引言
甲型流感病毒（IAV）是一种包膜、分段的负链RNA病毒，感染多种鸟类和哺乳动物。IAV感染的第一步是通过其主要表面蛋白血凝素（HA）与唾液酸的结合附着到宿主细胞上，唾液酸普遍存在于细胞表面的糖脂和糖蛋白上。在已经对这种相互作用的结构要求进行了详细研究的情况下，对特定唾液酸受体（例如，对N-连接糖蛋白、O-连接糖蛋白或神经节苷脂，甚至对这些组中的特定受体）的附着是否以及如何影响随后的内吞步骤的了解更少。显然，对IAV成功使用的内吞途径的了解将增加我们对IAV细胞和物种向性的认识。反过来，这将有助于我们理解在人类或动物宿主偶尔共同感染期间，当前流通的人类血清型和动物病毒之间的RNA片段交换可能产生具有大流行潜力的新型病毒的生成要求。
长期以来，氯菊酯介导的内吞作用（CME）被认为是IAV细胞进入的主要途径[1],[2]到目前为止，它是最具特征的内吞途径。从活细胞成像中获得的证据表明从头开始病毒附着部位氯氰菊酯包被凹坑的形成[3]以及在此过程中对衔接蛋白epsin1（而非eps15）的需求[4]尽管最近在CHO细胞中进行的一项研究表明，在IAV进入中对N-连接糖蛋白的特异性需求，但尚未鉴定出将病毒进入与epsin 1或其他适配器连接的特异性跨膜受体[5].
最近的一些论文为IAV使用替代进入途径提供了指示。药物或基因干预阻断CME的研究表明，IAV有能力通过其他内吞途径进入宿主细胞[4],[6],[7]此外，活细胞成像还显示了同时存在非涂层和氯氰菊酯涂层凹坑的进入路径[4]然而，这种替代性IAV进入途径还没有任何详细的特征，除了需要适当的唾液酸部分外，还没有确定受体使用的任何特异性要求。
在过去的几十年中，在真核细胞中发现了多种内吞途径[8],[9],[10]它们的出现、数量和机制细节似乎因细胞类型、组织和物种而异，病毒利用它们作为进入途径，使它们成为宿主和细胞型允许感染的重要因素[11],[12]除CME外，已经证明不同的病毒通过小窝、大胞饮作用或其他不太清楚的途径进入细胞[11],[12]最常见的是，特定内吞途径的选择与特定受体的利用有关，该受体有助于通过特定途径旅行。尽管如此，许多受体通过其能力进入多种途径，从而具有灵活性。对于IAV而言，由于明显缺乏IAV特异性蛋白受体，增加了潜在进入途径解剖的复杂性。
将IAV进入途径分离为可独立研究的途径，将有助于对IAV进入通路进行全面的实验表征。虽然与氯氰菊酯共定位是通过这一途径进行内吞作用的既定标记，但大松果体或大多数其他内吞室完全缺乏独特标记[13],[14]使这类研究复杂化。此外，对于任何有关内吞途径的研究来说，重要的是有大量文献证明，这些途径高度依赖于实验细胞培养条件[15]–[19]在一种细胞类型中构成的通路可能不存在，或在其他细胞类型中可由特定实验条件诱导。此外，对特定内吞途径的操纵可能导致对其他特定途径的上调或下调。在这里，我们建立了进入分析条件，允许将IAV的细胞进入分解为动力学依赖（DYNA-DEP）和动力学非依赖（DYA-IND）成分。Dynamin是一种在新形成的内吞囊泡颈部周围形成多聚体的大GTP酶。GTP水解是捏取囊泡所必需的[20]虽然CME完全依赖于dynamin，但其他几种内吞途径不需要dynamin[21]我们使用药物抑制剂以及通过表达显性阴性突变体和应用siRNA诱导的基因沉默作为工具，对动态非依赖性IAV进入途径进行了广泛表征。综上所述，这些结果确定了一条与大胞饮作用非常相似的途径，作为IAV的新进入途径。
结果
用于定量分析IAV进入的荧光素酶报告试验
为了确定和表征IAV可能的非CME进入途径，我们采用了荧光素酶报告分析[22]以便能够通过测量分泌的Gaussia萤光素酶的活性来定量测定感染或进入。感染前24小时，用质粒（pHH-Gluc）转染HeLa细胞，在流感a/WSN/33（H1N1）（以下简称IAV-WSN）NP段的非翻译区（UTR）的控制下，该质粒可组成合成（由人类PolI启动子驱动）编码高斯荧光素酶的负链病毒RNA（vRNA）NP段。IAV感染后，病毒聚合酶亚单位和NP的联合表达将驱动来自负链vRNA的荧光素酶mRNA的转录，并随后合成Gaussia荧光素酶。
剂量-反应曲线证明了该试验在抑制剂筛选中的适用性()为已知的IAV进入抑制剂Bafilomycin A1（BafA1）获得[23].BafA1作用于液泡型H（+）-ATP酶，从而防止内胚体酸化，从而将IAV困在具有不允许病毒膜融合的管腔pH值的核周未成熟内胚体中。值得注意的是，dynashore是GTPase dynamin2的一种小分子抑制剂，对氯氰菊酯和小窝蛋白介导的内吞作用中内吞囊泡的形成至关重要[8]以及一种描述不太清楚的网格蛋白和小窝蛋白依赖性内吞途径[8],[19]，未产生明显抑制作用().
用于IAV进入的定量分析的萤光素酶报告基因测定。感染前24小时，用IAV报告质粒pHH-Gluc转染（A、B）HeLa细胞。在感染IAV前1小时添加抑制剂（WSN菌株；MOI为0.1）。细胞始终保存在37°C的DMEM中，补充10%FCS。荧光素酶活性（RLU，相对光单位）在16小时p.i.进行测量，并绘制在相对于对照组的Y轴上（在0.2%二甲基亚砜（两种抑制剂的溶剂）存在下的感染）（误差条表示三倍得出的S.D.）。（A） BafA1的抑制作用（x轴上的浓度范围为0.625 nM至10 nM）（B）Dynasore的抑制作用。；IAV（WSN株；MOI 0.5株）多周期感染的2小时至16小时p.i.和-1小时至2小时p.i（如x轴所示）。与面板A和B中的Y轴和对照一样，BafA1只有在接种IAV之前已经存在时才具有强烈的抑制作用。在每次2小时（−1小时至2小时）停止BafA1后，显示抑制的可逆性。（D） 通过共焦荧光显微镜检查10 nM BafA1对IAV颗粒亚细胞定位的影响。HeLa细胞生长在玻璃盖玻片上，感染IAV（WSN株；MOI为10株），并在30分钟、3小时或6小时后固定（分别为第1、2或3列）。感染是在0.2%二甲基亚砜（上排面板）或存在10 nM BafA1（下排面板）的情况下进行的。用TOPRO-3（红色）DNA染色观察细胞核。用NP（绿色）单克隆抗血清染色观察IAV感染。在没有抑制剂的情况下，IAV在3小时后定位于细胞核，而新的病毒颗粒在6小时后扩散到细胞质。BafA1（下行面板）导致传入的病毒颗粒积聚在核周围位置。（E） 通过单周期Gluc进入试验定量测定IAV进入。HeLa细胞（补充10%FCS的DMEM中10000个细胞/孔）在感染前24小时用pHH-Gluc转染，并用感染性IAV颗粒进行系列稀释（绘制在x轴上）。感染后2小时，添加10 nM BafA1以阻止进一步进入。将细胞再培养14小时以允许荧光素酶活性的表达（y轴；相对光单位，RLU）。（F） 在Gluc-entry分析中Dynasore和BafA1对IAV进入的影响。从感染前1小时（菌株WSN；MOI 0.5）到感染后2小时，Dynasore（DY，深灰色条带；20、40或80µM）或BafA1（浅灰色条带；1.25、2.5或5nM）存在，之后用含有10nM BafA1的培养基代替含抑制剂的培养基以阻断任何进一步的进入。细胞再孵育14小时，以定量表达荧光素酶活性（y轴；RLU相对于无抑制剂的对照感染）。BafA1对IAV的进入具有剂量依赖性抑制作用，而dynasore对IAV进入无明显抑制作用。以2小时p.i.的速度添加Dynasore（DY，20，40或80µM）（黑色条；MOI 0.5；在-1到2小时内不存在抑制剂）表明Dynasor不具有进入后效应。
