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单元格元数据。作者手稿；PMC 2012年1月5日提供。
以最终编辑形式发布为：
细胞代谢。2011年1月5日；13(1): 35–43.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cmet.2010.12.001
预防性维修识别码：项目经理3072049
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院257955
PMID：21195347

细胞能量消耗通过促进辅活化剂介导的膳食燃料吸收来重置全身能量

阿图尔·乔普拉,1 罗摩克里希纳·科马加尼,1 普拉迪普·萨哈,1 Jean-Francois Louet女士,1 克里斯蒂娜·萨拉扎,1 宋军魂,1 Jaewok Jeong,1 米尔顿·芬戈尔德,2 伯努瓦·维奥莱特,三，4 弗兰科·德梅奥,1 陈源翰,1 大卫·D·摩尔,1和伯特·W·奥马利1
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

所有生物都设计了应对能量消耗的策略，以促进生存。我们在此表明，细胞能量耗竭发挥了一种令人惊讶的策略，导致吸收外源燃料以补充能量。我们发现能量耗竭感应激酶AMPK结合、磷酸化并激活转录辅激活子SRC-2，该辅激活子以肝脏特异性方式促进肠道对膳食脂肪的吸收。SRC-2的肝细胞特异性缺失导致肠道脂肪吸收障碍，并减弱脂肪进入血流的能力。这种缺陷可归因于AMPK和SRC-2介导的肝胆汁酸分泌到肠道的转录调节，因为它可以通过补充肠道BA或通过基因恢复肝胆汁盐输出泵（BSEP）的水平而完全治愈。我们的研究结果将肝脏AMPK-SRC-2轴定位为一个能量变阻器，在细胞能量耗尽时，通过促进饮食燃料的吸收来重置全身能量。

介绍

在过去的三十年里，美国成年人肥胖率翻了一番，儿童肥胖率增加了两倍(Ogden等人，2006年). 糖尿病、心脏病、神经退行性变和某些癌症等与肥胖相关的并发症的发病率呈比例增加，同时用于治疗这些疾病的国内生产总值百分比也有所上升(Ogden等人，2006年). 哺乳动物身体不断获取和储存能量的动力很可能是进化过程中食物匮乏时期的结果(Spiegelman和Flier，2001年). 显然，当前十年的一个更重要的挑战是加强我们对能量稳态基本机制的理解，以便更深入地了解影响体重的因素。从机制和分子角度解读这些因素，对于挖掘预防和治疗肥胖的靶点具有巨大潜力。

生物体所采用的关键生存策略之一似乎是通过激活纠正细胞能量消耗的途径来应对细胞能量消耗(卡林，2004年;哈迪和卡林，1997年;Kahn等人，2005年). 纠正细胞能量消耗的两种方法是停用消耗ATP的过程和激活产生ATP的过程。一种古老的能量传感器——AMP活化蛋白激酶（AMPK）似乎正是通过激活消耗ATP的合成代谢过程和激活产生ATP的分解代谢过程来实现这一目的的(卡林，2004年;哈迪和卡林，1997年;Kahn等人，2005年;Viollet等人，2006年). 由于外源性燃料对ATP合成至关重要，所以AMPK也能促进食欲也就不足为奇了(卡林，2004年). 我们在这里表明，一旦摄入外源性燃料，AMPK通过一个先前未链接的系统过程，可以最佳吸收能量最丰富的燃料——膳食脂肪。AMPK激活转录辅激活子SRC-2，正如我们所证明的，它通过转录调节肝胆汁酸（BA）分泌促进膳食脂肪的吸收。我们描述的机械级联将细胞能量状态与全身能量状态联系在一起。自年以来，SRC-2被描述为通过棕色脂肪组织的失活来调节能量损失(Picard等人，2002年)，我们目前的结果将其定位为能量摄入的调节器，从而成为能量稳态的整体控制器。

结果

SRC-2全身消融导致膳食脂肪吸收障碍

全球SRC-2（TIF2）基因敲除小鼠免受高脂肪饮食介导的肥胖的影响，因为辅激活剂通过抑制棕色脂肪组织的激活来促进能量节约(Picard等人，2002年). 我们假设SRC-2可能在能量摄入中发挥额外作用，并评估食物摄入和脂肪吸收。隔夜后，雄性SRC-2−/−小鼠自由进食标准食物24小时，并与WT同窝小鼠比较食物摄入量、粪便质量、粪便甘油三酯含量和血浆甘油三酸酯含量。全身消融SRC-2不会影响食物摄入量，但会增加粪便质量和甘油三酯含量，同时血浆甘油三酸酯也会降低(图1A-D)表明肠道吸收膳食脂肪的能力降低。

