拷贝数可用于预测口腔癌前病变向口腔鳞癌的进展(17). Erlotinib（Tarceva™）是一种EGFR-靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI），在HNSCC的临床试验中表现出良好的前景，目前正处于治疗该疾病的临床试验的后期阶段。EGFR抑制剂吉非替尼的化学预防活性最近在肺癌动物模型中得到证实(18). 在HNSCC动物模型中的类似观察将为正在进行的研究EGFR抑制剂作为HNSCC化学预防治疗的临床前试验提供进一步的基础(19-21). STAT3通过EGFR介导信号传导，调节控制细胞周期和凋亡的基因表达(22). STAT3在大多数HNSCC肿瘤中具有组成性活性，在HNSCC临床前模型的生长和存活以及细胞转化中发挥重要作用(23). 已经研究了具有STAT3抑制特性的各种药物在治疗HNSCC中的潜在用途，但尚未批准临床使用(22). 骨胶原是从Commiphora mukul公司植物，含有guggulsterone，一种具有类固醇结构的化合物(24). 已发现该化合物在各种临床前模型中具有抗癌活性(25)，降低HNSCC细胞系和肿瘤异种移植物中STAT3的水平，抑制肿瘤生长，增强EGFR-靶向治疗的抗肿瘤活性(26). 此外，guggulsterone在临床试验中的安全性(27)而廉价的临床制剂，如guggulipid（新泽西州皮斯卡塔韦Sabinsa公司）的可用性，使其成为化学预防的合理候选药物。

与化学预防药物临床试验相关的无数挑战和成本强调了临床前研究的重要性，以提供将特定药物用作化学预防治疗的生物学原理。While期间在体外研究对于确定致癌过程中的分子改变是很重要的，这种改变可以被特定的药物靶向，然而，真正的癌症预防临床前证据需要体内使用一个重述人类致癌过程的模型进行调查。4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）是一种致癌物质，可诱导DNA加合物的形成。研究表明，给小鼠口服4-NQO会导致发育不良损伤，最终导致肿瘤形成(28). 此外，已发现由此产生的口腔鳞状细胞癌在组织学和分子变化方面与人类HNSCC相似，这些变化通常是人类HNSCCs的特征，包括EGFR和细胞周期调节因子p16水平的变化(29). 这种致癌物已被用于通过局部应用在大鼠和小鼠中诱导HNSCC。最近，通过在动物的饮用水中给药，已经获得了最佳的肿瘤形成(29).

在当前的研究中，我们使用4-NQO诱导的小鼠口腔癌变模型，研究了EGFR-靶向剂厄洛替尼和具有STAT3抑制活性的天然产物guggulipid的化学预防特性。我们发现，虽然guggulipid对抑制口腔癌的发生无效，但厄洛替尼可减少口腔异型增生病变的形成。

材料和方法

动物治疗

雌性CBA/J小鼠（5-6周；Jackson Laboratories）在开始4-NQO治疗之前，用对照饮食或其中一种含药物饮食治疗2周，在4-NQ0治疗期间，用1.5周。此时，由于4-NQO与厄洛替尼或格鲁匹特联合使用的意外毒性，停止服用含药物饮食，并在4-NQ0治疗8周后恢复服用。通过解冻储备溶液，在丙二醇中稀释至12.5 mg/ml，并向每瓶250 ml消毒水（最终浓度为100μg/ml）中添加2 ml，制备含4-NQO的水。制备含4-NQO的水，每周更换一次，持续8周。每个治疗组有4只小鼠接受特殊饮食，但其水中没有4-NQO。图1描述了动物治疗的时间表。

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图1

动物治疗的时间表。这项研究的目的是允许使用含药物饮食进行两周的预处理，然后同时服用含药物饮食和4-NQO 8周。在服用4-NQO一周半后，由于毒性，含药物饮食被停止，并在完成4-NQO8周后恢复。研究结束时，对动物实施安乐死，并采集舌头。

