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圆形Res。作者手稿；PMC 2012年4月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Circ Res.2011年4月1日；108(7): 857–861.
2011年2月17日在线发布。 数字对象标识：10.1161/CIRCRESAHA.111.241380号
预防性维修识别码：项目经理3074470
美国国立卫生研究院：NIHMS279959
PMID：21330601

从晚期心肌病患者的心内膜心肌活检中分离出功能完备的心肌干细胞

多梅尼科·达马里奥,1,2 克劳迪娅·菲奥里尼,三 帕特里夏·M·坎贝尔,2 波琳娜·戈伊贝里,1,2 Fumihiro Sanada先生,1,2 郑汉桥,1,2 细田东郎,1,2 马塞罗·罗塔,1,2 约翰·康奈尔,2 罗伯特·加列戈斯,4 弗雷德里克·G·韦尔特,2 迈克尔·吉弗茨,2 理查德·米切尔,5 安娜罗莎·莱里,1,2 扬·卡伊斯图拉,1,2 马克·普费弗（Marc A.Pfeffer）,2和比罗·安韦萨1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

理论基础

人类心脏中有两类心脏干细胞（CSC），主要具有肌源性（mCSC）和血管生成性（vCSC）特性。然而，尚不清楚终末期心衰患者的心肌中是否存在这两类功能兼容的CSC，以及这些细胞是否可以从相对较小的心肌样本中获得。

目标

确定是否可以从接受心脏移植或LVAD植入患者的心内膜心肌活检中分离和扩增临床相关数量的mCSC和vCSC。

方法和结果

在LVAD植入时，用活检刀从移植心脏的右室间隔或左室心尖部采集心内膜心肌活检。对每个患者的两到五个活检组织进行酶解分离，在扩增后，对细胞进行c-kit（mCSCs）或c-kit和KDR（vCSC）分类并进行表征。mCSC和vCSC分别占c-kit人群的97%和3%。mCSC和vCSC的人口倍增时间平均为27小时；5×10628天和41天分别获得mCSC和vCSC。根据高端粒酶活性和相对较长的端粒记录，两类CSC都具有显著的生长储备。mCSCs主要形成心肌细胞，vCSCs形成内皮细胞和平滑肌细胞。

结论

从晚期心力衰竭患者的心内膜心肌活检中分离出的mCSCs和vCSCs的生长特性与之前从接受择期心脏手术患者的较大心肌样本中获得的生长特性相当。

关键词：细胞治疗、端粒-端粒酶轴、CSC衰老

人类心脏具有两类心脏干细胞（CSC），它们具有强大但独特的血管生成和肌生成特性。1,2一类CSC嵌套在分布于整个冠状循环的血管龛中，主要负责内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）的周转和血管生成，2即vCSC。另一个CSC池聚集在位于心肌间质的小生境中，调节心肌细胞更新和心肌生成，1即mCSC。这些CSC可以从接受选择性心脏手术的患者的心房和心室心肌样本中分离出来，约75-130 mg。1,2这种CSC采集方法目前应用于一期临床试验，包括接受冠状动脉旁路手术的缺血性心肌病患者。三在这里，我们试图确定是否可以从晚期心力衰竭患者中获得功能兼容的CSC，以及是否可以从心内膜心肌活检中获得足够数量的CSC。对这些问题的肯定回答将支持非胸廓切开活检可以作为自体CSC的来源，用于晚期心肌病患者的潜在治疗。

方法

获得心肌内膜活检，收集CSC并在体外扩增。通过测定端粒长度、端粒酶活性、细胞衰老和凋亡来确定这些细胞的生长特性。展开的“方法”部分位于在线数据补充.