BafA1在进入阶段特别抑制IAV，如。持续存在10 nM BafA1（感染前1小时添加到细胞中）16小时可完全防止感染。相比之下，在感染后1小时或2小时添加BafA1导致高水平的荧光素酶活性（再次在16小时p.i.时测量），分别为未添加BafAl的对照组的63%或90%，表明进入基本上在2小时内完成显示BafA1的抑制是可逆的，因为2小时后抑制剂的退出导致高水平的感染。共聚焦显微镜证实了BafA1对IAV进入的特殊作用，表明BafA1如预期的那样，将IAV颗粒捕获在核周位置，可能是在非酸化的内体中(). 随后利用BafA1建立特定IAV进入试验（以下简称Gluc进入试验）。将转染pHH-Gluc的HeLa细胞在一系列MOI中接种IAV并培养2小时，然后用含有10%FCS和10 nM BafA1的完整生长培养基替换进入培养基，以防止病毒进一步进入。进一步孵育14小时后，通过测定荧光素酶活性间接量化输入，证明感染剂量与广泛MOI中荧光素素酶活性之间的定量相关性(). 接下来测试间接Gluc进入试验，以检测抑制剂对IAV进入的影响。Dynasore或BafA1()在进入期间（感染的前2小时），将其加入培养基（含有10%FCS的DMEM）中，并在接种物被含有BafA1的生长培养基取代时移除。浓度高达80µM的dynasore不抑制进入，这与中显示的结果一致相比之下，1.25 nM BafA1已经抑制了60%以上的进入(). 作为对照，在感染后2小时加入dynashore，以分析药物是否影响进入后阶段的IAV复制。正如预期的那样，80µM dynasole在每天2至16小时内不会显著抑制IAV的复制(). 因此，通过Gluc进入试验，我们可以定量研究特定抑制剂对IAV进入的影响，只要抑制剂在进入后阶段不会不可逆转地影响IAV复制。
此外，dynasore对IAV进入的抑制作用不足表明，在这些实验条件下，IAV能够通过一条完全冗余于任何动力学依赖（DYNA-DEP）进入途径（包括经典CME途径）的途径进入细胞。此外，当IAV通过这种新型的非动力依赖（DYNA-IND）途径传播时，IAV显然是通过低pH值的隔间进入的，因为进入对BafA1完全敏感。
血清诱导DYNA-IND IAV进入途径
由于已知血清中存在的因子具有诱导特定内吞途径的潜力，我们进一步探索了新的DYNA-IND IAV进入途径所需的条件（使用Gluc-entry分析），方法是在胎牛血清（FCS）浓度增加的情况下，在PBS中接种细胞。虽然dynasore完全抑制进入PBS，但加入5%和10%的FCS会导致dynasoer抗性进入水平增加()表明存在血清诱导型DYNA-IND IAV进入途径。这种效应并不是由于在实验期间通过CME进入细胞的水疱性口炎病毒（VSV）灭活了dynasoire引起的[24],[25]，在存在10%FCS的情况下对80µM dynasoir仍然敏感(). 在此同意，无论是否存在FCS，Dynashore都抑制了已知通过CME发生的转铁蛋白的摄取(图S2，面板A）。正如预期的那样，在含有10%FCS和80µM dynasore的情况下，DYNA-DEP进入PBS和DYNA-IND进入都需要唾液酸受体才能有效进入，因为用神经氨酸酶对HeLa细胞进行预处理时，几乎完全取消了通过任一途径进入(). 通过进行时间过程实验，比较了DYNA-DEP和DYNA-IND进入途径的动力学，在不同时间点添加10 nM BafA1终止IAV进入(). 与通过DYNA-DEP途径（PBS中唯一可用的途径）进入相比，在FCS存在的情况下（假设DYNA-DEP和DYNA-IND进入途径都可用时）进入显示出类似的动力学。相比之下，通过DYNA-IND途径（这是在存在10%FCS和80µM dynasore的情况下唯一有效的途径）进入的速度较慢。这种差异在15分钟后最为显著，而在4小时后达到相似的进入水平。
血清诱导Dynasore抗性进入途径。（A） FCS（PBS）浓度增加对IAV进入的影响。使用Gluc进入测定法，在不存在（灰色条）或存在（黑色条）80µM dynasole的情况下用IAV（菌株WSN；MOI 0.5）感染HeLa细胞。在FCS浓度增加的情况下确定进入（绘制在x轴上）。每16小时p.i.测定荧光素酶活性（绘制在y轴上，相对于在没有dynasore的情况下获得的活性（灰色条，100%），针对每个浓度的FCS。在存在10%FCS的情况下，IAV的进入变得完全抗动力。（B） 在存在10%FCS的情况下，80µM dynasore（DY）抑制VSV进入。HeLa细胞在没有（灰色条）或存在（黑色条）80µM dynasore（DY）的PBS或PBS+10%FCS（标记为10%FCS）中感染VSV。在存在10%FCS VSV感染的情况下，似乎仍然对dynasoir完全敏感。（C） IAV通过动力蛋白依赖性（DYNA-DEP）或动力蛋白非依赖性（DYNA-IND）途径进入取决于唾液酸受体的存在。Hela细胞用霍乱弧菌感染前用神经氨酸酶（NEU；黑条）或模拟处理（-；灰条）去除表面暴露的唾液酸。使用Gluc-entry分析感染细胞（WSN菌株；MOI 0,5）。在含有10%FCS和80µM dynasore的PBS中确定DYNA-DEP条目，并在PBS中测定DYNA-IND条目。这两种途径似乎对细胞脱唾液酸化同样敏感。（D） DYNA-DEP IAV进入和DYNA-IND IAV进入的动力学比较。使用面板C所述的Gluc-entry分析法，在含有10%FCS和80µM dynasore（80 DY）的PBS和PBS中的DYNA-IND条目中确定DYNA-DEP条目。通过在指定的时间点p.i添加含有10 nM BafA1的全生长培养基，允许条目持续15至240分钟（x轴）。荧光素酶活性绘制在绝对RLU（y轴）上，表明在进入4小时后，通过两条途径获得了类似的进入效率。用不同批次的血清重复多次实验，得出类似的结果。
为了验证和扩展这些结果，我们通过使用NP抗体进行免疫过氧化物酶染色，观察到感染细胞数量的减少(). 在含有或不含血清的PBS中，在MOI为1的情况下，将一些哺乳动物和鸟类来源的不同细胞感染2小时。2小时后，用含有10%FCS和10 nM BafA1的生长培养基替换接种物，14小时后检测NP的表达。在PBS中孵育后，80µM dynasort的存在完全禁止染色，而血清dynasoter的存在则没有影响。因此，血清诱导的DYNA-IND进入途径在所有五种细胞系中都起作用，包括人类上皮性气道癌细胞系A549。
血清诱导的DYNA-IND IAV进入不同的细胞类型。用IAV（MOI 2）感染HeLa细胞、A549细胞（人上皮性肺癌细胞）、MDCK细胞（犬肾细胞）、DF-1细胞（鸡胚成纤维细胞）和E-36细胞（中国仓鼠肺细胞），在没有或存在80µM dynasore（DY）的情况下，在PBS或补充10%FCS的PBS中进行感染。2小时后，将进入培养基替换为生长培养基（含10%FCS和10 nM BafA1的DMEM），并持续感染14小时，然后固定、渗透细胞并用NP单克隆抗体染色（过氧化物酶染色检测）。
为了证实我们的结果并进一步证明IAV利用DYNA-DEP和DYNA-IND进入途径，我们额外使用了IAV类病毒颗粒（VLP）直接进入分析[26]这些VLP的包膜中含有IAV HA和NA，并含有与流感基质蛋白-1（BlaM1）融合的β-内酰胺酶报告蛋白，该蛋白允许快速、直接检测进入，与病毒复制无关。病毒膜和内胚体膜融合后，BlaM1获得细胞质保留的荧光底物CCF-2，经BlaM1裂解后，该底物转移到可通过流式细胞术检测到的较短荧光发射波长。在没有或存在10%FCS的情况下，使用含有HA和NA的VLP进入HeLa细胞，这些VLP来自IAV-WSN（具有严格的α2–3连接唾液酸结合特异性）或来自流行性1918 IAV（HA来自a/NewYork/1/18，与α2–2和α2–6连接唾液酸相结合；NA来自a/BrevigMission/1/18）。当接种物中未添加血清时，dynasoter严重抑制了两株IAV株VLP的进入()而10%FCS的存在使入门级完全抗动力障碍。(). VLP条目的量化如所示.