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SRC-2全身消融导致膳食脂肪吸收障碍

A-D）在隔夜禁食24小时后，测量WT和SRC-2−/−小鼠（全身消融）的食物摄入量、粪便排出量、粪便甘油三酯和血浆甘油三酸酯（每组5只小鼠）。

数据表示为平均值+SEM。未配对学生的t检验用于评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

肝细胞特异性SRC-2消融导致肠道脂肪吸收障碍，可通过补充肠道BA水平予以缓解

肝细胞特异性SRC-2敲除小鼠（SRC-2 LKO）(图S1A)每天摄入的标准食物量与WT对应物相同，但粪便质量和甘油三酯含量增加，血浆甘油三酸酯缺乏(图2A-D)表明肝脏是SRC-2吸收肠道脂肪的作用部位。SRC-2 LKO中的粪便脂肪酶活性没有改变，表明胰腺外分泌功能不受SRC-2肝切除的影响(图S1B). 基于对SRC-2 LKO小鼠粪便和血浆甘油三酯的相互影响，我们评估了口服标有C的橄榄油后甘油三酸酯进入血浆的速率14（注射泰乐葆抑制血浆脂解后）。事实上，我们发现SRC-2 LKO小鼠血浆中的甘油三酯和放射性水平较低(图2E、F). 我们还检测了用标记有C的橄榄油灌胃SRC-2 LKO和WT小鼠后的肠道放射性14发现近端空肠放射性有双重缺陷(图2G)表明肠腔对肠细胞的甘油三酯吸收减少。与此一致的是，在SRC-2 LKO小鼠中，用Oil-Red-O染色的近端空肠绒毛的冷冻切片显示，暴露于橄榄油灌胃后，甘油三酯染色水平显著降低(图S1C). 我们得出结论，SRC-2 LKO小鼠的肠道脂肪吸收有缺陷。

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肝脏SRC-2以BA依赖的方式调节膳食脂肪吸收

A-D）在隔夜禁食24小时后，测量WT和SRC-2 LKO小鼠（肝脏特异性消融）的食物摄入量、粪便排出量、粪便甘油三酯和血浆甘油三酸酯（每组5只小鼠）。

注射脂肪酶抑制剂tyloxapol并用含有14C-三油酸甘油的橄榄油灌胃（每组5只小鼠）后，在喂养的WT和SRC-2 LKO小鼠中测量E-F）血浆放射性和甘油三酯水平。

数据表示为平均值+SEM。使用双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验（Bonferrori post tests），以逐行比较重复平均值，以评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

G） 用含有14C-三油酸甘油的橄榄油灌胃2小时后，测量WT和SRC-2 LKO小鼠的肠道放射性水平（每组5只小鼠）。

数据表示为平均值+扫描电镜。使用双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni后验，以逐行比较重复平均值，以评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

H-I）在连续两周的标准化饮食和1%胆酸饮食中测量WT和SRC-2 LKO小鼠的肝和胆汁BA水平。胆汁来自胆囊，代表肠内BA水平（每组4-5只小鼠）。

J） 将小鼠暴露于高脂肪饮食（60%的热量来自脂肪）和含有高脂肪和1%胆酸的饮食48小时后（每组4-5只小鼠），测量进食食物的WT和SRC-2 LKO小鼠的粪便甘油三酯水平。

数据以平均值+SEM表示。除非另有说明，否则使用未配对的学生t检验来评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

