淋巴细胞在体细胞中是独特的，因为它们通过程序化DSB形成来诱导抗原受体基因重排1抗原受体的初始组装涉及V（D）J重组，这是一个RAG重组酶裂解重组信号序列（RSS）以产生发夹编码端和钝信号端的过程。Ku70–Ku80异二聚体和其他NHEJ因子对于连接RAG生成的DSB至关重要，它们在修复DNA损伤剂引起的DSB中也起着关键作用2.
V（D）J重组的错误与在一些淋巴恶性肿瘤中发现的染色体相互易位有关，包括滤泡和套细胞淋巴瘤，以及T细胞白血病三,4在某些情况下，RAG重组酶可能在抗原受体基因的RSS和另一条参与染色体上的RSS样序列之间进行染色体间重组。在其他易位中，第二条染色体上的DSB可能通过其他方式形成。为了确定RAG重组酶产生的DSB是否能与非RAG生成的DSB一起参与易位，我们修改了先前开发的报告基因pCr15，其中由I-Sce公司I内切酶导致易位5该报告人由新霉素磷酸转移酶基因组成(新)在内含子处分裂，靶向小鼠胚胎干细胞中的17号和14号染色体(). 每条染色体上的内含子片段由I划分-Sce公司我定位，这样我的乳沟-Sce公司我随后将17号染色体和14号染色体连接起来，生成一个衍生染色体der（17），它包含17号染色体的着丝粒部分和14号染色单体的端粒部分，同时形成一个功能性染色体新基因。在名为pCEr15（CE，编码端）的新报告人中，染色体17I-Sce公司我的网站被RSS元素替换(). pCEr15细胞中的瞬时RAG1–RAG2表达在这些RSS元件处诱导≥5%的重排(和).
DSB形成和NHEJ修复后诱发染色体易位。(一)易位报告人pCr15。I处的DSB地层-Sce公司染色体17和14上的I位点，其次是染色体间NHEJ，导致染色体易位和新+如果连接发生在2.7kb内，则der（17）上的基因新的内含子。非生理盐水I-Sce公司I位点以相反方向存在，因此劈理导致非重叠的四基3#悬垂。(b条)易位报告基因pCEr15。RAG-重组酶裂解在17号染色体和I号染色体上产生发夹末端-Sce公司我在I-Sce公司第14号染色体上的I位点，随后是染色体间NHEJ，导致染色体易位，类似于pCr15。圆圈，发夹末端；白色三角形，12-RSS；黑色三角形，23-RSS。(c（c）)V（D）J复合保时捷中国RAG-重组酶表达后的等位基因。与野生型细胞相比，V（D）J重组在Ku70系列−/−但通过Ku70表达恢复。V（D）J重组频率通过与稀释含有pCEr15（8 kb）和pCr15（4.5 kb）报告物的细胞中已知数量的DNA建立的标准曲线进行比较来量化。(d日)荧光就地杂交。亲代pCEr15细胞有正常的染色体14（绿色）和17（红色），而新+克隆，作为Ku70系列−/−克隆t1也有衍生染色体（黄色箭头）。(e（电子）)来自pCEr15报告者的易位连接。野生型和Ku70系列−/−单元格以相同的颜色高亮显示。未经测序证实的缺失是基于Southern印迹法的估计。发夹末端（半圆），I-Sce公司标记了I位点（大写字母）、微同源性（下划线）、插入（红色）和P核苷酸（蓝色）。发夹开口处可能存在的微同源物用双下划线标出。长插入包括17号染色体RSS–间隔序列（野生型der（14）t1；Ku70系列−/−der（14）t7，der（17）t29；参见补充信息，图1b）和位于DSB几千个碱基内的14号染色体序列，这些序列可能已经模板化（野生型der（17）t15；Ku70系列−/−der（17）t1，t18，t20）。也可以使用较小的模板插入（<5 bp）（例如，野生型der（14）t10）。(（f）)确认Ku70系列亲本（P）和多易位克隆（t）的基因型+Ku，Ku70瞬时互补。
表1
I引起的易位-Sce公司I内切酶加或不加RAG重组酶。
| 构造 | 基因型 | 表达式向量 | 翻译（×10−7) | 对价值 | V（D）J复合（×10−2) | 对价值 | 易位与V（D）J重组的比率（×10−7)e（电子） |