结果

4-NQO与厄洛替尼或格鲁匹特联合用药的毒性

为了最大限度地暴露于厄洛替尼和谷粒苷，并尝试对口腔致癌进行初级预防，在4-NQO给药之前，对小鼠进行了两周的药物补充饮食治疗。计划继续服用特殊饮食，但由于含药物饮食和4-NQO的组合出现意外毒性，因此无法继续服用。经过1.5周的4-NQO治疗并结合特殊饮食，厄洛替尼组80只小鼠中有28只突然死亡，格鲁匹特组80只鼠中有5只突然死亡(图2a). 两组小鼠的平均体重均下降(图2b). 单独服用4-NQO水（对照饮食）或不服用4-NQA的特殊饮食组均未发生死亡。因此，这些死亡是由4-NQO与古古利肽或埃洛替尼联合使用的意外毒性引起的。在接受4-NQO治疗的小鼠中，立即停止含药饮食，并在4-NQ0治疗8周后恢复。虽然在停用含药物的饮食后，死亡率显著下降，平均体重增加，但在实验过程中死亡的小鼠数量更多(图2a). 将4-NQO与埃洛替尼合用后死亡的其中一只小鼠尸检显示出血性胃肠炎（数据未显示）。

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图2

4-NQO与含药物饮食结合的毒性。A.绘制了研究期间未被故意处死的小鼠百分比。B.在整个研究过程中，动物大约每周称重一次。

该模型中病变发展的动力学

4-NQO治疗完成后5周对小鼠舌头的检查表明，对照组129只小鼠中有9只小鼠出现了大体检查可见的口腔肿瘤，guggulipid组75只小鼠中只有5只（约7%）出现了口腔肿瘤(图3a). 厄洛替尼组此时未发现肿瘤。从4-NQO治疗后5周开始，每周从对照组的小鼠中取样，并检查其舌头的H&E染色部分是否存在发育不良和肿瘤病变(表1). 到4NQO后7周，10/10只小鼠出现发育不良或肿瘤性病变。该采样的基本原理是，当10/10只小鼠出现病变时，控制组中至少80%的其余小鼠也会出现病变的概率为0.89。其余小鼠于4-NQO后8周处死。

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图3

4-NQO引起的口腔病变的大体和组织学外观。A.对照组的典型肿瘤，致癌物治疗后7周，位于舌背（左侧）、右侧边缘（中部）和左侧边缘（右侧）。箭头表示肿瘤。B.正常舌、C.4-NQO诱导的轻度异型增生、D.4-NQO-诱导的中度/重度异型增生和E.4-NQO诱导的鳞状细胞癌的显微照片。

表1

对照组小鼠的发育异常和肿瘤病变发生率。

致癌物后数周	总计#	正常	轻度至重度异型增生	侵袭性SCC
5	4	1/4	3/4	0/4
6	9	0/9	9/9	0/9
7	10	0/10	9/10	1/10

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Erlotinib（而非guggulipid）可防止4-NQO治疗小鼠轻度口腔异型增生以外的疾病进展

将4-NQO后8周处死的小鼠的舌头石蜡包埋并完全切片到载玻片上。每10张幻灯片都进行H&E染色，并由一名对治疗组不知情的研究人员进行检查。

该研究旨在比较各组中癌前病变和肿瘤性病变的发生率与正常舌的发生率。每只老鼠都是根据其舌头上发现的最严重的病变进行分类的。然而，在盲法组织学检查中，很明显，绝大多数小鼠至少有轻度异型增生。在这一点上，我们决定，轻度异型增生，一种不一定是人类癌前病变的病变，应被视为与该模型中正常舌的同一类别。事实上，在研究结束时，发现只有少数（每组4只）接受含药物饮食治疗但从未接受过4-NQO治疗的小鼠，至少没有轻度异型增生（即完全正常）。图3a显示典型肿瘤的大体外观。代表性病变的组织学表现如图3b-e.

图4显示了各组中发育不良和肿瘤病变的发生率。对照组78.9%的小鼠被发现有比轻度异型增生更严重的病变，而厄洛替尼治疗组只有24.4%的小鼠有这种病变，总体下降69%（p<0.001）。谷粒肽治疗组80.6%的小鼠有比轻度异型增生更严重的病变。与对照组的发病率相比，这一微小的增加没有统计学意义。

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图4

对照组、厄洛替尼组和谷粒苷治疗组的癌前病变和恶性病变发生率。对各组小鼠舌头的H&E染色切片进行癌前病变（中度和重度异型增生）和恶性病变的检查。厄洛替尼治疗组的此类病变数量减少（p<0.001）。

侵袭性鳞状细胞癌的发病率不一定属于同一模式。对照组14.7%的小鼠舌上观察到鳞状细胞癌，厄洛替尼组12.19%，格鲁匹特组27.5%。这在一定程度上是因为SCC小鼠数量很少（例如厄洛替尼组中只有5只SCC），因此这种比较不可靠。此外，许多SCC都非常小，例如只在一张幻灯片上捕获。一般来说，SCC患者的舌头上也检测到中度和重度异型增生，进一步支持了将所有大于轻度异型增生的病变合并为同一类别的分析理由。

