Trk神经营养素受体的激活神经营养素

摘要

神经营养素发挥在脊椎动物神经系统发育中的显著作用影响细胞存活、分化和细胞死亡事件(1,2). 神经营养素对神经递质释放、突触强度和连接性(三,4).除了促进轴突和树突分支外，神经营养素用作延长生长锥的化学引诱剂在里面体外(5). 这些作用是由神经营养素结合到两个独立的受体类别，酪氨酸激酶的Trk家族受体和肿瘤成员p75神经营养素受体坏死因子受体超家族(6).

Trk神经营养素受体功能突变导致存活、轴突和树突分支、长期增强，以及行为(7–9). 神经生长因子（NGF），脑源性神经营养因子因子（BDNF）、神经营养素-3和神经营养素-4也与p75结合神经营养素受体，一种潜在的细胞死亡受体，其作用被Trk酪氨酸激酶信号传导所抵消(10,11). 因此调节Trk酪氨酸激酶活性的能力对于神经元存活和分化。

G蛋白偶联受体的配体能够激活此外，丝裂原活化蛋白（MAP）激酶信号通路涉及腺苷酸的经典G蛋白依赖信号通路环化酶和磷脂酶C(12,13). 有丝分裂受体的诱导酪氨酸激酶磷酸化也通过信号转导几种G蛋白偶联受体(14). 特别是表皮生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子1可被G蛋白偶联物反式激活受体秒(12,15,16). 是否激活神经营养受体酪氨酸激酶通过G蛋白偶联受体迄今尚未被证实。

我们已经测试了G蛋白配体偶联的可能性受体可能激活Trk酪氨酸的神经营养素受体激酶亚家族。在这里，我们报告了腺苷和腺苷激动剂可以通过以下机制激活Trk受体磷酸化需要腺苷2A（A_2安培)受体。这个激活不需要神经营养素结合，在PC12细胞以及海马神经元的原代培养。不同于其他酪氨酸激酶受体的结果增加Trk受体活性延长细胞存活时间需要Akt而非MAP激酶信号的时间进程。这些研究结果表明刺激营养的替代方法通过连接不同受体信号在神经系统中的功能路径。

材料和方法

CGS 21680、CPA、A23187和胰岛素样生长因子-1分别为购自Sigma-RBI。ZM 241385购自Tocris Neurochemicals（密苏里州鲍尔文），亚历克西斯生化公司（加利福尼亚州圣地亚哥）PP1，LY294002来自Biomol，K252a来自Calbiochem，PD98059来自新英格兰生物实验室。NGF来自哈兰生物制品公司（印第安纳波利斯）来自PeproTech（新泽西州洛基山）的BDNF。所有其他化合物均来自西格玛。一种针对C末端的抗pan-Trk兔抗血清Trk受体的区域来自Barbara Hempstead（康奈尔）大学）；抗NGF抗体来自Chemicon。抗磷酪氨酸和抗Akt抗体来自圣克鲁斯生物技术。抗磷酸Akt、抗MAP激酶和抗磷酸-MAP激酶抗体来自新英格兰生物实验室。

结果

有丝分裂酪氨酸激酶受体通过G蛋白质偶联受体已在前面描述过(12,15,16).探讨G蛋白偶联受体是否对神经营养素受体信号转导，测试了几种配体的影响PC12细胞中TrkA酪氨酸激酶活性的能力。每个配体的受体都存在于PC12细胞上(21–24). 神经生长因子受体从PC12细胞裂解物中免疫沉淀受体，然后用抗磷酸酪氨酸抗体探测。激活的TrkA受体在腺苷治疗（10μM）时观察到，但在核苷酸，如ATP或GTP（图。​（图1）。1).TrkA双链代表110 kDa和140kDa的完全糖基化形式(17). TrkA的激活其他G蛋白偶联配体未观察到受体，包括缓激肽和多巴胺激动剂、阿扑吗啡和喹匹罗（图。​（图1）。1). 腺苷作用的特异性也通过CGS 21680，2-[（4-（2-羧乙基）苯乙基）]的使用氨基腺苷-5′-N个-乙基甲酰胺，一种选择性腺苷A类_2安培激动剂(25).