在VLP进入测定和动力蛋白2的siRNA敲除中鉴定DYNA-IND进入。FACS直方图显示了IAV VLP的输入，包含BlaM1报告器，携带WSN（A和B）或1918（D和E）HA和NA，在没有（A和D）或（B和E）10%FCS的Optimem（OPTI）中，以及在没有（红线）或存在（蓝线）80µM dynasore的情况下。VLP融合后BlaM1释放到细胞质中导致CCF2底物裂解，从而导致447 nm处的荧光信号发射（X轴；级联蓝）。在直方图中，条目显示为高荧光（灰色区域表示未感染细胞的背景荧光）。（C和F）FACS结果的量化。从每次测量中减去背景荧光（几何平均值），并将数据归一化为Optimem中的VLP条目，无DY（面板A和D的红色曲线）。在10%FCS存在下，dynasore不抑制VLP的进入，而在PBS中，dynashore阻止了BlaM1对其CCF2底物的进入。在血清存在下，VLP进入效率更高。（G） 通过siRNA沉默下调动力蛋白2的作用。在感染靶向dynamin-2（DYNA）的两种不同siRNAs前48小时转染HeLa细胞，对其血清诱导的DYNA-IND进入进行分析。siRNA处理后的细胞感染PBS（灰条）或含有10%FCS（黑条）的PBS中的假病毒WSN-Ren，感染后16小时后测定荧光素酶活性（y轴；相对于转染干扰siRNA的细胞感染的RLU）。当进入PBS（灰色条）时，假病毒WSN-Ren（MOI 0.5）的进入减少了50%至70%，而在10%血清（黑色条）的存在下，进入没有显著影响。（H） Western blot显示转染siRNAs 48小时后动态蛋白2（与微管蛋白相比）被击倒。（一） siRNA转染48小时后，定量动态蛋白2（dyna）mRNA（通过定量RT-PCR测定）和蛋白质（通过western blot的密度扫描测定）的残留水平。将数据归一化为18S RNA（RT-PCR）或微管蛋白水平，并计算与作为对照的打乱siRNA转染后获得的水平相关的数据。
重要的是，为了通过一种独立于dynasoter的方法证实血清诱导进入途径的存在，我们使用siRNA诱导的dynamin2沉默。表明两种不同的siRNA对siRNA转染后48小时内雷尼利亚荧光素酶编码假病毒WSN-Ren[27]在没有FCS的HeLa细胞中，而在10%的血清中，未观察到进入水平的降低，这证实了用dynasore获得的结果。通过蛋白质印迹分析动力蛋白2蛋白水平的敲除（siRNA转染后48小时）()并在中进行量化这也显示了定量RT-PCR测定的dynamin2 mRNA水平的下调。
我们的结论是，血清可以诱导几种不同细胞类型的DYNA-IND进入途径。证据是通过复制依赖性（Gluc进入试验和感染细胞的免疫检测）和复制独立性试验（VLP进入）获得的，后者允许立即检测融合介导的病毒M1蛋白进入细胞质。
生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂和肌动球蛋白网络动力学减少DYNA-IND进入IAV
DYNA-IND进入途径通过使用80复合激酶抑制剂库的抑制剂谱进一步表征。使用Gluc-entry分析在10%FCS中检测血清诱导的DYNA-IND进入。添加80µM dynasore以阻断CME和任何其他潜在的DYNA-DEP进入途径。这通过避免冗余进入途径的潜在掩蔽效应，允许对新途径进行独立抑制剂分析。在37°C下用激酶抑制剂（10µM）预培养细胞1小时，然后在10%FCS和80µM dynasore存在下接种病毒（MOI 0.5）2小时（DYNA-IND条目）。同时，在PBS中进行接种，以比较抑制剂对DYNA-DEP进入的影响。2小时后，将培养基和抑制剂替换为含有10%FCS和10 nM BafA1的全生长培养基，以便在与DYNA-IND和依赖性进入试验相同的条件下表达Gluc活性。六种激酶抑制剂表现出非歧视性作用，抑制DYNA-DEP和DYNA-IND进入()：蛋白激酶C（PKC）抑制剂Ro 31-8220、鹿特伦（均显示中度细胞毒性，结果未显示）和金丝桃素，这三种药物此前均被鉴定为IAV抑制剂[28],[29]; 高细胞毒性泛特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白酶抑制剂staurosporine；不可逆PI-3激酶抑制剂沃特曼和受体酪氨酸激酶抑制剂TYR9。为了研究其中一些抑制剂是否影响IAV进入后阶段的复制，我们进行了相同的实验，但现在在病毒进入后添加激酶抑制剂。因此，四种抑制剂似乎对进入后的过程产生了显著的抑制作用(). 尽管可能性不大，但我们不能正式排除仅针对两种进入途径中的一种的进入后流程受到影响。有趣的是，虽然没有发现特定的DYNA-DEP进入抑制剂，但15种抑制剂（没有显示细胞毒性作用，数据未显示）对DYNA-IND进入产生显著（p<0.05）抑制（>5倍）(). 这包括钙调素依赖性激酶抑制剂肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和CaMKII以及七种不同生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。与上述三种非特异性PKC抑制剂相比，PKC抑制剂BIM-1和HBDDE似乎对DYNA-IND进入具有特异性抑制作用。这些药物对DYNA-IND进入的特殊作用不仅表现在PBS中DYNA-DEP进入缺乏抑制，而且还表现在当进入后（感染后t=2小时）添加时，15种化合物均未诱导>2倍的抑制。在A549人上皮性肺癌细胞上重复进行激酶库筛选，以确认潜在更自然宿主细胞系的结果。获得的抑制曲线与HeLa细胞的抑制曲线非常相似，但AG879（99%抑制）的强效应和AG825（39%抑制）和Tyr51（68%抑制）对DYNA-DEP进入的中等效应除外。().
在IAV进入试验中筛选八十种复合蛋白激酶抑制剂库。HeLa细胞在感染前1小时开始与激酶抑制剂以10µM的浓度孵育（菌株WSN；MOI 0.5）。在DYNA-DEP进入条件（进入PBS；黑条）和DYNA-IND进入条件（加入PBS补充10%FCS和80µM dynasore；灰色条。此外，为筛选进入后的影响（条纹条），将所有抑制剂每2小时添加到进入期间未经抑制剂处理的细胞中（存在10%FCS）。（A） 对两种进入途径都有抑制作用的抑制剂，大多也会影响进入后的事件。（B） 影响DYNA-IND进入但对DYNA-DEP进入或进入后效应均无影响的抑制剂。（C） 所有激酶抑制剂也在A549细胞上筛选。黑色和灰色条对应DYNA-DEP和DYNA-IND条目。（D） 列出了不同激酶抑制剂的抑制靶点。所有抑制剂均在10µM的标准浓度下进行了测试。然而，对于某些抑制剂，可能需要更高的浓度才能有效抑制其特定靶点，而对于其他抑制剂，该浓度相对较高，其他靶点也可能受到抑制。例如，已知沃特曼在10µM浓度下抑制PI4激酶和MLCK。
据报道，MLCK抑制剂ML-7和ML-9对其靶激酶具有高度特异性[30]MLCK磷酸化激活非肌肉肌球蛋白II轻链，表明功能性肌球蛋白网络可能对DYNA-IND进入IAV至关重要。通过测试肌凝蛋白II重链活性抑制剂Blebbistatin的作用，以及通过破坏肌动蛋白微丝（细胞质蛋白酶B和D）、增强肌动蛋白聚合（茉莉酸内酯）或抑制肌动蛋白聚合力（拉通库林A）来影响肌动蛋白动力学的几种抑制剂的作用，进一步验证了这一点。肌动蛋白抑制剂以所需的最低浓度使用，以诱导肌动蛋白细胞骨架中清晰可见的变化，这是通过FITC-指骨样蛋白染色预先确定的（结果未显示）。而抑制剂不影响DYNA-DEP的进入()使用Gluc进入试验，所有抑制剂以及ML-7和ML-9均显著抑制DYNA-IND进入().
