Cvt Pathway负责Ape4的真空定位
蛋白质编码YHR113W型是一种酵母天冬氨酰氨肽酶，其底物特异性和氨基酸序列与哺乳动物天冬氨酸氨肽酶相似（酶代码EC3.4.11.21）(25,26). 因此，我们在下文中将其称为Ape4。酵母相互作用体网络的综合酵母双杂交分析表明，Ape4可以与Atg19和Ape1结合(33,34). 因此，我们假设Ape4可能通过Cvt途径转运到液泡。为了对Ape4进行生化分析，我们制备了针对重组全长Ape4的多克隆抗体。免疫印迹分析表明，亲和纯化的抗Ape4抗体特异性地识别了野生型细胞粗酵母提取物中的55-kDa蛋白，该蛋白与预测的Ape4分子量非常吻合(一个,车道2). 介绍APE4类多拷贝质粒上的基因导致55-kDa蛋白水平升高(一个,车道3)确认抗体识别Ape4蛋白。在中未检测到此波段类人猿4Δ菌株虽然有微弱的非特异性条带，包括一条接近Ape4的55-kDa条带，但在较长时间暴露于x射线胶片上时仍能看到(一个,车道1,4、和5). 我们使用抗Ape4抗体，通过液泡分离和蛋白酶保护试验检测Ape4的液泡定位。在这个实验中，我们在一个第四人民党Δprb1型Δ背景菌株，其中两个主要的液泡蛋白酶基因，政治公众人物4和项目风险评估1删除，以在货物蛋白到达液泡时稳定三重HA标签。酵母细胞在富培养基中生长，并通过Ficoll浮选分离液泡。液泡制剂第四人民党Δprb1型通过标记蛋白Prc1的前体2（p2）形式的免疫印迹，通过液泡蛋白分选途径到达液泡，Δ细胞使液泡部分纯化39倍(B类,车道1 对 车道2)而胞浆污染相对较少（Pgk1，0.40倍纯化）。与p2Prc1类似，Ape1的前体形式积聚在液泡部分，表明Cvt途径正常发生(B类,车道1 对 车道2). 我们观察到HA三-Ams1和Ape4也集中在这一部分(B类,车道2). 为了验证Ape4是否进入液泡腔，我们使用分离的液泡进行了蛋白酶保护试验。在不含或含有1%Triton X-100的情况下，用蛋白酶K处理液泡部分。在该组分中发现的Pgk1对外源添加的蛋白酶敏感，即使在没有洗涤剂的情况下，也表明一小部分胞浆与液泡共分馏，而不是Pgkl进入液泡腔(B类,3–5车道). 相反，大多数Ape4对外源性添加的蛋白酶具有抗性，并且只有在洗涤剂存在的情况下才能完全消化，这与其他液泡蛋白一样，表明Ape4定位在液泡腔中(B类,3–5车道).