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图1

用G蛋白偶联的受体配体激活TrkA受体。稳定转染的PC12细胞表达高水平的TrkA（615）用所示化合物处理2小时。细胞为随后在裂解缓冲液中采集，如材料和方法.用抗pan-Trk免疫沉淀裂解液兔抗血清。免疫复合物通过免疫印迹分析抗磷酸酪氨酸抗体（PY99）。TrkA免疫沉淀然后通过免疫复合物的免疫印迹法确认受体含抗泛Trk抗血清。

腺苷对TrkA受体活性的影响发生在浓度范围（图。​（图22A类).使用1 nM CGS 21680验证了该响应。时间课程腺苷的作用表明TrkA活化的增加是速度慢，需要至少90分钟（图。​（图22B类)，这是与NGF治疗相比延迟。这种增加被抑制了K252a，Trk酪氨酸激酶的已知抑制剂（见下文）。它是腺苷治疗导致产生PC12细胞分泌的NGF可以自分泌方式刺激TrkA受体。由于缺少PC12细胞上清液的神经突起生长活性用腺苷和抗NGF抗体对腺苷的作用（数据未显示）。

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图2

TrkA受体腺苷激活的时间进程和剂量。(A类)不同浓度的腺苷给予PC12 615细胞2小时或NGF（1 ng/ml）10小时分钟。细胞也按指定剂量用CGS 21680处理2小时(B类)PC12细胞（615）用腺苷（10μM）不同时间或与5 ng/ml NGF混合10分钟。免疫印迹分析检测磷酸化TrkA受体使用PY99抗磷酸酪氨酸抗体。Trk受体的数量在每种情况下，通过免疫印迹法进行验证。

腺苷与四种不同的G蛋白偶联受体相互作用，指定为A₁，A_2安培,A类_2B型、和A_三受体(26).A区₂表达一类腺苷受体在PC12细胞中，通过放射配体结合检测到(23).腺苷不与TrkA受体结合。没有位移属于¹²⁵I-NGF与过量腺苷结合在过度表达TrkA的PC12细胞中（1 mM）或CGS 21680（1μM）（表​（表1）。1). PC12细胞表达p75神经营养素受体，也结合¹²⁵I-NGF、，之后在HEK 293细胞中进行了类似的实验用TrkA转染。同样，腺苷或CGS 21680没有置换¹²⁵I-NGF绑定到表达TrkA的HEK 293细胞（表​（表1）。1). The concentrations of腺苷和CGS 21680大约是它们的100倍通常用于A_2安培受体结合和信号传递研究(27).

验证腺苷与A类_2安培受体，几种腺苷类似物已使用。CGS 21680的低浓度（10 nM）也有类似的增加磷酸化TrkA受体与腺苷具有相同的时间进程（图。​（图22A类和​和3三A类). 相比之下选择性A₁受体激动剂，N个（6） -环戊基腺苷没有影响（图。​（图3三A类). PC12细胞培养用A_2安培拮抗剂ZM 241385，4-（2-[7-氨基-2-（2-呋喃基）-1,2,4-三唑[1,5-a]（1,3，5） 三嗪-5-氨基]乙基]苯酚，结合A类_2安培高亲和力受体(28)被对抗的腺苷对TrkA受体磷酸化的影响（图。​（图3三A类). 这些结果与腺苷A_2安培受体介导的增加Trk受体活性。

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图3

A对TrkA的腺苷活化_2安培受体。(A类)PC12细胞（615）用A类_2安培激动剂CGS 21680（10 nM）和A₁兴奋剂CPA（10nM）持续2小时。ZM 241385（10nM），A_2安培拮抗剂，在处理前与细胞孵育15分钟腺苷（10μM）2小时(B类)PC12细胞（615）与指示浓度的PP1、Src家族激酶抑制剂(30)，持续30分钟，然后用腺苷（10μM）2小时。通过以下方法评估TrkA的激活使用PY99进行免疫沉淀和免疫印迹分析抗磷酸酪氨酸抗体。

G蛋白偶联受体与受体酪氨酸激酶的激活尚不清楚。高级工程师家族激酶被认为是有丝分裂受体的介质几种G蛋白偶联受体对酪氨酸激酶的反式激活作用激动剂，如溶血磷脂酸、血管紧张素II、凝血酶和缓激肽(14,29). 测试Src家庭成员是否参与腺苷（抑制剂PP1）激活Trk受体(30)已使用。用1μM PP1处理PC12细胞后酪氨酸磷酸化TrkA受体水平降低腺苷诱导（图。​（图3三B类). 浓度增加PP1的抑制作用逐渐增强。这些结果提示腺苷对TrkA活性的调节可能是由Src家族成员调解。Src以前参与过与其受体下游的NGF信号转导有关(31). 然而，可以想象，Src酪氨酸激酶活性的成员可能被G蛋白激活。Lck已经证明了这一点作用于β肾上腺素能受体下游的胸腺细胞及其受体活动可以增加体外按G(32).