另请参见图S1和图S2

由于进入肠道的肝胆汁酸（BA）分泌减少可以解释肝SRC-2缺失的肠道效应，我们给小鼠喂食标准饲料或1%胆酸（CA）饮食14天，以抑制肝BA的生成，并评估血浆、肝脏和胆汁中的BA水平。喂食标准食物和CA食物的SRC-2 LKO小鼠的肝BA均增加，但胆汁BA水平降低(图2H，I)与进入肠道的肝BA分泌减少一致。CA喂养的SRC-2 LKO小鼠的血浆BA水平升高(图S1D). 与肝脏BA含量升高和胆汁BA水平不足一致，总BA池大小保持不变，胆汁BA组成也保持不变(图S1E和图S2A). 血浆胆红素水平也保持不变(图S1G). 为了测试BA未能足量到达肠道是否导致观察到的脂肪吸收障碍，我们评估了SRC-2 LKO小鼠和WT同窝小鼠的粪便甘油三酯，这些小鼠或通过高脂肪饮食来加强脂肪吸收器官，或通过高脂饮食加上1%CA来纠正肠道BA缺乏。SRC-2 LKO小鼠粪便中的甘油三酯含量是WT同窝高脂肪小鼠粪便中甘油三酸酯含量的两倍(图2J). 值得注意的是，这种脂肪吸收障碍在喂食外源BA的SRC-2 LKO小鼠中得到了完全缓解(图2J). 为了排除潜在的外周能量消耗增加可能导致SRC-2 LKO小鼠血浆甘油三酯水平低的可能性，我们测量了耗氧量（VO2）。24小时内，WT和SRC-2 LKO小鼠的VO2水平保持不变(图S1F).

SRC-2调节胆盐输出泵的表达，强制肝修复可以挽救SRC-2消融术后继发的脂肪吸收障碍

肝脏和血浆中BA的积累及其在胆汁中的不足使我们得出结论，SRC-2积极调节BA从肝脏向肠道的分泌。因此，我们研究了一系列肝脏转运体的表达，包括胆汁盐输出泵（BSEP），这是从肝细胞到胆管的主要BA转运体，在喂食含CA饮食的小鼠和小鼠中。与之前公布的全身SRC-2阴性小鼠肝脏微阵列结果一致(Jeong等人，2006年)SRC-2 LKO小鼠BSEP mRNA和蛋白水平显著降低(图3A、B). 基底外侧转运体OSTβ也降低。BSEP效应对SRC-2具有特异性，因为其表达不受SRC-1或SRC-3缺失的影响(图S3A)证明了体内辅激活子功能的特异性。特别是人类的疯牛病缺乏症伴有严重的脂肪泻(Walkowiak等人，2006年)BSEP表达的缺失可能解释了SRC-2 LKO小鼠的脂肪吸收障碍。

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SRC-2通过控制胆盐输出泵（BSEP）的表达调节膳食脂肪吸收

A） 通过QPCR相对定量测定暴露于标准胆酸或1%胆酸两周的WT和SRC-2 LKO小鼠（每组5-7只小鼠）肝脏中各种BA转运蛋白基因的表达。

数据表示为平均值+SEM。未配对学生的t检验用于评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

B） 通过western blot分析测定暴露于标准鼠（每组2只小鼠）的WT和SRC-2 LKO小鼠肝脏中BSEP蛋白的表达。GAPDH被用作负荷控制。

采用尾静脉输注法，将暴露于腺病毒BSEP（Ad.BSEP）的C-F）SRC-2 LKO小鼠与暴露于空腺病毒（Ad.empty）的SRC-2和WT小鼠进行比较。病毒输注后8天，检测肝BSEP表达、肝BA含量、粪便甘油三酯含量和血浆甘油三酸酯含量（每组6只小鼠）。在（WT，Ad.Empty）和（SRC-2 LKO，Ad.Empty）组之间以及（SRC-2 LKO，Ad.Empty）和（SRC-2 LKO，Ad.BSEP）组之间进行统计比较。

数据表示为平均值+SEM。使用Tukey多重比较检验的单向方差分析来评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

另请参见图S3和图S4

我们评估了许多其他与BA稳态相关的关键基因的表达，发现SRC-2 LKO小鼠中BA生物合成和导入基因（Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp7b1、Cyp27a1和NTCP）的表达缺失，这表明肝脏中BA水平过高会导致基因表达的代偿性降低(图S3B). BA分解代谢途径的减少会增加胆固醇水平，SRC-2 LKO小鼠的血浆总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和肝脏总胆固醇显示出显著的蓄积(图S3D). 这并没有伴随着饮食胆固醇的肠道吸收的变化(图S3C). 虽然高密度脂蛋白积累可能表明肝外组织受累，但这不太可能，因为SRC-2在肝脏中被特异性删除。为了更详细地研究胆固醇代谢，我们评估了肝脏和肠道中几个对维持胆固醇稳态很重要的基因的表达(图S3E). 我们发现SRC-2 LKO小鼠的肝脏ABCG5和ABCG8存在缺陷，这可能解释了血浆和肝脏胆固醇的积聚，因为ABCG5与ABCG8是胆固醇排入胆汁所必需的(图S3E). 参与肝胆固醇输入的基因LDLR和SR-B1在SRC-2 LKO小鼠中的表达受到抑制(图S3F)可能是为了弥补肝脏胆固醇含量的增加，也可能解释了血浆胆固醇的积聚。对与BA和胆固醇稳态相关的转录因子表达的评估表明，SRC-2 LKO和WT小鼠之间没有显著差异(图S3G). 与未改变的血浆VLDL谱一致，与WT相比，SRC-2 LKO小鼠肝脏VLDL组装和输出的几个重要基因的表达没有变化(图S4A).