选定病变的免疫染色

在本研究中，对EGFR-STAT3信号轴抑制剂进行了测试，用免疫组织化学方法对各组中异型增生和鳞状细胞癌分布大致均匀的舌头（对照组共30个，厄洛替尼组10个，古珠蛋白组20个）进行了STAT3特异性抗体染色。同样，由于一些病变非常小，尽管在H&E和免疫染色中使用了相邻的切片，但H&E染色中看到的一些病变在免疫染色载玻片上没有看到。特别是厄洛替尼组的SCC染色数量非常少（n=3），因此IHC数据比较SCC是不可靠的，并且显示出很大的差异。另一方面，在比较增生异常病变时，与对照组相比，厄洛替尼和古珠蛋白治疗组STAT3的表达轻度下降，但无统计学意义(图5). 同样，缺乏统计显著性可能是由于各组中发育不良病变的数量较少（载体：n=22，埃洛替尼：n=7，胶球蛋白：n=12）。此外，各节段之间的色斑强度差异不大，因此，所有节段（不考虑组）的得分都在70到180之间，尽管可能的得分范围为0-300，这导致组间的数量差异很小。

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图5

4-NQO诱导的异型增生中STAT3水平。用STAT3染色的溶媒（A）、埃洛替尼（B）和鹅膏菌（C）治疗组动物舌头上出现的各组具有免疫染色中位数的异型增生病变的显微照片。D.各组免疫染色分数的图形描述（溶媒与厄洛替尼的p=0.11，溶媒与鼠疫的p=0.41）。

除了检测STAT3外，我们还对这些切片进行了pMAPK和pAKT染色，这两种蛋白质也是EGFR的下游。然而，免疫组织化学检查显示，与对照组相比，厄洛替尼治疗组的pMAPK和pAKT没有显著降低。在致癌过程中，这些蛋白的表达也没有随着时间的推移而显著变化，正如在4-NQO治疗后5、6和7周对对照组小鼠的组织进行取样的水平比较所观察到的那样（数据未显示）。

讨论

本研究检测了古古利匹德和厄洛替尼作为HNSCC潜在的化学预防疗法。埃洛替尼已被证明是治疗HNSCC的活性剂(30). 在HNSCC的临床前模型中，Guggulipid显示出抗癌活性(26). 4-NQO诱导的口腔癌变模型为我们提供了检验这些药物化学预防活性的机会。埃洛替尼能显著抑制从轻度异型增生到癌前病变和恶性病变的进展，与对照组相比，这些病变的发生率降低了69%。另一方面，Guggulipid在该模型中不抑制口腔癌的发生。

用4-NQO诱导的小鼠口腔鳞状细胞癌模型研究了几种药物的化学预防特性(14,15,28,29). As 4-NQO诱导DNA加合物的形成，并最终导致组织学和分子生物学上与人类头颈部癌变相似的异常增生和肿瘤病变(28,29)据认为，该模型适用于检测潜在的化学预防剂。在确定对人类有效的化学预防疗法方面，该模型中的结果是否可翻译，尚待临床试验确定。正在进行的关于厄洛替尼对人体化学预防活性的研究可能有助于了解使用4-NQO模型得出的结果的可译性(19,20).

在当前的研究中，在动物饮食中施用厄洛替尼和谷胶肽。这种给药方法已被用于各种研究潜在化学预防剂的研究，并且以前也被用于输送谷朊病毒，显示谷朊菌降低胆固醇和抗糖尿病活性标记物的作用(31,32). 观察到含埃洛替尼的饮食对致癌作用的抑制作用，以及当与4-NQO同时服用时，两种含药物的饮食比单独使用致癌物的毒性更大，这一事实证实了每种药物都是在饮食中提供的。事实上，与绕过大部分口腔的经口灌胃相比，在饮食中施用每种药物可能有助于更好地接触动物的口腔粘膜。此外，机构动物护理和使用委员会（IACUC）不允许在本研究的延长期内每天进行口腔灌胃，因为这会对动物造成相当大的口腔和咽部刺激，造成安全隐患。添加到饮食中的厄洛替尼的剂量是基于未发表的研究中发现的长期耐受性（个人通讯-罗纳德·卢贝特博士，NIH）。根据HNSCC异种移植模型中发现的抗癌活性和STAT3抑制活性，选择了guggulipid的剂量(26)以及基于Sabinsa Corp.的hplc数据，描述了guggulisterone在guggulipid中的浓度。在目前的研究中，在致癌物出现之前就开始服用含药物的饮食，以最大限度地释放每种潜在的化学预防剂，并试图确定其最大的化学预防活性体内此方法与人类使用化学预防疗法的时间框架不相似。在致癌开始后服用预防剂可以增强未来研究的转化潜力。出于类似的原因，该研究在对照组的大多数动物出现癌前病变而非恶性病变的时候终止，以避免等到对照组和治疗组的大部分动物出现癌症，这可能掩盖了较小的化学预防效果。