天冬氨酰氨肽酶Yhr113w/Ape4位于液泡内。 一个，野生型(重量; SEY6210）含有任一空载体（pRS424；车道2和5)或APE4类多拷贝质粒（pRS424-Ape4；车道3)和类人猿4含有空载体（pRS424；车道1和4)在SC-Trp培养基中生长。蛋白质提取物相当于0.1一个600纳米细胞单位进行SDS-PAGE，然后用抗Ape4抗血清进行免疫印迹分析。箭头表示非特异性蛋白质。B类，从第四人民党Δprb1型Δ (1–5车道)和在g1Δ第四人民党Δprb1型Δ (6–10车道)含有HA的细胞三-Ams1质粒（pTS544）在不存在或存在1%Triton X-100的情况下，用蛋白酶K处理或不使用蛋白酶K处理。用抗Prc1探针对相当于10μg蛋白质的样品进行免疫印迹分析(上部面板)，抗猿1(中上部面板)，抗HA(中间面板)，抗猿4(下部中间面板)和抗Pgk1(下部面板)抗血清或抗体。T型(车道1和6)，总细胞裂解物。
接下来我们从第19天Δ第四人民党Δprb1型Δ细胞检测Ape4的空泡定位是否依赖于Cvt通路。Atg19仅是Cvt货物蛋白prApe1和Ams1的受体；因此，Atg19是Cvt途径所必需的，但不是标准的(即饥饿依赖）自噬或空泡蛋白分选途径。在这些细胞中，p2Prc1，而不是prApe1或HA三-Ams1在液泡部分正常积累，证实Cvt通路被特异性阻断(B类,车道6 对 车道7). 与prApe1和HA类似三-Ams1，Ape4在液泡部分的积累在第19天Δ第四人民党Δprb1型Δ电池(B类,车道2 对 车道7). 这些结果表明，Ape4以Atg19依赖的方式转运到液泡。
为了确认Ape4的液泡定位，我们决定使用荧光显微镜检查Ape4定位。因此，我们构建了一个嵌合体，其中N末端GFP标记的Ape4由其内源性启动子表达，从而使我们能够分析其在生理条件下的亚细胞定位。当野生型细胞在富含营养的培养基中生长时，GFP-Ape4信号在胞浆中扩散，但在一些细胞中，也在液泡中观察到，液泡被标记为FM4-64，是液泡膜的红色荧光探针(一个). 还有一个突出的空泡周围点状突起，可能与PAS相对应（见下文）。在这种情况下，GFP-Ape4的液泡定位不太明显，因为信号在液泡腔内相对微弱且弥散。因此，我们检查了第四人民党Δprb1型Δ菌株中，液泡蛋白酶活性显著降低，从而在液泡腔中积聚液泡下小泡（该菌株在单膜自噬体和Cvt小泡与液泡限制膜融合而导致的Cvt体的分解中有缺陷）。正如预期的那样，我们能够在该菌株中观察到GFP-Ape4斑点在液泡腔中移动，这是由FM4-64荧光所描绘的(一个). 通过氮饥饿诱导自噬3小时后，GFP-Ape4的空泡定位在第四人民党Δprb1型Δ应变；GFP-Ape4点的数量增加(B类).
荧光显微镜显示GFP-Ape4的液泡周围和液泡定位。 一个，野生型(重量; SEY6210）和第四人民党Δprb1型表达GFP-Ape4的Δ（YMY105）细胞在SC-Trp培养基中用空泡膜标记物FM4-64标记20分钟，在同一培养基中追踪2小时。标记细胞在SD（-N）中进一步饥饿3小时。酒吧，2微米。B类在每种条件下，在荧光显微镜下对100个细胞进行计数，以确定GFP-Ape4标记的液泡下小泡的数量。这些值显示了单个(1)或多个（>1)GFP标记的空泡下小泡和不带GFP标记小泡(0).驾驶员信息中心差分干涉对比度。
接下来，GFP-Ape4的液泡转运通过生物化学GFP处理试验得到证实，该试验依赖于GFP融合蛋白中GFP部分以液泡蛋白水解依赖的方式释放；游离GFP对液泡蛋白酶具有相对抗性，其产生可用于监测嵌合体的液泡递送(35). 我们在野生型和第四人民党Δprb1型Δ单元。在营养丰富的条件下，在野生型细胞和全长GFP-Ape4中检测到一条与27-kDa游离GFP对应的蛋白带(一个,车道3). 相比之下，在第四人民党Δprb1型Δ电池(一个,车道5). 这些结果表明，GFP-Ape4的一部分被转运到液泡并被液泡蛋白酶处理。此外，GFP-Ape4处理在野生型细胞中增加，但在第四人民党Δprb1型氮饥饿条件下的Δ细胞，表明氮饥饿增强了其液泡转运(一个,车道4和6). 因为GFP-Ape4丰度低，很难减少非特异性背景带(一个,车道1和2)，我们还表达了来自CUP1大学促进剂来证实其加工过程。我们发现得到的结果基本相同：游离GFP以依赖于液泡蛋白水解的方式出现，而氮饥饿激活了这一过程(B类,3–6车道).