IAV进入DYNA-IND需要肌动球蛋白网络动力学。（A和B）影响肌动蛋白聚合/解聚的化合物（20µM细胞松弛素D[CYTD]、20µM细胞松弛素B[CYTB]、1µM拉通库林A[LATR]、1¦µM茉莉基内酯[JASP]）、MLCK抑制剂（5µM ML-7和5µM ML-9）和肌球蛋白II抑制剂（80µM Blebbistatin[BLEB]）使用Gluc-entry分析（HeLa细胞；菌株WSN；MOI 0.5；感染前1小时至2小时p.i.用抑制剂孵育），检查其对DYNA-IND IAV进入PBS（A）或DYNA-DEP IAV进入（PBS，10%FCS和80µM发电机）（B）的影响。16小时p.i.测定荧光素酶活性（RLU绘制在y轴上，相对于在没有影响actomysoin网络的化合物的情况下获得的活性（灰色条，100%）。（C） HeLa细胞的共聚焦图像的一个示例，表达野生型Rab5-GFP融合蛋白（Rab5 wt）（上面板，绿色荧光识别转染细胞）或接种IAV（WSN株；MOI 1）的Rab5-GFP融合蛋白的显性阴性突变体（Rab5 DN；下面板）。感染4小时后，细胞固定并染色（用针对NP的单克隆抗体进行红色染色，以识别感染细胞；在C组感染的例子中，在PBS中进行感染，以检查DYNA-DEP进入途径）对具有显性阴性和野生型MLCK（MLCK-DN和MLCK-wt）和肌球蛋白II-尾结构域（MyoII-tail）或肌球蛋白II-头结构域（MyoII-head）的GFP融合蛋白进行了类似的实验。在DYNA-DEP（PBS）和DYNA-IND（PBS、10%FCS和80µM发电机）进入条件下感染转基因细胞。（D–F）通过计数>100个细胞来量化结果（实验分三次进行；计算转染细胞、感染细胞、转染细胞和感染细胞）。绘制转染细胞的相对感染率（取同一样本中未转染细胞感染率为100%）。因此，尽管与未转染的细胞（D，黑条）相比，Rab5-wt转染的细胞的感染没有显著减少或增强，但Rab5-DN转染的细胞（D，灰条）在DYNA-DEP和DYNA-IND进入条件下都以较低水平感染。相反，转染MCLK DN（E）或MyoII-head（F）的细胞通过DYNA-IND途径感染的水平明显较低，而DYNA-DEP途径未受影响。不同结构的转染效率如下：RAB5 wt（61%）；RAB5 DN（45%）；MLCK重量（50%）；MLCK DN（49%）；MyII-tail（69%）；MyoII头（55%）。
接下来，用编码显性阴性或野生型Rab5与绿色荧光蛋白融合的质粒转染HeLa细胞（Rab5 DN和Rab5 wt)感染IAV前24小时。Rab5是一种小的GTPase，与多个内胚体隔室相关，对早期内胚体的功能和成熟至关重要。需要通过不同的路线（包括DYNA-DEP和DYNA-IND路线）贩运各种内吞货物[31]IAV的进入需要Rab5[32]一致地，我们发现HeLa细胞表达Rab5 DN（通过GFP荧光鉴定，)通过DYNA-DEP（64%抑制）和DYNA-IND（47%抑制）途径，与转染Rab5 wt的细胞相比，对产生性IAV感染的敏感性要低得多（根据Alexa-488标记NP抗体的间接免疫荧光判断(). 相反，当检测转染MLCK显性阴性突变体（MLCK-DN；与MLCK-wt比较）的细胞中DYNA-DEP和DYNA-IND进入途径的效率时，只有在DYNA-IND条件下IAV感染显著减少(; 53%抑制）。类似地，编码肌球蛋白II MyoII-head的N末端头部结构域的构建物也仅显著影响DYNA-IND的进入(; 92%的抑制作用）。综合结果表明，需要MLCK激活肌球蛋白II的动态肌球蛋白网络对于IAV通过DYNA-IND途径有效进入是必要的。
DYNA-IND IAV进入途径与大胞饮症相似
已经描述了几种与动力学无关的内吞途径[8],[19]其中，大量胞饮作用被证明受血清中存在的生长因子刺激，并依赖肌动蛋白动力学[12]–[14]然而，由于缺乏特异性抑制剂、载体、膜标记物和特征形态学，大胞饮症的研究受到阻碍。阿米洛利和更有效的衍生物EIPA是上皮钠通道（ENaC）以及其他几种钠/氢逆向转运蛋白的抑制剂。EIPA通常被用作一种标志性抑制剂，通过大松果体途径特异性抑制内吞作用[14]然而，EIPA并未抑制IAV的DYNA-DEP进入()，DYNA-IND条目被EIPA完全阻止(). EIPA或dynasore的边际抑制清楚地证明了在10%FCS存在下存在冗余进入途径，而EIPA和dynasoer的组合在Gluc-entry分析中均产生强烈抑制()以及直接VLP进入试验(). 补充的图S1显示其他细胞系，包括人类肺上皮细胞系A549，对EIPA和dynasoir表现出类似的IAV抑制模式。一直以来，病毒产生表现出类似的抑制剂敏感性特征()病毒进入表明我们描述的进入途径导致生产性感染。显然，VLP和病毒颗粒遵循相似的冗余进入途径，在DYNA-DEP和DYNA-IND途径中可区分，后者对EIPA敏感，并依赖肌动球蛋白功能。
DYNA-IND IAV进入途径对EIPA敏感。在Gluc进入测定中检测了80µM EIPA对DYNA-DEP（A）或DYNA-IND（B）进入的影响（HeLa细胞；菌株WSN；MOI 0.5；与EIPA孵育−1小时至2小时p.i.）。绘制了与对照组（0.2%二甲基亚砜）相关的数据。（C） 使用Gluc-entry分析，10%FCS中DYNA-DEP和DYNA-IND进入途径的冗余。显示了在10%FCS的存在下，80µM dynasore（DY；红色）、80µM EIPA（橙色）或这两种抑制剂（DY+EI；绿色）的作用（HeLa细胞；WSN菌株；MOI 0.5）。（D，E）使用VLP进入分析在10%FCS中DYNA-DEP和DYNA-IND进入路径的冗余。在含有10%血清的Optimem中，在80µM dynasore（DY；红色）、80µM-EIPA（橙色）或80µM这两种抑制剂（DY+EI；绿色）存在的情况下进行VLP输入。面板E显示了面板D中显示的FACS直方图的量化数据。（F，G）通过测定接种细胞上清液中的传染性来测量病毒生成，该上清液在PBS（面板E）或PBS+10%FCS（面板F）中存在80µM dynasoir（DY）、80µM-EIPA或80µM这两种抑制剂（DY+EI）。2小时后，用含有10%FCS和10nM BafA1的生长培养基代替培养基。每天24小时采集上清液进行TCID50测定（Y轴）。