结果

人体样本

从移植心脏（n=13）或LVAD植入时（n=7）移除LV心尖区域后，在体外采集左心室（LV）中隔或心尖的右侧部分的活检。患者的特征列于在线表格一.采集了两到五次活检，得出总样本重量为4.8±1.0 mg(在线图一). 根据先前的结果，每个样本中存在<100个CSC。4分离标本，将未分离的细胞群扩大17±2天(在线图一). 11±2天后对细胞进行c-kit分类并用FACS进行表征(在线图一)，当5×106获得细胞(图1A). C-kit阳性细胞的造血和间充质血统标记为阴性；～3%表达KDR(图1B). C-kit阳性细胞和C-kit和KDR阳性细胞分别对应于mCSCs和vCSCs。2vCSC再扩增13±3天(在线图一)得到5×106单元格(图1C). 在所有20例研究病例中均获得了两类CSC。

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mCSC和vCSC的隔离和扩展

A、，对培养物中的c-kit阳性（左，绿）KDR-阴性（右）细胞进行分类。B、，c-kit、造血细胞标记物（CD34、CD45、CD133、骨髓细胞谱系混合物）、间充质细胞（CD90、CD105）和KDR的双变量分布。C、，培养物中分类c-kit阳性（左）KDR-阳性（中央，红色）。右侧面板，合并。D、，mCSC和vCSC中的PDT：单个值和平均值。E、，由BrdU标记的mCSC和vCSC（白色，箭头）。F、，BrdU标记的mCSC和vCSC的百分比。

mCSC和vCSC的生长特性

干细胞的生长受到端粒长度和端粒酶活性水平的调节。5因此，这些变量与群体倍增时间（PDT）和循环细胞比例一起在CSC中测量。mCSC和vCSC的PDT具有可比性，平均分别为27小时和28小时(图1D). 此外，～7-8%的mCSCs和vCSCs对BrdU呈阳性(图1E和1F). 通过流动FISH测量的端粒长度，6显示mCSCs和vCSCs的端粒在5.3kbp到7.7kbp之间变化(图2A-2D)端粒长度为1.5-2kbp，与人类细胞的复制性衰老有关。5vCSC的平均端粒长度稍短，这与该干细胞池扩展所需的分裂数较高一致。

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端粒-端粒酶轴

A、，mCSC（上部）和vCSC（下部）中的端粒（洋红色点）。B、，具有长（48kbp，上部）和短（7.0kbp，下部）端粒的淋巴瘤细胞。C、，mCSCs、vCSCs和淋巴瘤细胞的流动-FISH（内部对照）；mCSCs或vCSCs与淋巴瘤细胞结合，在无（空白）或有PNA探针的情况下培养。直方图表示门控mCSC（红线）、vCSC（蓝线）和对照细胞（绿线）中PNA探针相对于空白（黑线）的结合强度。天和E、，mCSC和vCSC中的端粒长度（D）和端粒酶活性（E）：个体值和平均值。蓝色条：从大心肌样本中获得的CSC值（参见参考文献1).

端粒酶活性通过定量PCR进行评估，并表示为TSR8寡核苷酸标准化的模板拷贝数。核糖核蛋白在mCSC和vCSC中的催化活性都很高(图2E). 重要的是，酶活性与从心室功能轻度改变患者的大手术标本中分离出的mCSC中测得的酶活性相似。1这些人类mCSC已被证明能够再生梗死心肌的大片区域，分化为功能性心肌细胞和冠状血管。1,2,7

mCSCs和vCSCs中保存完好的端粒-端粒酶轴与相对较低水平的衰老相关蛋白p16阳性细胞相一致INK4a公司防止干细胞永久性地重新进入细胞周期。1同样，细胞凋亡也很低(图3A-3D). 因此，mCSC和vCSC在培养中扩增到临床相关数量，具有显著的进一步生长能力。

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衰老和凋亡

A、，第16页，共页INK4a公司在mCSC和vCSC中（黄色，箭头）。B、，mCSC和vCSC的TdT标签（亮蓝色，箭头）。C和D、，衰老（C）和凋亡（D）mCSCs和vCSCs：个体和平均值。