GFP-Ape4向液泡输送的生化分析。 一个，使用空载体（pRS414）转化野生型菌株（SEY6210；矢量;车道1和2). 野生型(重量; 6210瑞典克朗，车道3和4)，第四人民党Δprb1型Δ（YMY105；车道5和6)，在g1Δ（WHY1；车道7和8)，第11天Δ（YTS147；车道9和10)，第19天Δ（SSY31；车道11和12)、和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1Δ（YMY103；13号车道和14)用编码GFP-Ape4（pTS572）的质粒转化细胞。细胞在SC-Trp培养基中生长(N个+;车道1,三,5,7,9,11、和13)在SD（-N）中饥饿3小时(N个−,车道2,4,6,8,10,12、和14). 蛋白质提取物相当于0.1一个600纳米细胞单位进行SDS-PAGE，然后用抗YFP免疫印迹分析(上部面板)和抗Pgk1(下部面板)抗体和抗Ape1(中间面板)抗血清。B类，使用空载体（pRS416）转化野生型菌株（SEY6210；矢量;车道1和2). 野生型(重量; 6210瑞典克朗；车道3和4)，第四人民党Δprb1型Δ（YMY105；车道5和6)，atg1处Δ（WHY1；车道7和8)，第11天Δ（YTS147；车道9和10)，第19天Δ（SSY31；车道11和12)、和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1Δ（YMY103；13号车道和14)用表达GFP-Ape4的质粒转化细胞CUP1大学启动子（pTS555）。细胞按照中所述进行生长和分析一个使用ImageJ软件对条带进行量化，GFP-Ape4的百分比(灰色)和GFP(黑色)绘制了。
我们通过检测GFP-Ape4的转运是否依赖于Cvt途径来扩展这一分析。Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对Cvt途径和饥饿诱导的自噬都是必需的。正如预期的那样，GFP-Ape4在atg1处Δ细胞处于营养丰富或饥饿状态(,一个和B类,车道7和8). 与Atg1相反，Atg11是酵母选择性自噬所必需的，包括Cvt途径、pexophagy和有丝分裂，但对饥饿诱导的自噬并不必要(36,37). 在Cvt途径中，Atg11与Atg19相互作用，将Ape1-Atg19-Ams1复合物定位于PAS(13). 删除ATG11型或ATG19型在富营养条件下抑制了GFP-Ape4的加工，并且该块部分被氮饥饿所挽救(,一个和B类,9–12车道). 同样，删除APE1接口在营养丰富的条件下完全影响GFP-Ape4的转运(,一个和B类,车道13)尽管饥饿状况只略有下降(,一个和B类,车道14). 这些结果表明，Ape4通过Cvt途径选择性地转运到液泡。在内源性启动子的控制下，所有表达GFP-Ape4的菌株中也出现了60kDa的小蛋白带(一个,3–14车道). 这表明GFP-Ape4的一小部分在细胞质中被裂解，尽管其机制尚不清楚。
Ape4以Cvt途径依赖的方式进行有限的蛋白质水解
横山等。(26)据报道，Yhr113w/Ape4被蛋白酶切割而不丧失酶活性；尽管没有提供机械方面的见解。因此，我们检测了Ape4的裂解是否依赖于液泡蛋白酶。抗Ape4抗体的免疫印迹分析显示，野生型细胞中出现24-kDa（裂解形式1（CF1））和31-kDa（CF2）蛋白带，以应对氮饥饿(一个,车道4). 在YPD的营养生长期间也检测到Ape4 CF1，尽管它非常微弱（CF2甚至没有检测到）(一个,车道3). Ape4的分裂形式没有出现在第四人民党Δprb1型Δ和atg1处Δ细胞和第11页Δ和第19天Δ电池(一个,车道5–12). 当GFP-Ape4从CUP1大学启动子的铜浓度通常包含在SC或SD（-N）培养基中：裂解形式和游离GFP均以自噬依赖的方式生成(补充图S1). 这些结果表明，Ape4主要通过选择性自噬途径到达液泡。当选择性途径受损时，非选择性途径可能有助于Ape4在饥饿条件下的液泡定位(例如在里面第11天Δ或第19天Δ应变）。