通过使用腺病毒载体将肝脏BSEP恢复到生理水平，我们测试了肝脏BSEP表达减少是否是SRC-2 LKO小鼠BA扰动和脂肪吸收障碍的原因。值得注意的是，BSEP的恢复完全逆转了SRC-2 LKO小鼠肝脏BA的蓄积以及粪便甘油三酯的蓄积和血浆甘油三酸酯的不足(图3C-F).

SRC-2通过共同激活FXR以细胞自主方式调节BSEP的表达

为了排除肝脏SRC-2消融对胆汁分泌程序的间接全身影响，我们研究了从暴露于载体或鹅去氧胆酸（CDCA）的SRC-2 LKO和WT小鼠分离的原代肝细胞（PHs）(Lew等人，2004年). 我们发现SRC-2缺失PH中BSEP和OSTβmRNA水平的降低与体内发现的相同(图4A)证明了SRC-2对这些基因表达的细胞自主效应。在急性SRC-2敲除后的PH中重复此实验，结果非常相似，再次证实了SRC-2对肝脏胆汁分泌程序表达的关键性质(图S5A).

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SRC-2通过共同激活FXR以细胞自主方式调节BSEP的表达

A） 通过QPCR的相对定量，在来自WT和SRC-2LKO小鼠的暴露于DMSO或CDCA的原代肝细胞中测量各种BA转运蛋白基因的表达。对每个治疗组的WT和SRC-2 KO PH进行统计比较。

B） 用野生型小鼠BSEP启动子驱动的报告基因质粒和带有突变FXRE基序的同一启动子，以及SRC-2和FXR的表达质粒转染HepG2肝癌细胞，并暴露于CDCA。转染48小时后测定报告基因水平。将空向量（EV）值固定为1，并将其余值与该值进行比较。

C） 将野生型小鼠BSEP启动子驱动的报告基因质粒与WT SRC-2、SRC-2突变体AD1缺失、SRC-1突变体AD2缺失和SRC-2突变AD1和AD2缺失以及FXR的表达质粒一起转染HepG2肝癌细胞，并暴露于CDCA。转染48小时后测定报告基因水平。将空向量（EV）值固定为1，并将其余值与该值进行比较。

D） 使用来自WT小鼠的肝组织进行体内ChIP分析，其中150-200 bp的扩增子位于包含BSEP启动子FXRE基序的区域和转录起始点上游3000 bp的无关区域的两侧。使用针对SRC-2不同区域的两种不同抗体，使用Sybr-Green QPCR（归一化为输入）评估SRC-2对BSEP启动子的占用。对照抗体识别小鼠IgG。

E） 使用来自WT和FXR基因敲除小鼠的肝组织，在含有BSEP启动子FXRE基序的区域两侧使用引物进行体内ChIP分析。使用SRC-2特异性抗体，Sybr Green QPCR（标准化输入）用于评估SRC-2对BSEP启动子的占有率。对照抗体识别小鼠IgG。

数据表示为平均值+SEM。对于所有基因表达数据，使用未配对学生的t检验来评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

另请参见图S5

BSEP启动子对核受体FXR具有进化上保守的识别运动(Ananthanaarayanan等人，2001年)我们发现SRC-2与FXR协同激活BSEP启动子(图4B). 我们通过使用AD1、AD2和两者的缺失突变体来检测SRC-2的两个激活域（AD）在BSEP转录激活中的作用。有趣的是，我们发现AD1对SRC-2介导的BSEP启动子的反式激活是绝对必要的(图4C). 使用体内染色质免疫沉淀（ChIP，图4D，E)，我们确认SRC-2被招募到肝脏中的BSEP启动子中，并且在没有FXR的情况下被废除。为了明确证明SRC-2的特异性，我们进行了体内ChIP分析，以探测BSEP启动子的SRC-1和SRC-3占据率。与SRC-2相比，我们发现BSEP提示器上没有SRC-1和SRC-3(图S5B). 与此一致，我们发现SRC-1和SRC-3阴性小鼠的血浆BA水平不变，而SRC-3阳性小鼠的血浆甘油三酯水平不变(图S5C). 我们发现SRC-1阴性小鼠的血浆甘油三酯水平显著降低(图S5C). 然而，在血浆胆汁酸含量和BSEP表达没有变化的情况下，SRC-1基因敲除小鼠血浆甘油三酯的减少不太可能是由于胆汁酸稳态改变所致，就像SRC-2基因敲除LKO小鼠的情况一样。