|---|
| PCr15型 | 重量 | 矢量 | <0.1 | | | | |
| | 我-Sce公司我 | 287.1 ± 90.5 | | | | |
| | 我-Sce公司I+库70 | 363. 3 ±93. 三 | 0.24一 | | | |
| PCr15型 | Ku70系列−/− | 矢量 | <0.1 | | | | |
| | 我-Sce公司我 | 789.0 ± 221.6 | <0.001一 | | | |
| | 我-Sce公司I+Ku70 | 323.3 ± 119.7 | 0.32一 | | | |
| 第15页 | 重量 | RAG公司 | <0.03 | <0.001b条 | 5.43± 1.02 | | |
| | 我-Sce公司我 | <0.03 | <0.001b条 | 0 | <0.001d日 | |
| | RAG+I型-Sce公司我 | 0.23 ± 0.16 | | 未注明日期。 | | 4.24 |
| pCEr15型 | Ku70系列−/− | RAG公司 | <0.03 | <0.001c（c） | 0.66 ± 0.73 | <0.001d日 | |
| | 我-Sce公司我 | <0.03 | <0.001c（c） | 0 | | |
| | RAG+Ku70 | 未注明日期。 | | 5.86 ± 1.51 | 0.58d日 | |
| | RAG+I型-Sce公司我 | 0.58 ± 0.34 | <0.001b条 | 未注明日期。 | | 87.9 |
| | RAG+I型-Sce公司I+Ku70 | 0.22 ±0.16 | 0.93b条 | 未注明日期。 | | 3.75 |
为了确定17号染色体上的编码是否可以与I结合-Sce公司I在第14号染色体上结束，导致易位RAG1–RAG2和I-Sce公司我在pCEr15细胞中共存。新+以0.23×10的频率从pCEr15细胞中回收克隆−7(). RAG1–RAG2或I表达后未获得克隆-Sce公司仅I（<0.03×10−7;对<0.001). 荧光就地使用17号染色体和14号染色体的杂交（FISH）证实了所有11个染色体中的预期序列（17）新+检查的克隆(). 有9个克隆具有倒数der（14）染色体，但有趣的是，其中一个克隆具有der（6）t（6；17）（数据未显示）。
RAG–I后pCEr15细胞中的易位频率降低约1000倍-Sce公司I后I相对于pCr15细胞分裂-Sce公司I乳沟(). 据估计，RAG生成的DSB的效率仅为我的几倍-Sce公司I生成的DSB(数据未显示），DSB形成减少只能部分解释易位频率显著降低的原因。可能，RAG重组酶促进了V（D）J重组的连接步骤，以防止DNA末端在其他途径中的误用6另一种解释是，17号染色体上的发夹DNA末端受到保护，不参与易位。然而，使用与pCEr15设计相似的信号端报告子的实验表明，钝信号端也很少参与易位（D.M.W.和M.J.，未发表的观察结果）。我们还研究了两名与pCEr15类似的记者，他们在两个方向上都包含一个12-RSS，而不是成对的RSS。两名报告者均未发现移位（<0.06×10−7,对= 0.01; 未示出的数据）来指示单个RSS的不频繁使用。
Der（17）和Der（14）连接是从许多新+克隆来自pCEr15报告子。正如之前对pCr15报告者和患者致癌易位的观察5，易位连接显示了NHEJ的典型特征，包括缺失、插入和微同源使用(). 在一些pCEr15连接处观察到的一个新特征是核苷酸添加与发夹开放（P核苷酸）一致。总的来说，RAG末端比I末端更可能保持完好-Sce公司I结束（25人中有14人（56%），15人中有1人（4%），对= 0.0001).