众所周知，EGFR-STAT3信号轴在HNSCC的生长和生存中起着关键作用(33). EGFR的表达已被用于预测从癌前病变到口腔鳞癌的进展(17). 此外，在4-NQO诱导的模型中，EGFR水平升高，类似于人类HNSCC(29). 这让我们假设，抑制EGFR的厄洛替尼和含有谷甾酮的谷固醇肽（抑制EGFR下游的STAT3分子）都可以在这个模型中阻止口腔癌的发生。

该研究确实证明了厄洛替尼的化学预防活性。在该组中，与载体相比，发生恶性或癌前病变的小鼠减少了69%。服用厄洛替尼后，仅观察到感兴趣的分子靶点STAT3出现轻微下降，但无统计学意义。厄洛替尼治疗成功抑制SCC的形成，以及厄洛替尼可与4-NQO联合使用的毒性导致小鼠死亡，不幸的是，厄洛替尼治疗组可用于染色的病变数量较少，检测STAT3表达差异的能力也很低。染色强度的总体变异程度也较低，导致各组之间的免疫染色得分差异较小。

在本研究（每组4只小鼠）和之前的一项研究中，在不含致癌物的情况下，单独服用厄洛替尼或格鲁匹德的小鼠没有出现任何毒性，并且在之前的研究中，每组5只小鼠都测试了含药物的饮食（数据未显示）。这些特定条件包括联合给药4-NQO，其本身已知有毒，不应用于推断厄洛替尼或格鲁匹德对人类的毒性信息。埃洛替尼已经用于临床试验，并且已知有某些副作用，最显著的是皮肤毒性(34). 例如，对于已经有HNSCC SPT高风险的患者来说，皮肤毒性可能是可以接受的，或者较低、毒性较小的剂量可能足以进行化学预防性治疗。

骨胶原是一种安全、廉价的天然产物，但在这种特殊的模型中，它对抑制口腔癌的发生无效。在给药剂量下，埃洛替尼肯定是一种比谷胶肽更特异、可能更有效和/或生物利用性更强的化合物。厄洛替尼与4-NQO的联合毒性更大，这也支持了这一点(图2a和2b)通过厄洛替尼与人类副作用的相关性，以及与guggulipid相对安全性的比较。谷固醇是一种植物提取物，含有多种成分，包括谷固醇酮，众所周知谷固醇本身具有多种潜在的分子靶点。谷甾酮的许多可能的分子靶点包括各种核受体下游的靶点，如与之结合的法尼受体、孕酮受体、雌激素受体-α和孕烷受体(35). 对这些靶点的作用可能会抵消guggulsterone介导的STAT3抑制所显示的抗癌活性在体外(25). 在本研究中，由于guggulipid没有抑制致癌作用，并且由于上述检测STAT3变化的局限性，只有guggulip加4-NQO的毒性相对增加，而非仅4-NQ0，才提供了guggulpid释放的证据。很可能更高剂量或不同的guggulipid给药方法对STAT3的影响更大。然而，先前使用HNSCC异种移植模型的研究表明，与本研究中使用的guggulipid剂量相同，STAT3减少(25).

目前的研究证明靶向EGFR是一种化学预防HNSCC的策略。事实上，目前正在进行各种临床研究，调查EGFR抑制剂的这种潜在用途(19-21). Erlotinib已知的毒性对确定HNSCC高危但目前没有HNSCC的患者长期服用的合适剂量提出了挑战。然而，如果厄洛替尼被发现对人类具有化学预防活性，对于那些因接触史、癌前病变或先前诊断为HNSCC而面临这种经常致命的恶性肿瘤高风险的患者来说，这将是一个重要的治疗机会，目前还没有批准的预防治疗。

致谢

参考文献