肝细胞特异性筛选确定AMP活化蛋白激酶（AMPK）是BSEP表达的阳性调节剂

在证实SRC-2下游的信号传导导致BA分泌和膳食脂肪吸收后，我们假设因为SRC-2促进能量摄入（通过膳食脂肪吸收）并抵消能量损失（通过棕色脂肪组织失活）(Picard等人，2002年)，它本身可以对能源状况的变化做出反应。我们进行了筛选，以评估已知在能量稳态中起作用的一些激素和细胞因子是否会影响原代肝细胞中BSEP的表达。我们发现，众所周知的细胞能量消耗传感器AMPK的激活剂AICAR(卡林，2004年;哈迪和卡林，1997年;Kahn等人，2005年;Viollet等人，2006年)，强烈影响BSEP表达(图5A). 由于AICAR可能具有不依赖于AMPK的混杂效应，我们在原代肝细胞中过表达了一种组成性活性形式的AMPK（没有AICAR存在），并发现它足以处理私有BSEP(图5B). 相反，过度表达显性负型AMPK（DnAMPK）导致BSEP表达下调(图5B). DnAMPK过度表达还导致AICAR介导的BSEP反式激活减弱(图5C).

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肝细胞特异性筛选确定AMP活化蛋白激酶（AMPK）是BSEP表达的假定阳性调节剂

A） 通过QPCR相对定量测定暴露于标准剂量所示药物24小时的原代肝细胞中BSEP的表达。

B） 在暴露于腺病毒的原代肝细胞中，通过QPCR的相对定量测量BSEP的表达，所述腺病毒含有代表组成型活性AMPKα或显性阴性AMPKα的cDNA 24小时。将GFP组与组成性活性AMPKα组或显性阴性AMPK alpha组进行统计比较。

C） 通过QPCR相对定量法测量暴露于腺病毒cDNA（代表显性负AMPKα和载体或1mM AICAR）18小时的原代肝细胞中BSEP的表达。

所有基因表达数据均表示为平均值+SEM。未配对学生的t检验用于评估统计显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

AMPK结合、磷酸化并增加SRC-2的内在转录活性，并将其驱动至BSEP启动子

使用AICAR激活HepG2细胞中的AMPK可增加SRC-2的内在转录活性，而福斯科林增强cAMP则无影响(图6A,图S6A). 使用显性负性结构干扰AMPK活性，消除AICAR介导的SRC-2激活(图6B)确认AICAR的特异性。AICAR对SRC-2蛋白水平没有影响(图S6B)这表明了一种独立于增强SRC-2表达的激活机制。通过联合免疫沉淀分析，我们发现内源性SRC-2和AMPK蛋白之间存在物理联系(图6C). 这种关联不受AICAR的影响(图6C)这表明活化机制与亲和力增加无关。使用体外激酶分析，利用纯化的全长SRC-2和AMPK蛋白，我们发现AMPK以AMP依赖的方式磷酸化SRC-2(图6D). 接下来我们研究了体内AMPK缺失对BSEP表达的影响。我们发现AMPKα1/2双基因敲除小鼠肝组织中BSEP mRNA和蛋白水平存在缺陷，同时肝内BA适度积累(图6E,图S6C,图6F). 与此一致，AICAR治疗小鼠增加了肝脏BSEP mRNA和蛋白表达(图6G,图S6D)，表明AMPK可能通过SRC-2介导的作用调节体内BSEP的表达。事实上，我们发现SRC-2对于AICAR介导的原代肝细胞BSEP和OSTβ反式激活是必要的(图6H,图S6E). 我们还发现FXR对于AICAR介导的BSEP转录激活是必要的(图S6F)这表明SRC-2-FXR复合物在将信号从AMPK传递到BSEP启动子中起着关键作用。AICAR还能够在体外激活SRC-1和SRC-3(图S6G)，但由于SRC-1和SRC-3不影响体内BSEP转录激活(图S3A、图S5B和图S5C)这可能表明AMPK介导的功能通过其他p160家族成员发挥。在培养的肝细胞中，AICAR治疗导致BSEP启动子的SRC-2募集增加(图6I). 令人惊讶的是，它还将AMPKα2自身驱动到BSEP启动子(图6J)这表明AMPK除了增加SRC-2的内在转录活性外，还将SRC-2招募到BSEP启动子中，并伴随其出现。这与AMPKα2的主要核表达谱一致(Salt等人，1998年)最近的一份报告表明，AMPKα2通过与染色质相关联、磷酸化组蛋白并被招募到目标基因的启动子中，在转录中发挥直接作用（Bungard等人）。其他AMPK亚单位也很可能与AMPKα2联合存在于BSEP启动子上，从而使AMPK在BSEP的反式激活中发挥全酶的作用。