mCSC和vCSC的区别

通过FACS分析评估mCSC和vCSC的承诺。分化前，mCSCs和vCSCs对心脏谱系呈阴性(图4A和4B). 然而，暴露于地塞米松的mCSC主要呈c-kit阴性，并表达心肌细胞特异性转录因子和收缩蛋白。小部分细胞的转录因子、SMC和EC的膜蛋白和细胞质蛋白呈阳性。类似地，在地塞米松存在的情况下，vCSCs大量失去c-kit和KDR，并表达转录因子，以及SMC和EC特异性的膜和细胞质蛋白。此外，一些细胞的转录因子和收缩蛋白呈阳性，这是心肌细胞的典型特征(图4C和4D). 总的来说，mCSC形成的心肌细胞比vCSC多5倍，vSCs形成的SMC是mCSC的4倍，EC是mCSCs的3.2倍(图4E). 当从大型手术标本中获得这些干细胞类别时，发现mCSCs和vCSCs的谱系规范存在可比性差异。1,2

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mCSC和vCSC的区别

A类和B、，c-kit（A）或KDR（B）和心脏标志物在未分化mCSC（A）和vCSC（B）中的双变量分布。C和D、，细胞分化后的比较分析。E、，FACS定量结果*P（P）与mCSC相比<0.05。

讨论

目前的研究有两个目标：一)确定严重心力衰竭患者是否在病变心肌中保留了一组功能上有竞争力的mCSC和vCSC；和b条)为了确定这些接受心脏移植或LVAD植入的晚期心力衰竭患者中是否存在mCSC和vCSC，可以从小型心肌活检中分离出来，并在体外扩增到临床相关数量，以便随后进行自体输送。我们的结果为这两个问题提供了积极的答案，提高了自体mCSC和vCSC治疗是可行的，并且可以考虑用于晚期心力衰竭患者的研究评估的可能性。

我们反复强调，端粒-端粒酶轴是mCSC和vCSC生长行为的主要决定因素。基于mCSCs的广泛特征，我们发现这些细胞的平均端粒缩短为每群体倍增130 bp（PD）。1与mCSCs和人类造血干细胞生长停滞和细胞衰老相关的临界端粒长度在2.0至1.5 kbp之间。1,5在本研究中，mCSCs和vCSCs在扩增结束时的端粒长度为～6 kbp。可以预测，在达到不可逆生长停滞之前，mCSC和vCSC可能会经历31次额外的PD（6-2=4 kbp/0.13 kbp=31个PD）。因此，人类CSC可以在体外广泛生长，并在体内植入，以免其增殖潜力出现重大损失。

重要的是，两类人类CSCs，mCSCs和vCSCs都是从重量为～5 mg的组织样本中获得的，在扩增后，迅速达到5×10的值6细胞在～40天内。获取治疗上适用数量的mCSC和vCSC所涉及的时间因素限制了急性事件的管理，但不排除慢性心力衰竭的治疗。目前，100万mCSC通过冠状动脉内输注给梗死后缺血性心肌病和心室功能受损的患者。三使用的mCSC数量明显小于单核骨髓细胞，240×106在急性心肌梗死或慢性心力衰竭患者中以相同的方式注射。812.5和25×10的水池6自体心脏细胞，来源于体外心包扩张，9给近期心肌梗死和心功能低下的患者服用（ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00893360型). 这一未经证实的假设认为，心脏祖细胞在直接恢复受损心肌或间接激活内源性mCSC方面可能更具特异性和有效性，从而产生相同的组织再生反应。10这两种机制也可能是有效的，尽管独立于临床结果，基本上不可能确定mCSC或心脏球体在心肌修复中的实际作用。

人们认识到hCSC是活跃的，并且广泛分布于整个心肌，这与它们在缺血性和非缺血性心肌损伤后的无效再生能力不同。尽管无法对这种生长缺陷提供直接解释，但hCSC已被适当地配置以调节组织内环境稳定，11但在很大程度上不足以促进心脏修复。通过交付5×106hCSCs，我们可以将其在心肌中的频率增加几倍。

补充材料

1

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致谢

资金来源：这项工作得到了NIH拨款的支持。

非标准缩略语和缩写

客户服务中心心脏干细胞
mCSC公司肌源性心脏干细胞
vCSC血管生成性心脏干细胞
LVAD公司左心室辅助装置
PDT（PDT）人口翻倍时间

脚注

披露：无

工具书类

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