大量胞饮作用的一个特征是非选择性地摄入大量胞外溶质[33]因此，将可溶性FITC标记的右旋糖酐（Fdx）摄入相对较大的囊泡（0.3至5µM）通常被用作大松果体的形态标记。使用这个标记，我们发现在培养基中添加10%的FCS略微增加了HeLa细胞对Fdx的摄取(). 值得注意的是，Fdx的分布随着血清的变化而发生变化，从随机分布变为更颗粒状。在高倍镜下和调整到较高强度的颜色设置下，可以看到这些Fdx颗粒没有肌动蛋白染色（由指骨样蛋白染色），表明它们位于小泡腔中（结果未显示）。有趣的是，在IAV（MOI为10）存在下，Fdx进入囊泡的摄取明显增强。在高倍镜下，可以发现病毒颗粒在Fdx负载的囊泡以及这些囊泡外共同定位(). 肌动蛋白的磷灰石染色显示，许多病毒颗粒定位于细胞外周富含肌动蛋白突起处。流式细胞术定量研究Fdx的摄取(). 当在存在10%FCS的情况下添加病毒时，在37°C下观察到向更高Fdx荧光的适度但可重复的转变，而当不添加血清或病毒时，则没有这种转变。这一结果证实了共焦显微镜的观察结果()这表明，与仅FCS相比，FCS和IAV的联合存在增加了Fdx的摄入。在一项对照实验中，在IAV存在的情况下，10%FCS对Fdx的摄取被EIPA特异性抑制，但不被dynasother抑制(图S2，面板B）。相反，作为CME特异性标志物的转铁蛋白摄取受dynasore的影响，但不受EIPA的影响(图S2，面板A）。
通过血清和IAV的联合作用诱导右旋糖酐进入囊泡。（A） 用共聚焦显微镜研究了FITC-右旋糖酐（Fdx；green）在PBS、PBS+10%血清或PBS+10%IAV（MOI=10）中对HeLa细胞的摄取。用NP单克隆抗体荧光染色法检测IAV。当血清存在时，含有Fdx的囊泡结构变得可见，而当血清和IAV同时存在时，这些结构变得更加明显。（B） A组放大显示Fdx和IAV在囊泡结构中的共同定位（箭头所示）。（C） 通过FACS分析定量IAV存在或不存在时的右旋糖酐摄取。如x轴所示，在37°C下，在不存在或存在IAV（菌株WSN；MOI 10）的情况下，在PBS（灰色条）或含有10%FCS（黑色条）的PBS中摄取Fdx 15分钟。Fdx与细胞外结合的背景荧光通过在4°C下进行相同的实验测定（在该温度下不发生内吞作用），并从37°C下获得的平均荧光强度中减去，以测定37°C时内吞的荧光FITC-右旋糖酐的量。绘制了无IAV时PBS中FITC-右旋糖酐摄取的相关数据。
总之，血清诱导Fdx进入大囊泡，加入IAV颗粒可进一步增强Fdx的摄取，IAV颗粒进入后部分与这些囊泡共存。这些结果表明，利用大松果体途径进入IAV，这与观察到的IAV和VLP的血清诱导DYNA-IND进入对EIPA的敏感性一致。
通过大胞饮作用进入IAV取决于PAK1和src
大量胞饮增多与几种病毒的进入有关[12],[14]然而，对抑制剂敏感性的差异表明，不同的病毒可能使用不同形式的大胞饮作用[34],[35]通过使用DYNA-IND进入条件在Gluc进入试验中筛选特异性抑制剂，我们评估了一些信号级联可能参与诱导大胞饮症。血清诱导的大胞饮作用已被证明通过生长因子与跨膜酪氨酸激酶受体结合启动的无数信号级联激活[14],[17],[36],[37]，与中显示的结果一致这些信号级联的一个显著下游效应是p21相关激酶1（PAK1）的激活，PAK1反过来可以激活许多不同的通路，导致肌动蛋白网络重排，最终导致大胞饮的诱导[38].显示20µM IPA3，PAK1的抑制剂[39]，特别抑制IAV的DYNA-IND进入。PAK1对生长因子刺激的反应激活通常涉及Rho小GTPase亚家族成员如CDC42和/或Rac1的上游信号转导[34],[40],[41]或者，活化的CDC42和Rac1可以独立于PAK1诱导肌动蛋白重排[34],[40]–[43]分别与WASP或WAVE家族蛋白直接相互作用[44],[45]然而，CDC42抑制剂（Pirl1[46])，机架1（NSC23766[47])或N-WASP（wiskostatin[48])对IAV的DYNA-IND或DYNA-DEP进入没有显示抑制作用(). 相反，Pirl1和wiskostatin诱导了显著的、浓度依赖性的进入增加。对照痘苗病毒株WR没有观察到这种刺激作用，它通过Rac1依赖的巨噬细胞途径进入细胞[43]()，表明这种影响是IAV特有的。结果表明，IAV的DYNA-IND条目中需要PAK1，不需要CDC42或Rac1激活。生长因子诱导的酪氨酸激酶src活化也与大胞饮症的诱导有关[49]–[51]; 与此观察一致的是src抑制剂PP2[52]特别抑制了IAV的DYNA-IND进入(). 值得注意的是，17-AA-高达霉素，一种伴侣蛋白HSP90的特异性抑制剂[53]也导致了DYNA-IND进入的特定抑制(). HSP90影响许多蛋白质的折叠和活性，但最近证明HSP90直接激活src的催化活性[54]提供了src参与IAV DYNA-IND内吞的另一个迹象。
DYNA-IND IAV进入途径对PAK1、src和HSP90抑制剂敏感。使用Gluc-entry分析检测PAK1（40µM IPA-3）、src（10µM PP2）或HSP90（5µM aa-geldanamycin（GELD））抑制剂对DYNA-DEP（A）或DYNA-IND（B）进入的影响（HeLa细胞；WSN菌株；MOI 0.5；与抑制剂孵育从感染前1小时到每次2小时）。使用Gluc-entry分析检测Rac1抑制剂（80µM和160µM NSC23766（NSC））、Cdc42抑制剂（12.5µM and 3.125µM Pirl1）和N-WASP抑制剂（10µM and5µM wiskostatin（WIS））对DYNA-DEP（C）或DYNA-IND（D）进入的影响（HeLa细胞；菌株WSN；MOI 0.5；感染前1小时用抑制剂预培养）以及牛痘病毒（E）感染。当在t=2时添加Wiskostatin、NSC23766或Pirl1以检查其对复制的影响时，我们观察到Pirl1具有剂量依赖性抑制作用（12 uM时抑制率为60%），而Wiskostain或NSC237660没有影响（结果未显示）。
总之，与其他利用大松果体进入途径的病毒一样，PAK1似乎在IAV进入DYNA-IND中起着关键作用。然而，该途径独立于Rac1或cdc42，但可能需要在PAK1上游和/或下游的src。
讨论
本研究中的数据首次证明，IAV除了通过先前描述的DYNA-DEP经典CME途径外，还可以通过DYNA-IND大胞饮作用进入细胞[1],[2]一些证据表明，我们所鉴定的IAV的DYNA-IND进入途径与大胞饮症相对应。首先，进入途径依赖于血清的存在，血清是众所周知的大胞饮症诱导剂。其次，IAV与可溶性FITC-右旋糖酐（大胞饮症的标志物）在囊泡中共定位。第三，DYNA-IND IAV进入对大胞饮症的标志性抑制剂氨氯衍生物EIPA敏感[14],[55]–[58]第四，IAV进入途径对影响肌动球蛋白动力学的抑制剂或显性阴性突变体敏感。第五，生长因子受体酪氨酸激酶的许多抑制剂及其下游效应物对DYNA-IND IAV进入的特异性抑制也表明参与了大细胞吞噬作用。最后，大胞饮症与dynamin无关[12],[14],[19].