由于V（D）J重组高度依赖于Ku70–Ku80依赖的NHEJ途径，我们检测了涉及RAG1–RAG2的易位是否也使用该途径。pCEr15记者被介绍到Ku70系列−/−细胞7和RAG1–RAG2和I-Sce公司我在这些细胞中共存。令人惊讶的是，没有降低频率，新+克隆的恢复频率是年的2.5倍Ku70系列−/−电池（0.58×10−7)与野生型细胞相比(对<0.001;). FISH实验证实了所有八条染色体中预期的der（17）和der（14）染色体新+检查的克隆(以及未示出的数据）。证实Ku70抑制易位，Ku70的异位表达Ku70系列−/−细胞移位减少到野生型水平（0.22×10−7). 如预期，V（D）J复合保时捷中国等位基因在Ku70系列−/−单元格(和)排除了Ku70不参与该等位基因正常连接事件的可能性。V（D）J重组在Ku70系列−/−细胞9比观察到的8–9倍减少最有可能是由于编码端的特定序列上下文，这些编码端在发夹打开后有可能进行末端退火（参见补充信息，). 总的来说，Ku70缺乏时易位与V（D）J重组的比率高出20倍以上()，这意味着当不存在Ku70时，通常被引导到V（D）J重组中的一部分末端参与易位。
在含有pCr15报告基因（7.89×10）的细胞中也观察到Ku70抑制易位−5在里面Ku70系列−/−细胞与2.87×10−5野生型细胞；对<0.001); Ku70异位表达Ku70系列−/−细胞移位减少到野生型水平（3.23×10−5). 这些结果表明，Ku70很可能存在于Ku70–Ku80异源二聚体中，它抑制异源染色体DNA末端之间的NHEJ，无论末端来自核酸内切酶还是RAG裂解。
Ku70系列−/−pCEr15断点连接新+克隆的特征(). 总的来说，从Ku70系列−/−克隆与野生型细胞的克隆相似，两种基因型有一些相同的连接。与野生型细胞一样，大多数（但并非全部）连接处存在微同源性。注意到一些差异达到了统计显著性。较长的缺失（>100个碱基对）更常见于Ku70系列−/−克隆比野生型克隆（46.7%比21.4%，对=0.03），编码结束于Ku70系列−/−与野生型克隆的编码端相比，克隆不太可能保持完整（25%对56%，对= 0.03). 因此，Ku70抑制易位形成，但仍能影响易位断点处的末端修饰。有趣的是，四个克隆的连接处保留了RSS元素，这意味着在单个RSS处出现分裂，尽管也可能存在其他机制（参见补充信息，). 断点连接Ku70系列−/−pCr15克隆给出了类似的结果（参见补充信息，).
NHEJ的Ku依赖性途径最初是通过其在V（D）J重组和抗辐射方面的双重要求来表征的。然而，NHEJ可以发生在缺乏典型NHEJ通路成分的细胞中，两者都可以修复质粒中的DSB8,9并在p53缺陷小鼠的B细胞前体中产生易位10,11。我们的结果表明，非经典NHEJ途径是易位形成的主要介质-这些途径是否涉及经典途径的某些成分，或独立于这些成分，尚待确定。
总之，由RAG重组酶诱导的DSB可以与另一染色体上的并发DSB一起参与，从而导致相互易位，这支持了一些淋巴恶性肿瘤易位形成的模型4尽管易位涉及DSB修复的NHEJ途径，但标准NHEJ通路成分Ku70不是必需的，而是抑制易位形成。最近的一项研究提供了证据，证明Ku70–Ku80可能限制DNA末端的流动性12这表明通常在染色体内修复的DNA末端在Ku-deficient细胞中变得可移动，并且能够参与染色体间修复。染色体内修复和染色体间修复之间不同的修复因子使用为易位连接和单一DSB修复连接之间的差异提供了解释5.