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肝脏AMPK增加SRC-2的内在转录活性，并将其驱动至BSEP启动子

A） 用pG5Luc（5个Gal4结合位点驱动荧光素酶表达）和pBIND SRC-2（SRC-2:Gal4 DNA结合域融合蛋白）转染HepG2肝癌细胞，并暴露于1mM AICAR。转染48小时后测定荧光素酶水平。车辆值固定为1，并将其余值与该值进行比较。

B） 用pG5Luc、pBIND SRC-2和空载体（EV）或显性负AMPKα2（DnAMPK）转染HepG2肝癌细胞，暴露于0.3 mM、0.6 mM和1 mM AICAR。转染48小时后测定荧光素酶水平。车辆值固定为1，并将其余值与该值进行比较。

C） 用1mM AICAR处理HepG2细胞30分钟，并用AMPKa2特异性抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀样品进行免疫印迹，并按指示输入10%。

D） 纯化的全长SRC-2蛋白在体外进行磷酸化，如图所示，使用或不使用纯化的AMPK全酶和AMP。

E-F）禁食24小时的WT和AMPKα1/α2双基因敲除（AMPK alpha-DKO）小鼠（每组7-8只小鼠）的肝脏中，通过QPCR相对定量测定肝BSEP表达和BA含量。

G） 通过QPCR相对定量测定暴露于PBS或0.5 mg/G BW AICAR 12小时并喂食标准食物（每组6只小鼠）的小鼠肝脏中BSEP的表达。

H） 通过QPCR相对定量测定暴露于1 mM AICAR 18小时的WT和SRC-2 LKO小鼠原代肝细胞中BSEP的表达。

使用HepG2细胞暴露于载体或1 mM AICAR中30分钟进行I-J）ChIP分析，引物位于包含BSEP启动子FXRE基序的区域两侧。使用SRC-2或AMPK a2特异性抗体，使用Sybr-Green QPCR（归一化为输入）评估染色质免疫沉淀后BSEP启动子的SRC-2和AMPKα2占用率。对照抗体识别小鼠IgG。

所有基因表达数据均以平均值+SEM表示。未配对学生的t检验用于评估统计学显著性。一个星号表示p<0.05，两个星号表明p<0.01，三个星号显示p<0.001。

另请参见图S6

讨论

我们的研究结果表明，SRC-2共激活因子是AMPK介导的能量再生轮中一个新发现的重要齿轮。我们已经阐明了一种将细胞能量消耗与启动膳食燃料进入体内的行为联系起来的途径(图7)从而将细胞能量状态与全动物能量状态联系起来。我们已经证明，细胞能量耗竭感应激酶AMPK激活转录辅激活子SRC-2，后者反过来通过与核受体FXR协同作用激活BSEP基因，从而导致肝BA分泌和下游膳食脂肪吸收。通过全身和肝脏特异性的SRC-2基因缺失干扰这一过程，导致肝脏BA分泌减少，并导致肠道脂肪吸收障碍。这些影响可以通过纠正肠道BA缺乏以及通过基因纠正肝脏BSEP缺乏来完全缓解。

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描述细胞能量消耗与全身能量补充之间级联关系的示意图。

我们的结果表明，AMPK促进膳食脂肪的吸收，为其脂肪酸氧化和ATP再生的核心细胞功能提供燃料(Minokoshi等人，2002年). 该周期似乎始于细胞ATP水平低，可能是由于两餐之间能量储存的适度下降，激活AMPK和SRC-2，从而使肝脏将BA分泌到胆囊中，以最佳方式启动肠道从下一餐中吸收甘油三酯，这反过来又作为细胞脂肪酸氧化的燃料，从而导致上述级联的ATP合成和失活。ATP水平显示昼夜节律振荡有一些先例(Womac等人，2009年)，可能是由周期性食物摄入决定的，而众所周知，AMPK受昼夜节律控制(Lamia等人，2009年). 因此，我们假设我们所描述的级联是以昼夜节律方式激活和失活的，并且是由ATP水平和AMPK激活的昼夜节拍振荡设置的。与其家族成员SRC-1和SRC-3相比，SRC-2在该途径的调节方面表现出了非凡的特异性，这与我们过去在葡萄糖稳态方面的研究非常相似(Chopra等人，2008年).