尽管有这一广泛的论据，但大胞饮症引起的病毒进入需要谨慎考虑。IAV进入细胞的DYNA-IND途径的特征与其他病毒（如两种不同株的痘苗病毒和柯萨奇B型病毒）进入大松果体细胞的途径相似，但不完全相同[34],[35]。如所示下面将更详细地讨论，每种病毒使用的大松果体途径都有一些独特的特征。这可能很好地反映了越来越多的观点，即大胞饮作用代表了许多不同的诱导和调节过程，而不是单一的内吞途径[13],[14]大胞饮作用被统称为一种可诱导的内吞作用形式，通过这种内吞作用，液相货物通过由广泛的质膜突起（如板层皱褶、圆形皱褶或收缩泡）产生的无涂层、相对较大和异质的细胞器进行运输[13]如果是DYNA-IND IAV进入，则需要使用电子显微镜进行更广泛的研究，以研究IAV可能相关的膜突起的形态。此外，还需要使用活细胞成像显微镜来表征IAV病毒通过大松果体过程传播的确切行程。这一点尤其重要，因为不同的IAV进入途径可能在内吞途径的某个点上聚合。尽管不太可能，但IAV颗粒与液相葡聚糖的共定位如因此，可能表示多条不同路线会聚后发生的情况。然而，由于缺乏这种内吞过程任何早期步骤的特定膜相关标记物，使用显微镜研究大胞吞作用是复杂的。
表1
IAV的DYNA-IND进入与其他病毒的大松果体细胞进入相似，但不完全相同。
| IAV公司 | IAV公司 | VV公司 | VV公司 | CVB公司 |
| 依赖动力蛋白 | 依赖动力 | WR（额定功率） | IHD-J公司 | |
|
液体吸收
| | | | | |
| 归纳 | 不 | 对 | 对 | 对 | |
| 共刻度化 | 不 | 对 | 对 | | 对 |
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细胞骨架
| | | | | |
| 肌动蛋白 | 不 | 对 | 对 | 对 | |
| 肌球蛋白类 | 不 | 对 | 对 | 对 | |
|
GTP酶
| | | | | |
| 种族1 | 不 | 不 | 对 | 是/否 | 不 |
| Cdc42公司 | 不 | 不 | 是/否 | 对 | |
| 拉布5 | 对 | 对 | 对 | 对 | 对 |
|
激酶类
| | | | | |
| PAK1 | 不 | 对 | 对 | 对 | |
| PI（3）激酶 | 对 | 对 | 对 | 不 | |
| 受体酪氨酸激酶 | 不 | 对 | 对 | 对 | |
| 蛋白激酶C | 是/否 | 对 | 对 | 对 | 对 |
| SFK（src家族激酶） | 不 | 对 | | | 对 |
|
其他
| | | | | |
| Na+/H+交换 | 不 | 对 | 对 | 对 | 对 |
| 酸化作用 | 对 | 对 | 对 | 不 | 不 |
| 动力蛋白2 | 对 | 不 | 不 | 不 | 不 |
一个模型()根据我们的结果解释了IAV大松果体进入途径中涉及的关键步骤，下文将对此进行更详细的描述。
通过大胞饮作用进入IAV的模型。该模型总结了化合物对非动力学IAV进入的抑制（红框）或刺激（蓝框）效应。显性阴性突变体过度表达的影响由红色方框表示。该途径需要在进入培养基中存在血清因子，导致右旋糖酐的摄取增强，并与IAV在大囊泡（绿盒）中共存。我们假设血清因子和/或IAV与受体酪氨酸激酶（RTKs）的相互作用是诱导大胞饮症的主要信号。在不同的细胞系中，许多RTK已被证明参与了这一过程。值得注意的是，最近公布的IAV感染全基因组siRNA筛查确定FGF受体是流感病毒复制所需的宿主因子[22]Rho家族GTPases CDC42和/或Rac1的激活已被证明在许多情况下对导致大胞饮症的信号转导至关重要[13],[14]但在IAV进入的情况下，抑制剂没有作用或具有刺激性。Rho家族GTPases的下游效应器包括支架蛋白（如N-WASP和WAVE）和蛋白激酶（如PAK1）。然而，IAV的大松果体进入似乎需要Rho家族GTPase非依赖性PAK1激活机制。此外，可被RTK直接激活的src家族激酶也发挥作用。PAK1和src以前通过其对肌动球蛋白动力学变化的影响与大松果体的激活有关，这一过程对任何形式的大松果体形成至关重要[13],[14]除了含N-WASP或WAVE的大分子组合外，其他肌动蛋白结合蛋白也可以引起这种变化（例如，皮质素，可被src激活[81])从而诱导形成一种不同的质膜突起，从而形成大松果体。除了对质膜突起的形成和随后的大松果体形成产生影响外，抑制剂还可以影响可能依赖于肌动蛋白的大松果体的下游运输和成熟，但这在方案中没有描述。
通过控制接种条件，我们能够实验性地将IAV进入DYNA-DEP和DYNA-IND途径。DYNA-IND路线要求入口分析培养基中存在10%的FCS。此前，通过对表达dynamin 2的诱导显性负突变体的细胞系的实验，得出了IAV对DYNA-DEP进入途径的严格依赖性[59]在那项研究中，以及在IAV的其他进入性研究中，进入是在含有2%血清或BSA的DMEM中进行的。在我们手中也有2.5%血清()或0.2%BSA（结果未显示）不足以允许DYNA-IND进入。我们目前正在调查哪种血清成分对观察到的IAV进入影响负责。FCS的透析（MW截止值>10 kDa）未影响其诱导DYNA-IND内吞的能力（结果未显示），表明低分子量溶质对观察到的效果不起作用。
我们对DYNA-DEP和血清诱导型DYNA-IND进入途径的证据基于药理学（dynasore，一种高度特异的动力学抑制剂）以及遗传（针对动力学蛋白2的siRNA）工具的使用，排除了dynasore的抑制作用可能是由于血清成分对抑制剂的吸收。尽管dynasore导致DYNA-DEP进入的抑制率接近100%，但在siRNA诱导的动力蛋白2沉默时仅观察到65%的抑制，这表明沉默48小时后保留的动力蛋白2的残余水平仍然支持低水平的DYNA-DEP进入(). 可逆抑制剂，如dynasore[60]为描述IAV进入途径提供了一个主要优势。它们可以在有限的时间内应用，从而防止细胞的二次适应性效应，这种效应可能是由于基因产物通过siRNA干扰等遗传方法长期下调而产生的。通过病毒诱导荧光素酶报告子表达定量的病毒进入分析以及允许直接分析膜融合介导的进入步骤的VLP进入分析，一致确定了这两种进入途径。HA严格优先与α2-3连接的唾液酸结合（来自IAV-WSN；我们未发表的数据），HA也与α2-6连接的唾液酸结合（来自1918年IAV[61])VLP进入试验表明，这两种途径可被不同特异性的HA利用，因此可能与禽和人IAV感染有关。一致地，在禽DF1细胞和人肺上皮癌细胞系A549中都观察到血清诱导的DYNA-IND进入().
我们的定量分析发现DYNA-DEP和DYNA-IND IAV进入途径完全冗余。在有血清存在的情况下，联合使用dynasore（抑制DYNA-DEP进入）和EIPA（抑制DYA-IND进入）可完全取消进入，而单独使用两种药物均无效。EIPA是一种质膜Na+/H+交换器的抑制剂，已被证明总是抑制大胞饮作用[14],[55]–[58]由于其他内吞途径通常不受影响，EIPA被认为是大胞饮症的标志性抑制剂[14]，尽管EIPA的结果应该慎重考虑，只要其对大胞饮作用的机制解释尚不完全清楚[62]偶尔，单用dynasore可观察到中度的二到三倍抑制作用（结果未显示），表明血清诱导进入途径的能力有点可变，可能取决于血清质量的微小变化和一些因素，如已报道的影响病毒感染的微孔中的细胞分布[63]以前，定量活细胞成像已经显示出CME的使用冗余以及进入IAV的氯氰菊酯非依赖途径[4]两种途径在同一样本中同时有效，CME的特定下调不影响进入事件的总数。
为了响应特定的细胞外信号（如血清诱导），肌动蛋白网络发生变化，导致形成大肌体所需的膜突起[13]抑制肌动蛋白聚合（细胞松弛素B和D）、解聚（茉莉糖苷内酯）或固存可溶性肌动蛋白（latrunculin A）的化合物都能特异性抑制DYNA-IND IAV的进入。此外，肌球蛋白II ATP酶活性的特异性抑制剂（Blebbistatin）和肌球蛋白IIA重链显性阴性突变体的表达确定了肌球蛋白Ⅱ活性的需求。此外，MLCK抑制剂ML-7和ML-9的抑制作用以及表达的MLCK显性阴性突变体的类似作用表明，通过MLCK的作用，通过肌球蛋白轻链磷酸化来调节肌球蛋白II的活性。最近，据报道，在IAV进入过程中肌动蛋白细胞骨架的功能对于进入极化上皮细胞是必需的，但对于进入非极化细胞则不是必需的[64]当使用该论文中使用的低血清条件（2%FCS）时，我们只观察到DYNA-DEP进入，不受肌动蛋白动力学抑制剂的影响。也许，极化细胞允许DYNA-IND在低血清浓度下进入。
肌动蛋白网络动力学的变化可以导致大松果体的形成，这可以由一些信号级联触发。肌动蛋白动力学是由生长因子受体酪氨酸激酶被其各自的生长因子配体激活而诱导的，这些配体通常存在于血清中[12]–[14],[17],[36],[37]将生长因子受体酪氨酸激酶的激活与肌动蛋白重塑和大胞饮作用联系起来的信号转导级联反应才刚刚开始被揭示。PAK1抑制剂IPA3对IAV进入DYNA-IND的特异性抑制为这些级联反应的参与提供了证据。PAK1是一种调节肌动蛋白网络动力学的关键丝氨酸/苏氨酸激酶，但它在几个内吞途径以及许多其他细胞过程中的关键功能并不使其成为一个非常特异的标记物[65]尽管如此，大量胞饮作用一直被证明需要激活PAK1，无论是在该过程的诱导还是在大量胞饮体的进一步下游贩运事件中[13],[14].