Ape4以液泡蛋白水解和自噬依赖的方式进行有限的切割。 一个，的类人猿4Δ（YMY111；车道1和2)，野生型(重量; 6210瑞典克朗；车道3和4)，第四人民党Δprb1型Δ（YMY105；车道5和6)，atg1处Δ（WHY1；车道7和8)，第11天Δ（YTS147；9号车道和10)，第19天Δ（SSY31；车道11和12)、和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1Δ（YMY103；13号车道和14)细胞在YPD培养基中生长(车道1,三,5,7,9,11、和13)并在SD（-N）培养基中饥饿3小时(车道2,4,6,8,10,12、和14). 细胞提取液（0.1一个600纳米细胞当量）用抗Ape4抗体进行免疫印迹分析(上部面板)和抗猿1(中间面板)抗血清和抗Pgk1(下部面板)抗体。一个单点和双点分别表示CF1和CF2。使用ImageJ软件对CF1和Pgk1进行量化。CF1的带强度由Pgk1的带密度归一化，并绘制出与SD（-N）处理的WT相关的图。误差线表示三个独立实验的S.D。B类，的类人猿4Δatg1处Δ（YMY112）细胞转化为atg1处ts秒质粒（pAtg1ts秒)和表达GFP-Ape4的质粒杯1启动子（pTS555）。该菌株在SC-Ura-Trp培养基中生长，并在SD（-N）中在23°C的允许温度下饥饿3 h。转移到39°C的非允许温度后，在指定的时间点收集样品，并使用抗Ape1抗体进行免疫印迹分析(上部面板)和抗猿4(中间面板)抗血清和抗Pgk1(下部面板)抗体。佛罗里达州，全长。箭头表示非特异性蛋白质。
虽然Ape4的裂解形式保持了天冬氨酰氨肽酶的活性(26)，这种形式可能在液泡腔中不稳定。为了验证这一假设，我们监测了Ape4裂解形式在阻断自噬后的数量变化atg1处ts秒过度表达GFP-Ape4的突变株。在atg1处ts秒细胞在SD（-N）培养基中以允许的温度饥饿5h，然后转移到39°C的非允许温度，以防止新生的GFP-Ape4蛋白通过自噬进入液泡。在几个时间点，通过免疫印迹法测定Ape4物种和Ape1蛋白的数量。随着时间的推移，Ape4裂解形式的蛋白质水平略有下降，但下降与Ape1类似真诚地液泡蛋白(B类). 内源性Ape4产生的裂解形式基本上表现出相同的稳定性(补充图S2). 这些结果表明，与Ape1类似，Ape4稳定地存在于液泡中。
Ape4在与Ape1和Ams1绑定站点不同的站点与Atg19交互
因为Atg19有助于Ape4向液泡的转运，我们验证了Ape4是否与Atg19相互作用。为此，我们首先使用酵母双杂交系统。这个第19天用编码Ape4和全长或突变Atg19的双杂交质粒转化Δ测试菌株。然后对转化菌株进行测试镀锌4-依赖性转录激活ADE2型和lacZ公司基因。对照组使用编码Ape1和Ams1的质粒。Ape1和Ams1分别与Atg19的螺旋结构域和C末端结构域相互作用(13). 正如预期的那样，Ape1与本研究中使用的野生型和突变型Atg19表现出强烈的相互作用，所有Atg19都包含卷曲螺旋结构域(一个). Ams1与全长Atg19和Atg19（1–387）相互作用，但不与Atg19或Atg19相互作用（1–269），证实C末端区域负责Ams1结合(一个). 值得注意的是，Ape4绑定到全长Atg19、Atg19（1–387）或Atg19上（1–269），但没有绑定到Atg19中（1–203），这表明Ape4、prApe1和Ams1的结合位点在Atg19内是可分的。值得注意的是，Ape4与Atg19的结合活性与Ams1相似，但根据β-半乳糖苷酶活性估计，其结合活性约为prApe1的4倍(补充图S3). Ape4和Atg19之间的相互作用在脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1Δ测试菌株，表明Ape4-Atg19复合物的形成不需要prApe1(补充图S4).