海马神经元。

为了扩大腺苷对Trk受体作用的普遍性，我们从E17大鼠胚胎中建立了原代海马神经元培养物。海马神经元主要表达TrkB受体并作出反应至BDNF（图。​（图4）。4). 这些神经元也快递和A₁和A_2安培受体(33)而不是TrkA受体。用10μM处理腺苷或10 nM CGS 21680持续2小时会引起磷酸化海马神经元中的TrkB受体（图。​（图44 A类和B类)类似于通过以下方式激活TrkA受体腺苷。一个A₁-然而，特异性激动剂CPA，没有激活TrkB受体（图。​（图44B类)，确认这种效应对A的特异性_2安培受体。这些结果不仅扩大了腺苷对海马的作用但也证明TrkB也可以被激活通过A发出信号_2安培受体。

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图4

海马神经元TrkB受体的腺苷激活。主要E17海马神经元培养物的制备如材料和方法并用(A类)各种类型的CGS 21680（10 nM）或BDNF（1 ng/ml）时间和(B类)腺苷（10μM），CGS 21680（10 nM），CPA（10 nM）或BDNF（10 ng/ml）2小时。激活TrkB通过免疫沉淀和Western blotting对受体进行评估抗磷酸酪氨酸抗体。

下游信号转导。

为了进一步描述腺苷激活的信号通路进行了实验。废除100 nM K252a预处理腺苷对TrkA酪氨酸激酶活性的激活（图。​（图5）。5). K252a的浓度用于阻断TrkA受体的NGF激活(34)以及随后的神经营养因子的生物学效应。

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图5

腺苷对MAP激酶和Akt活化的影响。PC12细胞（615）用腺苷（10μM）处理不同时间或不含K252a（100 nM）或LY294002（10μM）。这些细胞是随后在裂解缓冲液中收获；裂解物和免疫沉淀随后用抗磷酸-MAP激酶对样本进行免疫印迹，抗磷酸Akt和抗磷酸酪氨酸。使用反MAP重新发布进行激酶和抗pan-Trk抗体以确保相等蛋白质负荷。

许多G蛋白偶联受体激活MAP激酶途径。事实上，在腺苷治疗的10分钟内在PC12细胞中检测到磷酸化MAP激酶（图。​（图5），5),与以前的观察结果一致(35–37). 10分钟后活化MAP激酶水平降至基线水平。激活的MAP激酶可以通过A_2安培受体，或通过Trk受体信号传导。要区分这些替代品，PC12细胞用腺苷处理有无K252a。使用K252a浓度专门阻止TrkA信号(34)，我们发现MAP激酶活性没有改变（图。​（图5）。5). 因此，MAP激酶诱导发生很快，而腺苷激活Trk的时间较慢并且不影响MAP激酶活性。此结果在与G蛋白偶联受体的其他例子相比反式激活，直接刺激MAP激酶活性酪氨酸激酶受体下游(14).

受体酪氨酸激酶激活的另一条途径是磷脂酰肌醇3′-激酶（PI3激酶）/Akt。有趣的是，腺苷（图。​（图5）5)或CGS 21680治疗PC12（数据未显示）通过磷酸特异性抗体。此响应以前未与关联腺苷作用。Akt激活的时间过程与腺苷诱导的Trk自身磷酸化。这种效果是用K252a（100 nM）或LY2494002（10μM），一种PI3-激酶抑制剂。这些结果表明Akt腺苷的激活依赖于Trk和PI3-激酶。

营养作用。

测试腺苷激活的Trk受体的功能后果我们评估了腺苷维持退出NGF后分化的PC12细胞。培养后在没有NGF的情况下48小时，通过以下方法评估细胞存活率测量LDH释放。而没有NGF的细胞生长迅速细胞死亡，CGS 21680一次性治疗有效挽救近50%的细胞（图。​（图66A类). CGS 21680的作用需要TrkA受体，因为K252a（100 nM）消除了阳性CGS 21680在阻止激活TrkA受体（图。​（图5）。5). 同样，类似剂量的K252a逆转了NGF的存活效应，但没有逆转胰岛素样的存活效应生长因子1。

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图6

腺苷激动剂对PC12和海马的营养作用缺乏神经营养素的细胞。(A类)NGF分化制备PC12细胞，然后提取NGF和血清用于48小时，如中所述材料和方法.关于NGF提取，将不同浓度的CGS 21680（CGS）添加到媒体。CON，无需添加。NGF（50 ng/ml），胰岛素样生长因子1（=IGF-1）和CGS 21680（10 nM）与NGF上的K252a（100 nM）、LY294002（10μM）或PD98059（25μM）退出。(B类)制备海马神经元并B27退出48小时，如材料和方法B27退出后，各种浓度的CGS21680（CGS）被添加到媒体中。CGS 21680（10 nM）和BDNF（100在B27提取时，与K252a（100 nM）一起添加。全部LDH水平被量化，细胞死亡百分比计算为中描述的材料和方法。所有条显示三个独立实验的平均值+SEM。