PAK1的生长因子依赖性激活通常被证明依赖于小GTPases Rac1或cdc42的上游激活[34],[40],[41]最近研究表明，不同株痘苗病毒通过激活Rac1或cdc42，通过大胞饮作用诱导其摄取[34]Rac1的激活与通过肌动蛋白网络介导的跛足和/或圆形皱褶的形成诱导大胞饮作用有关，而cdc42最常见于丝状足的形成[44]然而，不能证明Rac1抑制剂NSC23766或cdc42抑制剂pirl1对IAV进入的抑制作用。值得注意的是，cdc42抑制剂pirl1增强了IAV的进入，wiskostatin也观察到了类似的作用，它是一种N-WASP抑制剂，直接作用于cdc42下游，作为激活肌动蛋白聚合所需的支架复合物，导致丝状伪足的形成。类似地，柯萨奇B病毒所采取的巨噬细胞样进入途径也被证明需要独立于Rac1激活的PAK1活性[35]。需要直接检查PAK1激活的幅度和时间，以进一步了解这一复杂途径的参与情况。PAK1依赖机制诱导的大胞饮作用与细胞膜皱褶有关[12],[14],[15],[37]指骨样蛋白对肌动蛋白染色增强的亚膜区的识别被解释为皱褶的证据。共聚焦显微镜并没有在和图S2需要通过生命细胞成像技术进行深入研究。
与我们的观察一致，IAV的DYNA-IND进入被PP2抑制，PP2是src家族激酶的抑制剂，非受体酪氨酸激酶c-src已被证明通过一种独立于Rac1或cdc42的机制在诱导大胞饮症中起关键信号中间产物的作用[49]–[51]c-src对肌动蛋白网络的下游作用，除其他外，通过c-src对cortactin的磷酸化进行，从而加速大嵌合体的形成[50].C-src已被证明与大松果体有关[49],[51]而c-src激酶活性对于EGF刺激HeLa细胞后的大胞吞作用是必需的[49]最近发现HSP90与c-src的相互作用可诱导c-src激酶活性[54]此外，HSP90已被证明与大胞饮小体相关，而其特异性抑制剂格尔德霉素可减少大胞饮作用前的膜皱褶[66]因此，AA-geldanamcin通过大胞饮作用抑制IAV进入可能与HSP90对c-src的影响密切相关。
如上所述，IAV的DYNA-IND进入途径与大胞吞作用的内吞途径有许多相同的特征。IAV颗粒和右旋糖酐在存在FCS的大囊泡中共定位的观察结果证实了这一点。最近有报道称，几种病毒通过大胞饮作用进入细胞[12],[14]除了PAK1激活的要求、肌动蛋白动力学和动力学的独立性等共同因素外，还描述了病毒的具体细节[34],[35](). 在一定程度上，这些可能是实验条件（如测试的细胞类型）差异的原因，但诱导和执行大胞饮作用的分子机制可能存在多样性，并被病毒利用。而痘苗病毒能够触发其自身的大松果体细胞摄取[34],[43]，我们描述了一种在血清成分激活的条件下运行的大胞饮途径。然而，这并不排除病毒-宿主-细胞相互作用诱导的信号传导，例如IAV存在时FITC-右旋糖酐摄取显著增加。血清成分和病毒可能需要共刺激信号，这给通过DYNA-IND途径分析IAV进入增加了一层复杂性。
流感病毒通过攻击呼吸道上皮细胞引起呼吸道感染。这些表面覆盖着一层粘液层，该粘液层由各种小溶质和糖蛋白组成，这些糖蛋白来自杯状细胞[67]这种半流体层反过来调节底层细胞并决定其生理状态，包括其吸收和分泌途径的活动。重要的是要确定DYNA-DEP和DYNA-IND IAV进入途径在呼吸道主要条件下的操作程度。通过应用蛋白质组学方法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）的蛋白质组成，目前关于覆盖呼吸上皮的液体蛋白质组成的知识正在迅速扩展。这些研究扩展了先前的观点，即BALF在成分上与血清高度相似。例如，正如血清蛋白质组一样，白蛋白、免疫球蛋白、转移蛋白、α1-抗胰蛋白酶和结合珠蛋白占BALF蛋白质组总蛋白质质量的85%以上，在血清和BALF中还发现了许多其他蛋白质，包括可以与生长因子受体酪氨酸激酶结合的生长因子[68]–[70]因此，与血清一样，BALF可能含有可激活信号通路的蛋白因子，这些信号通路对诱导DYNA-IND进入IAV至关重要。与此一致，大胞饮作用被描述为流感嗜血杆菌成原代人支气管上皮细胞[71]尽管信号传导过程中涉及的因素尚未确定。
IAV除了感染呼吸道外，还可以引起涉及多个器官的全身感染。这主要是在鸟类感染中进行的研究[72],[73]或感染人源性H1N1或H3N2 IAV的小鼠[74]但关于人类感染的记录很少，到目前为止可能被低估了。显然，在IAV潜在的系统传播过程中，我们在这里证明的能够使用替代进入途径的富含血清的条件将被遇到，并可能导致这种传播。
材料和方法
细胞和病毒
MDCK、A549、DF-1和HeLa细胞保存在含有10%（v/v）胎牛血清（FCS；Bodinco B.v.）、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的完整Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Lonza，Biowitaker）中。中国仓鼠E36细胞在添加10%（v/v）FCS、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的α-最小必需培养基（Gibco）中保持37°C。细胞每周传代两次。流感A/WSN/33（H1N1）（IAV-WSN）在MDCK细胞中生长。简而言之，约70%的融合MDCK细胞感染了IAV-WSN，MOI为0.02。在37°C下孵育48小时后收获上清液，并通过离心法去除细胞碎片（2000 rpm下10分钟）。病毒储存在−80°C下，通过测量TCID测定病毒滴度50在HeLa细胞上。IAV-WSN荧光素酶假病毒（WSN-Ren）系统之前已有描述[27]简而言之，WSN-Ren伪病毒包含HA片段，其中HA编码区被替换为雷尼利亚萤光素酶。伪病毒是在稳定表达IAV-WSN HA的MDCK细胞系中产生的。WR-LUC是一种编码痘苗病毒（WR株）的萤火虫荧光素酶[75].VSV-FL是一种萤火虫荧光素酶，编码VSV病毒[76].