Atg19中Ape4结合域的映射。 一个，Atg19突变体和货物蛋白之间物理相互作用的双杂交分析。这个第19天Δ测试菌株（YTS111）被转化为激活域(AD公司)质粒含有ATG19型和DNA结合域(BD公司)含有质粒APE1接口,APE4类、和AMS1型在SC-Leu-Ura液体培养基中生长的转化子用蒸馏水洗涤后，0.01一个600纳米在SC-Leu-Ura和SC-Ade-Leu-Ura平板上发现细胞单位，以评估ADE2型基因。此处显示的细胞在30°C下培养3天。立方厘米，螺旋域。B类，来自atg1处Δ第19天用表达野生型或突变型Atg19与蛋白A融合的Δ细胞（YMY109）用IgG-Sepharose沉淀PA-Atg19蛋白。这个左边和右侧面板显示总细胞提取物的蛋白质印迹(裂解液)IgG沉淀(绑定)分别用抗Ape1抗血清进行检测(上部面板)和抗HA抗体(中间的和下部面板).单箭头显示PA-Atg19衍生物，以及双箭头表示不含融合蛋白的蛋白A。
为了验证这些结果，我们在atg1处Δ背景应变。在在g1Δ突变体Atg19在PAS处被阻断，不会进入液泡，因此不会被降解，从而在胞浆中保持类似水平的野生型和突变型Atg19蛋白。因此，我们将atg1处Δ第19天蛋白A融合Atg19构建的Δ细胞与编码HA的质粒三-Ape4和HA三-Ams1。用IgG Sepharose从总细胞裂解物中分离出PA-Atg19蛋白，并用抗HA抗体和抗Ape1抗血清通过免疫印迹分析所得样品（注意，PA-Atg19由于PA部分而与两者反应）。前体Ape1与所有PA-Atg19蛋白共同分离，而Ape4失去了与Atg19（1–203）的相互作用，只有全长Atg19才能与Ams1结合(B类). 结合双杂交分析的结果，这些结果表明三种货运蛋白通过与不同位点结合与Atg19相关。
接下来，我们试图制造一个不能结合Ape4但可以运输prApe1的Atg19突变体，以检查Atg19和Ape4之间的相互作用是否对后者的运输很重要。由于Atg19的C末端28个氨基酸是Atg19与Atg8和Atg11相互作用所必需的(13)氨基酸残基204-269对与Ape4的相互作用很重要，我们构建了一个缺少氨基酸残基04-269的Atg19突变体（Atg19（Δ204-269）），该突变体与Gal4激活域或蛋白A融合。为了缩小Ape4结合域，Atg19、Atg19和Atg19也建造了(一个). 基于酵母双杂交分析，所有这些构建物都保留了prApe1结合能力。相反，Atg19（Δ204-269）失去了与Ape4和Ams1的相互作用(一个). 此外，Atg19（Δ204–225）和Atg19(一个). 这些结果表明，负责Ape4结合的区域包括由204-247个氨基酸包围的区域，而Ams1需要更多的远端氨基酸，包括至少一些在248-269范围内的氨基酸。接下来，我们在CUP1大学启动子第19天Δ细胞，并确定它们是否能够弥补由于缺乏内源性Atg19而导致的prApe1和Ape4转运缺陷。尽管PA-Atg19（Δ204-269）、PA-Atg19-（Δ2025-225）和PA-Atg19.（Δ225-247）的表达水平几乎与全长PA-Atg十九的表达水平相同(,3–10车道)，PA-Atg19（Δ248-269）有所降低，可能是由于失去适当折叠导致的降解(,车道11和12). 尽管如此，与全长Atg19相似，所有突变体都能够弥补prApe1成熟的缺陷，这表明这些突变体能够在Cvt途径中作为prApel受体发挥作用(,下部面板,3–12车道). 相反，在生长和饥饿条件下，这些突变体中的Ape4裂解形式显著减少(,上部面板,3–12车道). 虽然双杂交分析表明Atg19（Δ248–269）与Ape4相互作用，但PA-Atg19（△248–299）不能完全补充Ape4转运。这种差异可能是由于Atg19（Δ248-269）与Ape4的相互作用相对较弱所致(补充图S3)和/或PA-Atg19的低表达水平（Δ248-269）(,车道11和12). 这些结果表明，Atg19和Ape4的结合对Ape4向液泡的选择性转运很重要。