由于SRC-2已被证明反对能量损失(Picard等人，2002年)我们目前的研究结果表明，它与能量吸收有关，其功能与AMPK相似(卡林，2004年;哈迪和卡林，1997年;Kahn等人，2005年)防止能源消耗。由于AMPK-SRC-2轴在控制能量稳态方面具有整体性，因此可以作为微调全身能量水平、对抗肥胖和相关并发症的潜在靶点。

方法

老鼠

描述了全身SRC-1、SRC-2和SRC-3空白小鼠(Chopra等人，2008年). 我们使用8-16周龄的雄性同窝小鼠进行所有分析。SRC-2 F/F小鼠(Mukherjee等人，2006年)与白蛋白核心小鼠杂交(Weisend等人，2009年)生成肝脏特异性SRC-2敲除（SRC-2 LKO）小鼠。我们使用8-16周龄的雄性SRC-2 LKO小鼠和性别匹配的SRC-2 F/F（WT）同窝小鼠进行所有体内研究。SRC-2−/−小鼠的结果（食物摄入量、粪便质量、粪便甘油三酯和血浆甘油三酯）反映了使用SRC-2 LKO小鼠获得的结果，从而排除了Cre重组酶介导的SRC-2 LKO小鼠毒性的任何影响。对于BSEP介导的遗传拯救实验，WT和SRC-2 LKO小鼠暴露于腺病毒转基因（1011每只小鼠的病毒颗粒），如前所述通过尾静脉注射(Chopra等人，2008年). 在病毒输注后7天的24小时内，使用代谢笼从单个小鼠收集粪便样本。病毒输注后8天处死小鼠，分离血浆和各种器官。将AICAR（0.5 mg/g BW）皮下注射给WT C57小鼠，12小时后分离肝脏。缺乏AMPK的肝脏是从之前描述的肝脏特异性敲除小鼠中获得的(Guigas等人，2006年)由贝尼奥特·维奥利特提供。除非另有说明，否则所有实验都是在24小时自由进食状态下进行的，在隔夜禁食之后，所有小鼠的新陈代谢同步。贝勒医学院动物护理和利用委员会批准了所有实验。

代谢研究

我们分别使用诊断化学公司、Wako Pure Chemicals公司和Thermo Scientific公司的比色分析法，按照制造商的方案（胆汁是使用26号针头和注射器从胆囊中获取的）测量血浆和胆汁BA、血浆和胆磷脂以及血浆甘油三酯。胆汁胆固醇使用比色测定法（MBL International），使用制造商的方案进行测量。血浆胆固醇、HDL、LDL、VLDL和胆红素由贝勒医学院兽医病理学核心实验室测定。将肝脏重量正常化后，用70%乙醇消化肝脏，然后进行比色分析（Diagnostic chemicals Ltd.），提取肝BA。BA池大小如前所述确定(Tiemann等人，2004年). 使用反相C18柱，使用甲醇-磷酸盐缓冲液，以0.75 ml/min的速度等度洗脱，通过HPLC测定BA的组成。结合胆汁酸在205 nm处通过吸光度进行检测，并根据已知标准的相对保留时间进行鉴定。为了确保没有任何东西逃过HPLC系统，在纳米ESI-MS系统上运行每组小鼠的一个样品。如前所述测定肠道胆固醇吸收(Temel等人，2005年). 使用代谢笼在24小时内评估单个小鼠的食物摄入量。使用代谢笼在24小时内从单个小鼠收集粪便样本。对粪便样品进行称重并进行油脂提取程序(Kolonin等人，2004年)然后，在正常化至粪便重量后，使用比色法（Thermo Scientific）测量甘油三酯。将粪便重量归一化后，使用比色试剂盒（生物测定系统）测量粪便脂肪酶活性。在代谢笼中使用单独饲养的小鼠测量VO2水平。从Harlan-Teklad购买含有1%胆酸、高脂肪（60%热量来自脂肪）和高脂肪加1%胆酸的膳食。使用C评估肠道循环和肠道对甘油三酯的吸收14描述了标记的橄榄油(Yen等人，2009年).