在海马获得了与CGS 21680相似的存活结果神经元在缺乏BDNF的情况下生长（图。​（图66B类). 行动CGS 21680再次呈剂量依赖性和K-252a敏感性。治疗CGS 21680有效救出了60%以上的细胞（图。​（图66B类). 因此，一种有效的腺苷激动剂在纳米摩尔浓度能够逆转PC12细胞和海马神经元由以下物质引起的营养支持的撤回神经营养素。

K252a阻断腺苷营养作用的能力以及Trk受体活性的诱导表明Trk受体下游信号参与了这一过程。这已得到证实通过LY294002消除CGS 21680营养效应的能力提取NGF后（图。​（图6），6)表明PI3-激酶/Akt腺苷的存活效应与该通路有关。一致由于缺乏MAP激酶反应，我们没有发现丝裂原活化激酶抑制剂PD98059对CGS 21680提供的存活率。

讨论

腺苷受体激活对神经肽和神经递质系统(38). 这里，我们报告一个神经细胞中腺苷对神经营养素的影响发送信号。通过与Trk受体酪氨酸激酶的串扰，腺苷能够激活PI3-激酶/Akt级联，导致PC12和海马细胞的存活反应。这个反应类似于NGF和BDNF对Trk的影响受体，但在较长的时间过程中有所不同。

神经营养素受体和A_2安培受体有他们的中枢和外周神经系统有相当大的重叠分配。在中枢神经系统中，A_2安培受体在纹状体、杏仁核和嗅结节中表达，大脑皮层、海马体和小脑(39). 所有这些区域表达TrkB受体。在外周神经系统中，A类_2安培受体表达已被定位主要累及背根神经节和颈上神经节(40),表达TrkA受体的两个区域。有趣的是，小鼠缺乏腺苷A中_2安培受体显示减少对热刺激的敏感性(41). 值得注意的是，老鼠NGF或TrkA突变也显示对热和机械刺激。

什么是体内观察到这些事件的后果在文化方面？在缺氧或缺血条件下，腺苷大量释放，可以调节细胞保护。A类_2安培受体激动剂，如CGS 21680，具有已证明对缺血具有神经保护作用(42,43)以及红藻氨酸诱导的神经元损伤(44)在动物身上。然而，A类_2安培据报道，拮抗剂也能减少缺氧缺血性神经元损伤(43,45). 差异效应A类_2安培受体配体可能反映短期效应腺苷受体的长期效应(46). 急性影响腺苷类似物对神经保护的作用可能与慢性治疗。受体酪氨酸激酶的参与，如Trk亚家族可能解释了功能上的差异腺苷作用的后果。腺苷的一个显著特征Trk的反式激活是Trk介导的较长时间过程信号传导，类似于神经营养素诱导的信号传导。

腺苷被认为是一种潜在的治疗多种疾病的药物神经系统疾病，包括脑缺血、睡眠疾病、痛觉过敏、帕金森氏病和其他神经退行性疾病(47). 以前对生长停滞的影响腺苷对PC12细胞的酶诱导作用(48,49)很可能是通过TrkA受体的反式激活来解释。我们关于腺苷揭示了激活神经营养素信号的途径系统中缺乏神经营养素。与其他相比涉及受体酪氨酸激酶的反式激活事件导致MAP激酶活性短暂增加，G蛋白偶联受体神经营养素受体信号导致选择性激活PI3-激酶/Akt途径在长时间过程中的作用。

这些发现为以下神经保护作用提供了机制：腺苷参和A的结合_2安培受体，Trk酪氨酸激酶受体的反式激活，以及PI3-激酶/Akt通路的选择性诱导。许多已经采取了使用神经营养素治疗阿尔茨海默病的方法痴呆、肌萎缩侧索硬化和外周感觉神经病变(50,51). 然而，在使用方面存在相当大的障碍神经营养分子与他们的困难有关分娩和药物动力学及意外副作用(51). 这个腺苷对生存信号的选择性和持续作用途径表明小分子可能被用于靶向人群同时表达腺苷和Trk受体的神经元。这个G蛋白偶联受体小配体的鉴定调节神经细胞酪氨酸激酶活性的家族提供了在正常和神经退行性疾病。

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