化学制品
巴菲尔霉素A1（BafA1）、达纳霉素、细胞松弛素D、细胞松弛蛋白B、布利司他丁、17-AA-高锰酸钾、ML-7、ML-9、PP-2、5-（N-乙基-N-异丙基）氨氯化物（EIPA）、IPA-3（均从Sigma-Aldrich获得）、Latrunculin A（Enzo）、茉莉花素内酯、wiskostatin、NSC23766（均从Calbiochem获得）和pirl1（Chembridge）的库存在二甲基亚砜（DMSO）中制备。所有库存均储存在−20°C下。从Biomol（2832A[V2.2]）中获得了由80个激酶抑制剂组成的激酶抑制剂库。
神经氨酸酶治疗
HeLa细胞（96周板中10000个细胞/孔）用2 mUnits的霍乱弧菌神经氨酸酶（罗氏）在50µl磷酸盐缓冲盐水（PBS）中浸泡2小时。用PBS细胞洗涤后，按说明感染IAV。
类病毒颗粒分析
病毒样颗粒（VLP）的产生如下所述[26]简而言之，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染293T细胞，其中pCAGGS-BlaM1（编码与流感基质蛋白-1融合的β-内酰胺酶报告蛋白）、pCAGGS-HA（编码源自a/NewYork/1/1918或IAV-WSN的HA）和pCAGG-NA（编码IAV神经氨酸酶[NA]源自A/BrevigMission/1/18或IAV-WSN）并在OptiMEM中维护。转染72小时后收集上清液，离心去除碎片。VLP用于细胞接种，无需进一步浓缩。用胰蛋白酶/TPCK在37°C下培养VLP 30分钟，以激活HA。如图所示，用抑制剂预处理细胞后，用250 ul VLP接种生长在24孔板中接近汇合处的MDCK或HeLa细胞。感染通过在4°C下以1500 rpm离心90分钟同步进行，并通过在没有或存在10%FCS和抑制剂的情况下在37°C下进一步培养2小时来进行，如图所示。如前所述检测β-内酰胺酶活性[25]通过用CCF2-AM底物（InVitrogen）加载细胞并随后在LSRII流式细胞仪（Becton Dickinson）上通过流式细胞术进行分析。通常使用FlowJo 8.5.2软件收集和分析10000个事件。
荧光素酶分析
报告构建物pHH-Gluc来自质粒pHH-Fluc[22]将萤火虫荧光素酶编码区替换为高斯（Gaussia）pGluc-basic（新英格兰生物实验室）的荧光素酶编码区。使用Quikchange XL定点突变试剂盒（Stratagene）和寡核苷酸Spe4262将独特的SpeI和XbaI限制性位点引入pHH Fluc(5-′GCCTTTTTTTATGTTTGGCACTAGTCATTTTACCGAGTCACTCAG)，Spe4263(5′-CTGAGTGACATCGGTAAAATGACTAGTCCAAAAAACATAAAGGC)，Xba4260(5′-GTATTTTTTTACAATCTAGACTTCCCCCCTTCTTGG)和Xba4261(CCAAGAGGGCGAAAGTCTAGATTGTAAAAAAATAC公司). SpeI位点是通过pGluc-basic中的定点突变直接在启动密码子之后引入的高斯（Gaussia）荧光素酶编码序列。pGluc碱性的独特SpeI–XbaI片段随后被克隆到pHH Fluc的SpeI–XbaI位点，产生质粒pHH Gluc。
按照制造商的方案，将细胞以10000个细胞/孔的密度接种在96周的平板中，第二天使用Lipofectamine 2000（InVitrogen）转染10 ng pHH-Gluc。24小时后，用抑制剂处理转染细胞，并按指示进行感染。在p.i.16小时时，使用雷尼利亚荧光素酶测定系统（Promega）根据制造商的说明，使用Berthold Centro LB 960平板光度计测定相对光单位（RLU）。使用WR-LUC和VSV-FL在完全的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）（Lonza，Biowitaker）中以2的MOI接种HeLa细胞（10000个细胞/孔）。7小时后，使用SteadyGlo分析试剂盒（Promega）检测荧光素酶活性。添加10%（v/v）FCS不会改变两种病毒的感染水平。
共焦免疫荧光显微镜
用3.7%多聚甲醛（PFA）将细胞固定在PBS中，然后用0.1%Triton-X-100渗透到PBS中。用正常山羊血清封闭后，用针对核蛋白（NP）的单克隆抗体（HB-65；由Ben Peeters博士善意提供）将IAV感染的细胞培养1 h。清洗后，将细胞与1∶400稀释的Alexa Fluor 488-或568-标记的山羊抗鼠IgG（分子探针）二级抗体孵育1小时。随后用TOPRO-3对细胞核进行染色，在三个清洗步骤后，将盖玻片安装在FluorSave（Calbiochem）中。肌动蛋白用Alexa Fluor 633标记的阴茎肽染色。免疫荧光染色采用激光共聚焦扫描显微镜（Leica TCS SP2）进行分析。FITC、GFP或Alexa Fluor 488在488 nm处激发，Alexa Fluor 568在568 nm处激励，TOPRO-3在633 nm处激发。
FITC-右旋糖酐摄取
HeLa细胞生长在玻璃盖玻片上的24孔板中（50000个细胞/孔）。在FITC-右旋糖酐摄取细胞在PBS中无血清培养2小时之前。FITC-葡聚糖（MW70000，Sigma-Aldrich）与HeLa细胞（最终浓度为0.5 mg/ml）在500µl PBS中或在不存在或存在IAV（WSN株；MOI 10株；在37°C下，通过15至30%蔗糖梯度和50%蔗糖垫离心浓缩和纯化。15分钟后，用PBS在4°C下清洗细胞4次，用3.7%PFA固定在PBS中，然后用0.1%Triton-X-100渗透到PBS中。用上述共焦显微镜对载玻片进行染色以进行检查。定量FITC-右旋糖酐摄取1.5×105在FITC葡聚糖（1mg/ml）存在下，用体积为1ml的悬浮液中的IAV-WSN（MOI10）感染HeLa细胞。感染在PBS（含2%BSA以减少FITC-右旋糖酐的非特异性结合）或含10%FCS的PBS（37℃或4℃）中进行15分钟（在没有内吞作用的情况下，控制FITC-左旋糖酐与细胞的结合）。同时分析模拟感染样品。加入3ml冰镇PBS，然后用冷PBS清洗三次，并用3.7%PFA固定，即可终止感染。用FACS分析20000个细胞，结果表示为相对于PBS模拟感染摄取的平均荧光（减去4°C下获得的背景荧光后）。
dynasore和EIPA对右旋糖酐和转铁蛋白摄取的影响
将HeLa细胞（生长在玻璃盖玻片上）与50µg/ml Alexa633标记的Transferin（InVitrogen）在PBS中在4°C下孵育1小时。1小时后，用PBS或PBS替换培养基，PBS补充含有IAV（菌株WSN；MOI 10）和0.5 mg/ml FITC-Dextran（Sigma；70 kDa）的10%FCS，并将细胞转移到37°C下15分钟。15分钟后，如上所述对细胞进行固定和染色，并通过共聚焦显微镜进行检查。
免疫细胞化学
细胞用3.7%PFA固定在PBS中，然后用0.1%Triton-X-100渗透到PBS中。使用Vector Laboratories的AEC底物试剂盒观察过氧化物酶。用光场显微镜检测IAV阳性细胞。
Dynamin 2击倒
从Ambion Inc（15581（dynamin 2 siRNA 1）和146559（Dynaman 2 siRNA 2））获得了两个siRNA双链，靶向dynamin 2编码序列中的不同位点。将打乱的siRNA（Ambion Inc.）作为转染过程的非特异性效应的对照，并用于归一化。在96周板（6000个细胞/孔）中接种一天后，使用寡聚体胺（Invitrogen）将最终浓度为10 nM siRNA转染HeLa细胞。转染后48 h，将WSN-Ren假病毒（MOI0.5）接种在含有10%FCS的PBS或PBS中。感染2小时后，用含有10 nM BafA1的完整生长培养基替换进入培养基，以防止进一步进入。感染后16小时细胞内雷尼利亚如上所述测定荧光素酶的表达。每个siRNA实验一式三份进行。通过执行Wst-1细胞活性测定（Roche），细胞活性未受到影响。通过定量RT-PCR对dynamin2 mRNA水平进行功能性敲除。使用TaqMan基因表达检测DNM2（Hs00191900_m1，Ambion），并使用18S RNA（Hs03928985_g1，Ambin）作为标准化对照。使用比较Ct-method对结果进行量化[77]使用多克隆山羊抗动力蛋白2 C18（Santa-Cruz SC-6400）通过免疫印迹法测定动力蛋白2蛋白水平的降低。使用抗α-微管蛋白单克隆抗体（DM1A，Sigma T9026）检测微管蛋白以进行归一化。结果通过动态蛋白2和微管蛋白信号的密度扫描进行量化.
显性消极结构
HeLa细胞在玻璃盖玻片（50000个细胞/孔）上的24孔板中生长24小时。然后用编码野生型或显性阴性（DN）人类MLCK与GFP融合的质粒转染细胞（1µg DNA和上述脂质体2000）[78]、野生型或DN Rab5与GFP融合[79]，或融合到GFP的MyoII-tail或MyoII-head结构域[80]转染后24小时，用IAV-WSN（MOI 1）在PBS或含有10%FCS和80µM dynasol的PBS中接种细胞。感染细胞固定4小时后，用上述共焦显微镜进行染色检查。
统计分析
采用未配对学生t检验确定统计显著性差异。文本中“显著”一词的使用是指比较p<0.05的数值。