缺乏Ape4结合结构域的Atg19突变体特异性地影响Ape4向液泡的运输。这个第19天Δ细胞（SSY31）表达任一空载体（pRS416-CuPA；车道1和2)，野生型(重量; pTS477；车道3和4)，或突变体Atg19(5–12车道)融合蛋白A（PA-Atg19）在SC培养基中生长并在SD（-N）中饥饿3 h。蛋白质提取物相当于0.2一个600纳米对细胞单位进行SDS-PAGE，然后进行免疫印迹分析，并用抗Ape4探针进行检测(上部面板)和抗猿1(中间面板)抗血清和抗Pgk1(下部面板)抗体。CF1和Pgk1的量化如A.误差线表示三个独立实验的S.D。单箭头，非特异性蛋白带。双箭头，蛋白A未融合。佛罗里达州，全长。
Ape4利用Ape1运输系统
细胞溶质中Ape1复合物的组装及其靶向PAS在丰富条件下激活Cvt途径(18). 此外，Ams1低聚物通过Atg19与复合物结合，可以通过Cvt途径将Ams1高效导入液泡(13). 因此，我们决定研究prApe1是否是Ape4高效液泡导入所必需的。在脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1根据GFP-Ape4处理和丰富条件下Ape4分裂的估计，Δ细胞、Ape4向液泡的转运显著减少(,一个和B类,上部面板,13号车道、和一个,上部面板,13号车道). 接下来，我们使用荧光显微镜观察了几个自动变速箱共表达RFP-Ape1的突变体。在野生型细胞中，突出的GFP-Ape4点状突起()在生长条件下与RFP-Ape1共定位(). 因为prApe1定位于PAS，而Ape1则定位于野生型细胞的液泡中(13)，GFP-Ape4点对应于PAS。在饥饿条件下，GFP-Ape4在大多数细胞中的点状定位消失，可能是因为任何暂时定位于PAS的GFP-Ape 4都能有效地转运到液泡(补充图S5). 在atg1处Δ细胞，点状信号在生长和饥饿条件下都变得突出，表明Ape4蛋白在PAS处被阻断(和补充图S5). 删除ATG11型也导致GFP-Ape4与RFP-Ape1共定位的强烈点状定位(和补充图S5). Atg19与prApe1的交互不需要Atg11，显然Ape4也是如此。然而，将prApe1-Atg19复合体定位到PAS需要Atg11(13)这表明Ape4在到达PAS之前可能与prApe1-Atg19复合物相关。此外，当ATG19型被删除后，GFP-Ape4不再与Ape1复合物结合，从而导致GFP-Ape 4在胞浆中扩散，即使RFP-Ape1仍然形成复合物(和补充图S5). 类似地，缺乏Ape1导致GFP-Ape4的分散定位，这可能至少部分位于Atg19的复合体中(和补充图S5).
GFP-Ape4在中的定位自动变速箱突变体和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1营养丰富条件下的Δ突变体。 一个，野生型(重量; 6210瑞典克朗），atg1处Δ（WHY1），第11天Δ（YTS147），以及第19天表达GFP-Ape4和RFP-Ape1的Δ（SSY31）细胞在SC-Ura-Trp培养基中生长。B类，的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1表达GFP-Ape4的Δ细胞（YMT103）在SC培养基中生长。酒吧，2微米。驾驶员信息中心差分干涉对比度。