组织学分析

我们将肝脏样本固定在10%甲醛中进行H&E染色。我们使用冷冻近端空肠横切面进行油红-O染色，以评估肠绒毛中的中性脂质含量。

RNA和蛋白质分析

我们使用了标准的RNA提取程序（来自Qiagen的RNeasy Mini Kit）。使用Superscript III试剂盒（Invitrogen）使用制造商的方案进行逆转录。对于基因表达分析，使用序列特异性引物和Roche（Universal Probe Library）的探针进行QPCR。GAPDH被用作所有基因表达分析的内部对照。如有要求，可提供所有QPCR引物。使用组织溶解缓冲液（Pierce）从冷冻肝脏中提取的蛋白质，使用BSEP（Abgent）、GAPDH（Abcam）抗体进行Western blot分析。使用抗-SRC-2（Bethyl）、磷酸-AMPKα2和AMPKα2（cell Signaling）和β-Actin（Sigma）的抗体，使用标准方法进行HepG2细胞Western blot和联合免疫沉淀分析。

体外激酶分析

我们使用全长纯化的SRC-2蛋白和纯化的AMPK全酶（细胞信号传导），按照制造商的协议（细胞信号传递）进行体外激酶分析。

染色质免疫沉淀

使用先前注射胶原酶的WT和FXR基因敲除小鼠的肝组织进行体内ChIP。经过percol处理以排除死细胞后，添加1%甲醛以产生交联。按照制造商的协议，使用EZ ChIP试剂盒（上游）执行其余的ChIP程序。使用培养中的HepG2肝癌细胞进行实验时，遵循标准ChIP程序。SRC-2抗体来自Bethyl实验室。AMPKα2抗体来自细胞信号。使用Sybr-Green技术（Applied Biosystems）和序列特异性引物对ChIP进行QPCR。将结果归一化为每个案例的输入。可根据要求提供引物序列。

细胞培养

如前所述，从8至12周龄的WT和SRC-2 LKO小鼠中分离出原代小鼠肝细胞（PH）(Chopra等人，2008年). 细胞在含有10%FBS的Williams E培养基（Invitrogen）中培养过夜，然后用siRNA转染或用CDCA处理。针对SRC-2非靶向对照的Smart-pool siRNA购自Dharmacon。治疗48小时后进行RNA分离。用野生型小鼠BSEP启动子驱动的报告基因质粒转染HepG2细胞(Zhang等人，2003年)以及FXRE（Stratagene QuickChange试剂盒）中发生突变的同一启动子，以及SRC-2、FXR的表达质粒和SRC-2的WT SRC-2，AD1，AD2和AD1/2缺失突变体。转染CDCA后48小时测定报告基因水平。已描述了组分活性和显性阴性AMPK腺病毒(Woods等人，2000年). 对于SRC-2激活实验，HepG2细胞转染pG5Luc、bBIND-SRC-2和pBIND-空的和显性负的AMPK（DnAMPK）。转染并用1mM AICAR处理48小时后测定报告基因水平。

统计分析

所有结果均以平均值+SEM表示。P值通过非配对Student t检验和单向或双向方差分析（如适用）计算得出。

补充材料

01

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致谢

我们要感谢S.McGuire、S.Settle、V.Yechoor、M.Tsai、A.Beaudet、A.Antebi和H.Taegtmeyer的有益讨论，感谢R.Lanz的QPCR设置和分析，感谢J.Xu的SRC-1、SRC-2和SRC-3空白小鼠，感谢德克萨斯医学中心消化疾病中心分子形态学核心（DK 56338）在组织病理学方面的帮助，感谢L。Hagey进行胆汁酸成分分析。BSEP启动子报告结构由P.Edwards善意提供。BSEP腺病毒是Y.Wakabayashi赠送的礼物。AMPKα-DKO肝脏由B.Violet慷慨提供。D.M.由NIH支持（R01 DK068804）。F.D.得到了NIDDK的支持（PO1 DK59820）。L.C.由NIH（HL51586）支持。B.W.O.由NIDDK（PO1 DK59820）、NURSA（U19 DK062434）和韦尔奇基金会的拨款支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将进行编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明都适用。

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